МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СОСТАВЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ LACTOBACILUS PLANTARUM 8P-А3 Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Medical & pharmaceutical

JOU RNAL "PU LSE "

https://clinical-journal.ru

2022. Vol. 24. № 6

E-ISSN 2686-6838

RESEARCH ARTICLE УДК 543.2 Corresponding Author: Hohryakova Maria Dmitrievna -third-year graduate student, Perm state pharmaceutical Academy Perm E-mail: skakodub1997@mail.ru

© Shilova E.G., Pustobaeva M.S., Krasilnikova A.N., Hohryakova M.D. - 2022 ***| Accepted: 23.06.2022

Doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-6-89-93

МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СОСТАВЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ LACTOBACILUS PLANTARUM 8P-А3

Шилова1 Е.Г., Пустобаева2 М.С., Красильникова1 А.Н., Хохрякова1 М.Д.

1 ФГБОУ ВО «Пермская государственная фармацевтическая академия», г. Пермь, Российская Федерация

2 Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения, Отдел ХАМИ, г. Пермь, Российская Федерация

Аннотация. Жизнедеятельность человека в современных условиях характеризуется постоянным влиянием неблагоприятных факторов внешней среды, затрагивающих нейропсихологические, физиологические и метаболические параметры организма. Компенсаторные возможности каждого индивидуума, в том числе иммунное состояние, в значительной степени определяется состоянием микробиоты.

В практической микробиотологии актуальны исследования в сфере разработки нового поколения лекарственных средств, предназначенных для поддержания и восстановления нормофлоры, в том числе принципиально новых пробиотиков - метабиотиков, создаваемых на основе микробных экзометаболитов. С учетом востребованности метабиотиков на фармацевтическом рынке для конструирования таких препаратов был предложен экзометаболитный комплекс, полученный методом ультрафильтрации культуральной жидкости пробиотического штамма, используемого в производстве лактобактерина. Известно, что, к весьма значительным составляющим метаболитных комплексов лактобактерий наряду с бактериоцинами относятся карбоновые кислоты. В связи с этим, целью данной работы являлся выбор оптимального физико-химического метода совместного определения карбоновых кислот на модели комплекса экзометаболитов пробиотической культуры Ьа^оЬасйш р1аЫатит 8Р-А3.

В результате проведенных исследований установлено, что оптимальным физико-химическим методом идентификации карбоновых кислот в составе метаболитного комплекса является метод капиллярного зонного электрофореза. В составе метаболитов идентифицированы такие значимые кислоты, как молочная (217,7 г/л), лимонная и уксусная (29,6 и 10,2 г/л). Отмечена простота и экспресность данного метода в сочетании его высокой чувствительностью при определении карбоновых кислот, в том числе, в образцах со сложными матрицами.

Ключевые слова: метабиотики, экзометаболиты, карбоновые кислоты, обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография, капиллярный зонный электрофорез.

METHODS OF IDENTIFICATION OF CARBOXYLIC ACIDS IN THE COMPOSITION OF THE EXOMETABOLITE OF THE PROBIOTIC CULTURE LACTOBACILUS PLANTARUM 8P-A3

Shilova1 E.G., Pustobaeva2 M.S., Krasilnikova1 A.N., Hohryakova1 M.D.

1Perm state pharmaceutical Academy, Perm, Russian Federation

2Federal Scientific Center for Medical and Preventive Health Risk Management Technologies, Perm, Russian Federation

Abstract. Human life in modern conditions is characterized by the constant influence of adverse environmental factors affecting the neuropsychological, physiological and metabolic parameters of the body. The compensatory capabilities of each individual, including the immune state, are largely determined by the state of the microbiota. In practical microbiology, research is relevant in the development of a new generation of drugs designed to maintain and restore normal flora, including fundamentally new probiotics - metabiotics created on the basis of microbial exometabolites. Taking into account the demand for metabiotics in the pharmaceutical market, an exometabolite complex was proposed for the design of such preparations, obtained by ultrafiltration of the culture liquid of a probiotic strain used in the production of lactobacterin. It is known that, along with bacteriocins, carboxylic acids remain among very significant components of the metabolite complexes of lactobacilli. In this regard, the purpose of this work was to choose the optimal physicochemical methodfor the joint determination of carboxylic acids on the model of the complex of exometabolites of the probiotic culture Lactobacilus plantarum 8P-A3.As a result of the studies, it was found that the optimal physicochemical method for identifying carboxylic acids in the composition of the metabolite complex is the method of capillary zone electrophoresis. In the composition of metabolites, such significant acids as lactic (217.7 g/l), citric and acetic (29.6 and 10.2 g/l) were identified. The simplicity and expressiveness of this method, combined with its high sensitivity in the determination of carboxylic acids, including in samples with complex matrices, is noted.

Включен в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК

при Министерстве образования и науки Российской Федерации —--—

https://c1inical-journai.ru

E-ISSN 2686-6838

Key words: metabiotics, exometabolites, carboxylic acids, reverse-phase high performance liquid chromatography, capillary zone electrophoresis.

Введение. В настоящее время существование человека характеризуется постоянным и интенсивным влиянием неблагоприятных условий внешней среды, затрагивающих

нейропсихологические, физиологические и метаболические параметры его жизнедеятельности. Одним из ведущих факторов, определяющих компенсаторные возможности макроорганизма, в том числе иммунный статус, является состояние его микробиоты.

Поддержание функционального уровня нормофлоры возможно с использованием пробиотических препаратов [1]. Однако, многолетний опыт применения традиционных пробиотиков на основе живых микроорганизмов показал, что их позитивный эффект часто кратковременный, более того, при неадекватном использовании может сопровождаться

возникновением оппортунистических инфекций, аутоиммунных и аллергических осложнений [2]. В связи с этим в практической микробиотологии актуальны исследования в сфере разработки нового поколения лекарственных средств,

предназначенных для поддержания и восстановления симбиотических микробиоценозов -метабиотиков, создаваемых на основе микробных экзометаболитов.

Метаболиты в качестве самостоятельных препаратов-метабиотиков имеют ряд преимуществ технологического и терапевтического характера в сравнении с традиционными клеточными пробиотиками. К их преимуществам следует отнести высокую биодоступность, отсутствие конфликта с собственной микробиотой макроорганизма и латентного периода для реализации биологического эффекта, а также безопасность и более высокие потребительские свойства лекарственных форм.

С учетом востребованности метабиотиков на фармацевтическом рынке был разработан экзометаболитный комплекс, полученный методом ультрафильтрации постферментационной

культуральной жидкости пробиотической культуры ЬасШЪасИш р1аШ:агаш 8Р-А3, предназначенной для конструирования препаратов лактобактерина.

Известно, что к основным составляющим метаболитных комплексов относятся соединения бактериоцинов, а также карбоновые кислоты, обеспечивающие стабильность состава кишечной микрофлоры. В литературе широко представлены методы определения карбоновых кислот, в том числе в метаболических жидкостях пробиотических бактерий, однако их использование не всегда дает удовлетворительные результаты. Цель настоящего исследования - выбор оптимального физико-химического метода

совместного определения карбоновых кислот на модели комплекса экзометаболитов

пробиотической культуры L. plantarum 8Р-А3.

Материалы и методы: Выделение экзометаболитов проводили методом

ультрафильтрации из бактериальной взвеси L. plantarum 8Р-А3 с применением разделительных половолоконных аппаратов (ВПУ-15) с номинальной отсекающей молекулярной массой (НОММ) 100 кДа.

Для определения карбоновых жирных кислот использовали методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонного электрофореза.

Идентификацию карбоновых кислот и их количественное определение методом

высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проводили с использованием хроматографа Орлант-122 (Медикант, Россия), оборудованного хроматографической

микроколонкой с сорбентом Separon C18 (2,1 мм х 120 мм, 5 мкм), предколонкой (24 мм, 5 мкм), заполненной фазой Диасорб С130 и УФ-детектором, с возможностью установки до 8 длин волн с шагом 2 нм. Пробоподготовку метаболитной жидкости для проведения данного анализа осуществляли методом твердофазной экстракции.

Количественное содержание карбоновых кислот проводили методом капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) с использованием системы «Капель-103Р» с УФ-детектором (длина волны 254 нм). В анализе анионов использовали косвенное детектирование на фоне поглощения бензоат-иона. Метаболитную жидкость предварительно центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин, затем фильтровали с использованием мембранных фильтров с диметром пор 0,22 мкм. Химические реагенты, в том числе уксусная, лимонная и молочная кислоты, этанол, имели квалификацию х.ч., ч.д.а. или ос.ч. (Криохром, Россия; Merck, Германия).

Результаты и обсуждение. Определение карбоновых кислот в составе экзометаболита пробиотической культуры L. plantarum 8Р-А3 методом высокоэффективной жидкостной хроматографии без предварительной

пробоподготовки провести не удалось ввиду наличия мешающих компонентов матрицы (рис.1).

Проведение дальнейших экспериментов потребовало уточнения методических аспектов тестирования ультрафильтратов на присутствие неизвестных составляющих ввиду

предположительного сложного состава.

https://clinical-journal.ru

E-ISSN 2686-6838

AU

20^

15

10^

210 нм

0

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Рисунок 1 - Хроматограмма ультрафильтрата пробиотической культуры Lactobacilus plantarum 8Р-А3 без проведения предварительной пробоподготовки.

Figure 1 - Chromatogram of the ultrafiltrate of the probiotic culture Lactobacilus plantarum 8P-A3 without preliminary sample preparation.

Отделение матрицы проводили с помощью твердофазной экстракции (ТФЭ) на ионообменной смоле в OH-форме. Пробу метаболитной жидкости 0,25-0,50 мл пропускали через картридж ТФЭ, промывали смолу 10 мл деионизированной воды и реэкстрагировали кислоты 10 мл 1 М серной кислоты. Экстракт разбавляли водой до

необходимого объема в мерной колбе (во всех определениях разбавление полученного

экстракта составило 1:100). Органические кислоты в ионной форме не удерживаются обращенной фазой поэтому для подавления их диссоциации в качестве элюента применяли буферную смесь КН2Р04/Н3Р04 (рКа1(Н3Р04)=2,12) с

концентрацией 50 мМ (рН=2.0) с добавкой 2 мл ацетонитрила на 100 мл буфера. Разделение пиков КЖК производили в

мин

изократическом режиме, со скоростью потока 100 мкл/мин. Длина волны детектирования составила 210 нм. Согласно литературным данным, в составе экзометаболитов лактобактерий в основном присутствуют такие карбоновые кислоты, как молочная, уксусная, и лимонная [3]. В связи с этим идентификацию компонентов экзометаболитов Ь. р1аП;агцш 8Р-А3 при хроматографировании осуществляли путем сравнения со временем удержания стандартов (эталонная смесь кислот), количество - методом внешнего стандарта. В описанных условиях время анализа составило 8 минут (рис 2,3).

AU

3

1 Л 1

/ Ч: Vi /

210 им!- г 1 I

1 2

!

1

\ 11

210 нм Щ^км ^ЧАМялА- L V**Vv

Рисунок 2 - Хроматограмма эталонной смеси кислот: 1 -молочная, 2 - уксусная, 3 - лимонная.

Figure 2 - Chromatogram of the reference mixture of acids: 1 -lactic, 2 - acetic, 3 - citric.

Рисунок 3 - Хроматограмма ультрафильтрата L. plantarum 8P-A3 с предварительной твердофазной экстракцией: 1 - системный пик, 2 - молочная кислота, 3 - уксусная кислота.

Figure 3 - Chromatogram of L. plantarum 8P-A3 ultrafiltrate with preliminary solid phase extraction: 1 -systemic peak, 2 - lactic acid, 3 - acetic acid.

В результате проведенных исследований в метаболитной жидкости пробиотической культуры Ь. р1аШ;агат 8Р-А3 идентифицированы такие значимые карбоновые кислоты, как молочная (218,2 г/л) и уксусная (20,4 г/л).

Раздельное определение анионов карбоновых кислот методом капиллярного зонного электрофореза проводили в условиях косвенного детектирования при 254 нм на фоне поглощения бензоат-иона. При анализе использовали немодифицированный кварцевый капилляр

5

0

AU

0.8

0.6

0.4

0.2

0

1

2 3

4

5

6

7

8 мин

https://c1inical-journai.ru

E-ISSN 2686-6838

(внутренний диаметр 75 мкм, общая длина 60 см, эффективная длина 50 см). Разделение выполняли при напряжении 20 кВ с гидродинамическим вводом пробы: 30 мбар в течение 5 с. Разделение анионного состава проводили при отрицательной полярности, поэтому для обращения электроосмотического потока (ЭОП) в состав

рабочего буфера вводили цетилтриметиламмония бромид или цетилтриметиламмония-гидроксид. В данном случае, сложный состав матрицы не мешал определению КЖК, поскольку анионы обгоняли ЭОП, а вместе с ним и нейтральные соединения в составе исследуемой пробы.

Таблица 1

Определение состава карбоновых кислот в ультрафильтрате пробиотической культуры

L. plantarum 8P^3

Карбоновые кислоты Капиллярный зонный электрофорез Высокоэффективная жидкостная хроматография

Площадь пиков, S, AU* мин Концентрация, C, г/л Площадь пиков S, AU* мин Концентрация,С, г/л

Лимонная 0,48 29,6 0,00 0,00

Молочная 5,25 217,7 11,37 218,2

Уксусная 0,47 10,2 0,91 20,4

Е 257,5 238,6

Table 1

Identification of the composition of carboxylic acids in the ultrafiltrate of the probiotic culture

L. plantarum 8P-A3.

Carbon acid Capillary zone electrophoresis High performance liquid chromatography

Peak area, S, AU*min Concentration, C, g/l Peak area S, AU*min Concentration, C, g/l

Lemon 0,48 29,6 0,00 0,00

Lactic 5,25 217,7 11,37 218,2

Acetic 0,47 10,2 0,91 20,4

Е 257,5 238,6

Как видно из Таблицы 1, определение карбоновых кислот методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и капиллярного зонного электрофореза дает очень близкие результаты.

Преобладающей кислотой в метаболитной жидкости пробиотической культуры является молочная и в значительно меньшем количестве присутствует уксусная.

При определении карбоновых кислот методом капиллярного электрофореза в составе ультрафильтрата дополнительно идентифицирована лимонная кислота. Стоит отметить, что в условиях определения карбоновых кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии данный продукт выявлен не был, что свидетельствует о более высокой чувствительности метода зонного электрофореза в случае определения органических кислот в постферментационных жидкостях, и что не менее важно, требует при этом минимальную подготовку образцов, в том числе со сложными матрицами.

Идентифицированные кислоты являются важным компонентом кишечного биотопа, обеспечивающим функциональную активность и постоянство кишечного гомеостаза. Заключение. В результате проведенных исследований установлено, что оптимальным физико-химическим методом идентификации

карбоновых жирных кислот в составе экзометаболитного комплекса, полученного методом ультрафильтрации постферментационной культуральной жидкости пробиотической культуры Ьа^оЬасПш р1аШ:агаш 8Р-А3, является метод капиллярного зонного электрофореза. Выявлено, что в составе метаболитов обнаружены такие значимые кислоты, как молочная (оказывают избирательное антибактериальное действие), уксусная (регулирует моторную и секреторную активность кишечника, поступает в ткани в качестве энергетического субстрата) и лимонная (участвует в биохимичексих реакциях и детоксикации организма). Отмечена простота и экспресность данного метода в комплексе с его высокой чувствительностью при определении карбоновых жирных кислот, в том числе, в образцах со сложными матрицами. В свою очередь хроматографическое идентифицирование

карбоновых жирных кислот в препарате было ограничено эффективностью и селективностью отделения пиков кислот, а в случае проведения твердофазной экстракции не позволяло определить дополнительные (в частности, уксусную) кислоты, присутствующие в составе экзометаболита.

https://c1inica1-journai.ru

E-ISSN 2686-6838

REFERENCES

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК

[1]. Andreeva I.V. Evidence-based rationale for the use of probiotics for the treatment and prevention of gastrointestinal diseases / I.V. Andreeva // Medical Council. 2007. N 3. S. 60-63.

[2]. Shenderov B.A. Metabiotics - a new technology for the prevention of diseases associated with human microecological imbalance / B.A. Shenderov // Bulletin of restorative medicine. 2017. N. 4. P. 40-49.

[3]. Mikhailova E.A. Antibacterial properties of metafiltrates of the main strains of saprophytic human lactobacilli, which are part of metabiotics / E.A. Mikhailova, E.M. Bolshakova, D.V. Lokoshko // Modern medicine: new approaches and current research: Sat. Art. Based on the materials of the XLVII International Scientific and Practical Conference "Modern Medicine: New Approaches and Current Research". 2021. N. 4 (43). S. 67-76.

[1]. Андреева И.В. Доказательное обоснование применения пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний ЖКТ / И.В. Андреева // Медицинский совет. 2007. № 3. С. 60-63.

[2]. Шендеров Б.А. Метабиотики-новая технология профилактики заболеваний, связанных с микроэкологическим дисбалансом человека / Б.А. Шендеров // Вестник восстановительной медицины. 2017. № 4. С. 40-49.

[3]. Михайлова Е.А. Антибактериальные свойства метафильтратов основных штаммов сапрофитных лактобацилл человека, входящих в состав метабиотиков / Е.А. Михайлова, Е.М. Большакова, Д.В. Локошко // Современная медицина: новые подходы и актуальные исследования: сб. ст. по материалам ХЬУП Международной научно-практической конференции «Современная медицина: новые подходы и актуальные исследования». 2021. № 4 (43). С. 67-76.

Author Contributions. Shilova E.G - concept and design of a research; Pustobaeva M.S. - collecting and processing of materials,

statistical data processing; Krasilnikova A.N., Hohryakova M.D. - review of literature, writing of the text.

Conflict of Interest Statement. The authors declare no conflict of interest.

ShilovaE.G. - ORCID: 0000-0002-0001-6649

Pustobaeva M.S. - SPIN ID: 2408-5172

Krasilnikova A.N. - SPIN ID: 3437-6550; ORCID: 0000-0003-3507-5005 Hohryakova M.D. - SPIN ID: 7078-4091; ORCID: 0000-0002-3826-3485

For citation: Shilova E.G., Pustobaeva M.S., Krasilnikova A.N., Hohryakova M.D. METHODS OF IDENTIFICATION OF CARBOXYLIC ACIDS IN THE COMPOSITION OF THE EXOMETABOLITE OF THE PROBIOTIC CULTURE LACTOBACILUS PLANTARUM 8P-A3. Medical & pharmaceutical journal "Pulse". - 2022;24(6): 89-93. doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-6-89-93.

Заявление о конфликте интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Шилова Е.Г. - ORCID: 0000-0002-0001-6649 Пустобаева М.С. - SPIN ID:2408-5172

Красильникова А.Н. - SPIN ID: 3437-6550; ORCID: 0000-0003-3507-5005 Хохрякова М.Д. - SPINID:7078-4091; ORCID: 0000-0002-3826-3485

Для цитирования: Шилова Е.Г., Пустобаева М.С., Красильникова А.Н., Хохрякова М.Д. МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ В СОСТАВЕ ЭКЗОМЕТАБОЛИТА ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ LACTOBACILUS PLANTARUM 8P^3 // Медико-фармацевтический журнал "Пульс". 2022. - Т. 24. № 6. - С. 89-93. doi: 10.26787/nydha-2686-6838-2022-24-6-89-93.