CC BY
471
УДК 547.745:542.91:615.014.43
РАЗРАБОТКИ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ МЕТАБОЛИТНЫХ ПРОБИОТИКОВ И ИХ СТАНДАРТИЗАЦИЯ
Е.И. Молохова, Ю.В. Сорокина
ГОУ ВПО Пермская государственная фармацевтическая академия Минздравсоцразвития России
E-mail: [email protected]
WORKINGS OUT DOMESTIC METABOLIC PROBIOTIC AND THEIR STANDARDIZATION
E.I. Molokhova, Yu.V. Sorokina
Perm State Pharmaceutical Academy
Обобщены результаты исследований отечественных ученых в области разработки перспективной группы пробиотиков - метаболитных препаратов. Рассмотрены основные методы выделения клеточных и метаболитных фракций ряда микроорганизмов и параметры их стандартизации.
Ключевые слова: метаболитный пробиотик, супернатант, центрифугирование, гидролиз, фильтрация.
Domestic scientists’ researches results in the field of working out perspective group of probiotics - metabolic preparations are generalized. The basic methods of allocation of cell and metabolic fractions of some microorganisms and parameters of their standardization are considered.
Key words: metabolic probiotic, supernatant, centrifugation, hydrolysis, filtration.
В настоящее время на российском фармацевтическом рынке среди метаболитных пробиотиков широкое распространение получили импортные препараты, такие, как Хилак форте, Гастрофарм. Положительный клинический опыт их использования послужил тому, что отечественными учеными активно ведется работа по созданию аналогичных лекарственных препаратов. В качестве основных объектов исследования выступают микроорганизмы: Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Staphylococcus warneri, Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Escherichia coli и другие [20]. Выбор данных микроорганизмов связан с функциями, оказываемыми ими для макроорганизма человека, а также со способностями фрагментов клеток и метаболитов разного рода микробов оказывать иммуномодулирующее, антагонистическое и ряд других действий.
Лактобактериям наряду с бифидобактериями, одним из основных представителей облигатной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, принадлежит одна из ведущих ролей в поддержании симбионтных отношений между макроорганизмом и его микрофлорой, а также в регуляции межмикробных взаимоотношений. К основным функциям лактобактерий относят их участие в обменных процессах и защите от инфекций извне среды [18, 19].
Бактерии рода Bacillus subtilis являются представителями апатогенной спорообразующей транзиторной микрофлоры человека. Представляет интерес их способность синтезировать антибиотикоподобные вещества [7].
Стафилококки относятся к роду шаровидных неподвижных аспорогенных грамположительных хемоорга-
нотрофных факультативно-анаэробных бактерий из семейства Micrococcaceae. Продуцируют фибринолизин, фосфатазу, р-лактамазу. Особый интерес представляет феномен продукции низкомолекулярного антибактериального катионного пептида. Этот пептид, по ряду физико-химических и биологических свойств идентифицированный как новый пептид семейства лантибиотиков с молекулярной массой 2999, обладает широким спектром ингибирующего действия на рост чувствительных и резистентных к антибиотикам бактерий [15].
Энтерококки - грамположительные кокки, спор и капсул не образуют, факультативные анаэробы. Энтерококки входят в состав нормофлоры человека, играют важную роль в обеспечении колонизационной резистентности слизистых, но в то же время они являются представителями группы условно-патогенных бактерий, способных вызвать при определенных условиях аутоинфекцию. Они осуществляют метаболизм бродильного типа, ферментируют разнообразные углеводы с образованием в основном молочной кислоты, но не газа, снижая рН до 4,2-4,6
[4].
Кишечные палочки - грамотрицательные палочки, не образуют спор, являются факультативными анаэробами. Данные микроорганизмы - нормальные представители микрофлоры толстой кишки; выполняют ряд полезных функций, в том числе антагонистов патогенных кишечных бактерий, гнилостных бактерий, грибов рода Candida, принимают участие в синтезе витаминов группы В, Е, ^.
В технологии препаратов на основе метаболитных и клеточных фракций основное значение имеет стадия их выделения из бактериальной биомассы или из их культуральных жидкостей.
Методы выделения метаболитов и фракций микроорганизмов
Анализ литературных данных показывает большое разнообразие подходов к данному вопросу. В ряде научно-исследовательских институтов и отдельных предприятий показана возможность использования для выделения клеточных и метаболитных фракций таких технологических методов, как центрифугирование, гидролиз, фильтрация.
Выделение низкомолекулярного поликатионного пептида - варнерина осуществляли из супернатанта культуры клеток Staphylococcus warneri IEGM KL-1, который подвергали истощающей фильтрации в системах Centricon (Amersham) и очистке на сорбентах Heparin-Agarose (Pharmacia) и Sephadex G-25 (Pharmacia) [15].
Группой ученых Санкт-Петербургской государственной медицинской академии им. И.И. Мечникова и ООО “Лаборатории технологии оздоровительных препаратов” (Москва) исследован супернатант биомассы глубинного культивирования бактерий Bacillus subtilis, который ранее при выпуске препарата БИОД-5 (Биоспорин) подлежал утилизации. Супернатант получали из культуральной жидкости микробной биомассы после концентрирования на сепараторах [7].
Супернатант микробной культуры Enterococcus faecium L3 получали выращиванием в бульоне BHI (США) при 37 °С 6-8 часов до ранней стационарной фазы роста центрифугированием и стерилизацией фильтрованием через Filtropor 0,45мm (Sarstedt, Германия). Пептидный экстракт готовили прогреванием супернатанта при 100 °С в течение 15 мин и высаливанием его сульфатом
аммония (70%). Затем проводили повторное центрифугирование, к осадку добавляли фосфатный буфер (рН 7,2) и осуществляли диализ этого раствора (диализные мембраны Spectra/Por MWCO 1000, США). С помощью фильтрации содержимого диализного мешка через мембрану Amicon PM (10000MW) получали фильтрат, содержащий пептиды менее 10 кД. Далее фильтрат концентрировали лиофильным высушиванием (LGA 0,5; Германия) [4].
Yersinia pseudotuberculosis являются представителями рода Yersinia семейства Enterobacteriaceae, полиморфные мелкие грамотрицательные подвижные палочки эллипсоидной или кокковидной формы. Yersinia pseudotuberculosis - возбудители псевдотуберкулеза у человека и у многих видов теплокровных животных. Хотя данные микроорганизмы не используются для получения лекарственных препаратов, представляет интерес способ выделения метаболитных фракций из их бактериальных биомасс. Получение низкомолекулярной фракции Yersinia pseudotuberculosis осуществляли следующим образом: последовательно экстрагировали влажные микробные клетки кипящим 80% этанолом (для остановки ферментативных процессов) и центрифугировали при 12000 оборотов в минуту в течение 30 мин. Осадок последовательно обрабатывали горячим 40- и 20% этанолом и горячей водой. Супернатанты объединяли, упаривали и ли-офилизировали [1].
Ученые Пятигорской государственной фармацевтической академии и ФГУП НИИ комплексного использования молочного сырья (Ставрополь) разрабатывают лекарственный препарат на основе лизата штаммов Lactobacillus acidophilus, обладающий иммуномодулирующими свойствами. Получены четыре серии гидролиза-
Рис. 1. Хроматографический профиль ультрафильтрата культуральной жидкости Lactobacillus plantarum 8P-A3 (1А), препарата Хилак форте (1Б) на сефадексе G-75. Стандарты: Уо - свободный объем колонки (голубой декстран); 1 - овальбумин (43000 Д); 2 - химотрипсиноген (25000 Д); 3 - рибонуклеаза (13700 Д); 4 - бацитрацин (1450 Д); 5 - Suc-Ala-Ala-Ala-pNa (415 Д)
тов молочнокислых бактерий с использованием разных способов (термокислотный способ, автолиз, автолиз с последующим термокислотным гидролизом, соляно-кислый гидролиз). В ходе исследований установлено, что термокислотный способ является более эффективным [5, 11].
Коллективом авторов государственного научного центра России - Института особо чистых биопрепаратов в Санкт-Петербурге разработан препарат “Актофлор”, аутостимулятор роста. Препарат получали путем последовательной ультрафильтрации и лиофилизации культуральной жидкости, отобранной со стационарной стадии роста E. coli М-17 в ферментере на глюкозо-минеральной среде М-9. Он представляет собой низкомолекулярную фракцию экзометаболитов культуральной жидкости E. coli М-17 [2, 3, 12, 14].
На базе филиала ФГУП НПО Микроген МЗ РФ Пермское НПО “Биомед” в отделении препаратов бактериоте-рапии проведен сравнительный анализ состава и биологической активности культуральных жидкостей производственных штаммов лактобактерий и зарубежного лекарственного препарата Хилак форте [16].
На сефадексе G-75 в ультафильтрате культуральной жидкости лактобактерий определяется один пик с ММ менее 1450 Д (рис. 1А). Фракционный состав ультрафильтрата близок фракционному составу Хилак форте (рис. 1Б). Оба препарата в основном содержат вещества с молекулярной массой менее 1450 Д [16, 17].
В ходе скрининговых экспериментов на модели теста кислотообразования установлено, что фильтраты культуральных жидкостей различных штаммов лактобактерий оказывают пробиотическое действие in vitro практически в равной степени. Во всех случаях внесение 10%-й культуральной жидкости в среду культивирования (обезжиренное молоко) вызывало статистически значимый более высокий прирост кислотности по сравнению с контрольной пробой (внесение 10%-го физиологического раствора). Значительных отличий в величинах коэффициентов стимуляции кислотообразова-ния в данной серии экспериментов не выявлено [8].
Сравнительными исследованиями влияния культуральной жидкости на клетки иммунной системы in vitro с использованием скрининговой методики, применяемой для оценки иммунобиологической активности препаратов тимуса, показано, что культуральная жидкость лактобактерий, а также препарат сравнения Хилак форте обладают иммунобиологической активностью (восстановление количества Еа-РОК превышает 40%). Культуральная жидкость штамма L. plantarum 8P-A3 отлича-
ется более высокой иммунобиологической активностью (восстановление количества Еа-РОК у данного образца составляет 71%) [9].
Таким образом, принимая во внимание количество продуцируемых метаболитов и их биологическую активность, для получения препарата был выбран наиболее перспективный в производственном отношении вариант
- культуральная жидкость лактобактерий штамма L. plantarum 8P-A3.
Выделение экзометаболитов на базе филиала ФГУП НПО Микроген МЗ РФ Пермское НПО “Биомед” в отделении препаратов бактериотерапии проводили из бактериальной взвеси лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3, полученной путем периодического культивирования на казеиново-дрожжевой среде в аэробных условиях при температуре 37 °С и активном перемешивании [6, 13]. Экспериментальные серии ультрафильтрата культуральной жидкости лактобактерий (УКЖЛ) штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3 получены на установке УПЛ-0,6 (Россия) с использованием половолоконных (ВПУ-15) разделительных аппаратов, позволяющих выделять вещества с молекулярной массой менее 15 кД [10].
Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о 3 основных методах, используемых для выделения метаболитных и клеточных фракций микроорганизмов: центрифугирование или осаждение с последующим отделением супернатанта, ультрафильтрация, позволяющая разделить низко- и высокомолекулярные вещества, гидролиз. C нашей точки зрения, наиболее рационально
Таблица 1
Оценка качества метаболитных и клеточных фракций микроорганизмов
Показатели
Плотность
рН
Кислотность Общий азот
Аминный азот Белок (пептиды)
Углеводный состав
Аминокислоты
Органические кислоты
Метод определения (оборудование)
С помощью ареометра (ГФ XI)
С потенциометрический метод (ГФ XI)
Титриметрический метод (ФСП 42-05047298054 "Лактобактерин сухой”) Метод Кьельдаля Метод Несслера
Метод формольного титрования Метод Лоури
С использованием биуретового реактива
SDS электрофорез в полиакриламидном геле - состав фракций пептидного экстракта
С реактивом Бенедикта, в качестве стандарта использовали глюкозаминил мурамилдипептид (ГМДП)
Мицеллярный электрофорез - (количественное определение ГМДП в гидролизатах)
Бумажная хроматография (нисходящая бумажная хроматография на бумаге Filtrak Fn-15, Fn-12)
Бумажная хроматография
На аминокислотном анализаторе (Hitachi-835 на колонке (250х2,0 мм) со смолой №2619, 4151 Alpha plus ("LKB”, Швеция), Биотроник IC - 2000 (Германия) по стандартным методикам
Элюирование 70% этанолом с последующим окислительно-восстановительным титрованием 0,01 н NaOH (количественное содержание) Н-ЯМР-спектроскопия на приборе СХР 300 ("Bruker”, Германия) определен состав органических кислот
С использованием высокоэффективного капиллярного электрофореза в системе Agilent Тонкослойная хроматография
использовать процессы ультрафильтрации, поскольку они позволяют получить в мягких условиях максимально сконцентрированную бактериальную взвесь и ультрафильтрат для производства лекарственных препаратов.
Показатели качества и методы определения. Для идентификации и определения количественного содержания метаболитов и клеточных фракций используют различные физико-химические методы: титриметричес-кие, хроматографические, потенциометрические, электрофоретические, спектрофотометрические. Обобщенные данные по изучаемым показателям и методам их определения представлены в таблице 1.
Из данных таблицы 1 видно, что для характеристики культуральной жидкости традиционно определяют плотность, рН и кислотность. Основными показателями, характеризующими препараты на основе микробных метаболитов и клеточных фракций, являются пептиды, общий азот, органические вещества и аминокислоты. Среди современных физико-химических методов находят применение методы с использованием аминокислотно-
Таблица 2
Эффекты, оказываемые метаболитными препаратами
го анализатора, а также высокоэффективный капиллярный электрофорез, ЗОБ электрофорез, Н-ЯМР-спектро-скопия.
Биологические эффекты
Среди воздействий, оказываемых на организм человека метаболитами бактерий, следует указать: участие в энергетических процессах, стимуляция собственной ин-дигенной микрофлоры, противомикробные и антагонистические эффекты в отношении условно-патогенных и патогенных микробов, повышение чувствительности к антибиотикам транзиторной флоры и др.
В таблице 2 представлены обобщенные данные об эффектах, оказываемых метаболитными препаратами.
Таким образом, анализ данных литературы свидетельствует о большом значении биологически активных бактериальных метаболитов для организма человека. Метаболиты, продуцируемые разными видами микроорганизмов, оказывают стимулирующее действие на бактерии
Исследуемый объект
Эффект
Супернатант Staphylococcus warneri IEGM KL-1
Супернатант Bacillus subtilis
Супернатант Enterococcus faecium L3
Гидролизаты Lactobacillus аcidophiIus
Низкомолекулярная фракция экзометаболитов культуральной жидкости Escherichia coli М-17
Аутостимулятор роста Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus, полученный ультрафильтрацией
Ультрафильтрат культуральной жидкости лактобактерий штамма Lactobacillus plantarum 8P-A3
Бактерицидная активность в отношении Staphylococcus epidermidis Потенцирование действия антибиотиков на клетки Staphylococcus epidermidis
Иммуномодулирующая активность
Антагонистическая активность в отношении ряда патогенных и условно-патогенных микроорганизмов Ингибирующие воздействия на лакто- и бифидобактерии Подавление развития Candida albicans и стафилококков Стабилизирующие влияния на микрофлору ЖКТ у животных
Антагонистическая активность в отношении Streptococcus agalactiae. При сравнении антибактериальной активности супернатанта и пептидного экстракта установлено, что последний в меньшей степени ингибировал индикаторные культуры, что объясняется присутствием в надосадочной жидкости дополнительных антимикробных факторов (молочной кислоты), а также частичной деградацией бактериоцинов в процессе экстракции и очистки
Иммуномодулирующая активность. Основное действие препарата на основе гидролизатов лактобактерий оказывает глюкозаминилмурамилдипептид - структурный фрагмент пептидогликанов бактериальной стенки, являющийся агонистом образраспознающих рецепторов патогенных бактерий. Его применение приводит к активации врожденной и адаптивной иммунной системы
Пробиотическая активность. При добавлении к чистым культурам (Escherichia coli М-17, Escherichia coli К-12, SalmoneНа enteritidis, Serratia marcescens и Bifidobacterium adolescentis МС-42), наиболее выражено стимулирует рост Escherichia coli М-17, а для Bifidobacterium adolescentis действует в большем диапазоне концентраций. При внесении фракции экзометаболитов Escherichia coli М-17 в смешанные культуры приводит к увеличению процентного содержания клеток Escherichia coli М-17 и подавлению роста микроорганизмов-конкурентов Антагонистическая активность в отношении Salmonelta enteritidis
Влияние на рост и антагонистическую активность Lactobacillus acidophillus и Lactobacillus delbrueckii. Показано, что аутостимулятор роста в большей степени оказывает стимулирующую активность, чем препарат фруктоолигосахаридов (исключение составляет Lactobacillus delbrueckii, который не является симбионтным для человека). Установлено, что "Актофлор” уменьшает, а фруктоолигосахариды увеличивают размеры клеток. Авторы предполагают, что экзометаболиты стимулируют процесс деления клеток лактобактерий. Преимуществом более мелких клеток является их более высокая метаболическая активность за счет интенсификации транспортных процессов, устойчивости к стрессовым воздействиям
Пробиотическая активность в отношении Lactobacillus plantarum 8P-A3 и Lactobacillus acidophilus К3Ш24 Антибактериальная активность в отношении коллекционных штаммов микроорганизмов (Lactobacillus acidophilus К3Ш24, Escherichia coli М-17, Candida albicans ATCC 885-653, Bacillus cereus 8035, Staphylococcus aureus ATCC 65-38-P, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027) и культур, выделенных из клинического материала (биотоп - гинекологический тракт): Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella Повышение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибиотикам (ампициллин, гентамицин) Иммуномодулирующее действие при пероральном применении
нормофлоры, проявляют противомикробное, иммуномодулирующее и ряд других действий, поэтому целесообразность разработки лекарственных препаратов на основе микробных метаболитов не вызывает сомнения. Исходя из вышеизложенного материала, необходимо использовать метаболиты, продуцируемые микроорганизмами, характерными для нормофлоры человека: лактобактериями и другими. Наиболее рациональным методом выделения биологически активных соединений из бактериальной взвеси можно считать ультрафильтрацию. Этот метод позволяет не только получить культуральную жидкость, содержащую метаболиты, но и сохранить сконцентрированную бактериальную взвесь, которую также используют для производства лекарственных препаратов. В качестве лекарственных форм метаболитных пробиотиков перспективны суппозитории, жидкие лекарственные формы (капли для приема внутрь), капсулы, мази.
Литература
1. Бузолеева Л.С., Сомов Г.П., Бурцева Т.И. Сравнительный анализ качественного и количественного состава аминокислот и органических кислот, продуцируемых в культуральную жидкость Yersinia pseudotuberculosis при разных температурах // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2006. - № 3. - С. 12-16.
2. Вахитов ТЯ., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Влияние препаратов “Актофлор” на выживаемость Escherichia coli M-17 и Salmonella enteridis при голодании в смешанных культурах // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии.
- 2000. - № 6. - С. 67-69.
3. Вахитов ТЯ., Петров Л.Н., Бондаренко В.М. Концепция пробиотического препарата, содержащего оригинальные микробные метаболиты // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2005. - № 5. - С. 108-114.
4. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Марцинковская И.В. и др. Влияние пробиотических энтерококков на рост Streptococcus agalactiae // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2007. - № 5. - С. 73-77.
5. Гаврилин М.В., Сеньчукова Г.В., Сенченко С.П. Выбор оптимальных условий получения гидролизатов молочнокислых бактерий термокислотным способом // Хим.-фарм. журн.
- 2007. - Т. 41, № 2. - С. 54-56.
6. Несчисляев В.А., Молохова Е.И., Чистохина Л.П. и др. К вопросу разработки пробиотических препаратов из культуральной жидкости лактобактерий // Клиническое питание.
- 2007. - № 1-2. - С. А-55.
7. Волков М.Ю., Ткаченко Е.И., Воробейчиков Е.В. и др. Метаболиты Bacillus subtilis как новые перспективные пробиотические препараты // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2007. - № 2. - С. 75-79.
8. Несчисляев В.А., Сафонова Г.М., Чистохина Л.П. Новый про-
биотический препарат “Микростим” // Пробиотические организмы - современное состояние вопроса и перспективы использования : матер. междунар. науч.-практ. конф.
- М., 2002. - С. 49.
9. Несчисляев В.А., Сафонова Г.М., Чистохина Л.П. Роль лабораторной диагностики в современных медицинских технологиях // Матер. юбилейн. науч.-практ. конф. УГМА. -Екатеринбург, 2000. - С. 164-169.
10. Молохова Е.И., Несчисляев В.А., Сорокина Ю.В. и др. Перспективные направления создания препаратов-пробиотиков // Фармация из века в век : труды науч.-практ. конф., ч. 4. Биохимические, микробиологические, биотехнологические исследования. - СПб., 2008. - С. 66-68.
11. Сенченко С.П. Разработка методов анализа и оптимизация состава лекарственного препарата на основе гидролизата молочнокислых бактерий : автореф. дис. ... канд. фарм. наук.
- Пятигорск, 2006. - 24 с.
12. Вахитов ТЯ., Момот Е.Н., Шалаева О.Н. и др. Состав и биологическая активность экзометаболитов Escherichia coli М-17 // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2003. - № 6. - С. 20-25.
13. Способ получения биологического стимулятора : пат. 2224018 Рос. Федерация. №2001131538; заявл. 21.11.01.; опубл. 20.02.04.; приор. 21.11.2001. - 10 с.
14. Вахитов Т.Я., Добролеж О.В., Петров Л.Н. Сравнительное изучение действия экзометаболитов Escherichia coli М-17 и фруктоолигосахаридов на рост и антагонистическую активность лактобацилл // Журн. микробиологии, иммунологии и эпидемиологии. - 2001. - № 3. - С. 80-83.
15. Титова А.В. Изучение антибактериального действия низкомолекулярного поликатионного пептида варнерина на антибиотикорезистентные штаммы Staphylococcus epidermidis : автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Пермь, 2002.
- 23 с.
16. Чистохина Л.П. Иммунобиологическая характеристика препарата “Микростим” на основе метаболитов лактобактерий : дис. ... канд. мед. наук. - Пермь, 2004. - 171 с.
17. Чистохина Л.П., Несчисляев В.А., Сафонова Г.М. Разработка биологически активных препаратов на основе культуральных жидкостей лакто- и бифидобактерий // Актуальные проблемы фармацевтической науки и образования: итоги и перспективы : материалы юбилейн. межвуз. науч.-практ. конф. Перм. гос. фарм. акад. - Пермь, 2000. - С. 168.
18. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание : в 2 т. - М. : ГРАНТЪ, 1998. - Т. 1. Микрофлора человека и животных и ее функции. - 288 с.
19. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание : в 2 т. - М. : ГРАНТЪ, 1998. - Т. 2. Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. - 416 с.
20. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание : в 3 т. - М. : ГРАНТЪ, 2001. - Т. 3. Пробиотики и функциональное питание. - 288 с.
Поступила 30.03.2010
