CC BY
358
КОНЦЕПЦИЯ СУПЕРОРГАНИЗМА В БИОЛОГИИ И МЕДИЦИНЕ
Вахитов Т. Я. 1, Ситкин С. И/ 1 2
'Гос. НИИ ОЧБ ФМБА России,
2СЗГМУ им. И. И. Мечникова, Санкт-Петербург
THE SUPERORGANISM CONCEPT IN BIOLOGY AND MEDICINE
Vakhitov T. Ya., Sitkin S. I.
State Research Institute of Highly Pure Biopreparations,
North-Western State Medical University named after 1.1. Mechnikov, St. Petersburg, Russia,
Резюме
Статья посвящена развитию теории суперорганизма человека и его микробиоты. Представлены уникальные и малоизвестные данные о мутуалистических взаимоотношениях организма-хозяина и его микробиома, описаны основные метаболические эффекты микробиоты кишечника и возможности использования бактериальных экзометаболитов в качестве аутостимуляторов и аутоингибиторов роста, предложена инновационная концепция управляемого микробиоценоза как цели и приоритетной задачи разработки клинически эффективных бактериальных, метаболитных и бактериально-метаболитных препаратов — пробиотиков и метабиотиков.
Ключевые слова: аминокислоты, ауторегуляторы, ацетат, бутират, карбоновые кислоты, метабиотики, микро-биота, пробиотики, пропионат, сукцинат, управляемый микробиоценоз, формиат, экзометаболиты.
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2014; 107 (7):72-85
Summary
The paper discusses the concept of the superorganism of man and his microbiota. A unique and little-known details regarding mutualistic relationship of the host and its microbiome are represented. The main metabolic effects of the gut microbiota of the intestine are described. The use of microbial metabolites as autoregulatory substances in experiments and in clinical practice is discussed. Authors propose an innovative concept of controlled microbiocenosis as a main goal and a priority task of the development of clinically effective probiotics and metabolite preparations (metabiotics).
Keywords: acetate, amino acids, autoregulators, butyrate, carboxylic acids, controlled microbiocenosis, exometabolites, formate, metabiotics, microbiota, propionate, succinate, superorganism..
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2014; 107 (7):72-85
Вахитов
Тимур Яшэрович Vakhitov T. Ya. E-mail:
tim-vakhitov@yandex.ru
Введение
В 2000 г. известный ученый Джошуа Ледер-берг (Joshua Lederberg, 1925-2008), получивший в 1958 году нобелевскую премию за фундаментальные исследования в области организации генома бактерий, опубликовал в журнале Science статью, формально посвященную истории инфекционных болезней, а фактически являющуюся его посланием мировой научной общественности. В заключительном разделе этой статьи ученый с мировым именем подводит итоги борьбы человечества с инфекциями и призывает рассматривать микроорганизмы их враждебности человеку (Teach War No More), а вспомнить, что организм человека в действительности является суперорганизмом, в котором функционально объединены геномы хозяина и его микробиоты, между которыми отсутствуют какие-либо противоречия. В свете этого подхода основная задача борьбы с инфекционными заболеваниями заключается не столько в разработке новых антимикробных препаратов, сколько в поиске экологически обоснованных путей воздействия, позволяющих подавить агрессию бактерий и вирусов [1], то есть, по-видимому, превратить их в безвредных комменсалов или элиминировать из организма.
В биологии идея суперорганизма появилась во 2-й половине XIX века благодаря трудам немецкого ботаника и микробиолога Генриха Антона де Бари (1866) (Heinrich Anton de Bary, 1831-1888) и основателя Санкт-Петербургской школы физиологов растений Андрея Сергеевича Фаминцына (18351918). Эти ученые сделали удивительное открытие, обнаружив, что лишайники, считавшиеся до тех пор индивидуальными организмами, на самом деле являются ассоциацией двух организмов — грибов (микобионтов) и водорослей (фотобионтов). В дальнейшем выяснилось, что микобионтами могут быть не только грибы, но и бактерии-актиномицеты, а фотобионтами, кроме водорослей, могут являться и цианобактерии. Фотобионт поставляет микобион-ту питательные вещества, полученные в результате фотосинтеза, а микобионт обеспечивает защиту фотобионта от действия неблагоприятных факторов внешней среды. Если фотобионтом являются цианобактерии, то они поставляют микобионту не только глюкозу, но и азотсодержащие вещества (продукты фиксации азота), поскольку помимо фотосинтеза способны фиксировать азот. Тем самым повышается степень автономности суперорганизма.
Согласно современным представлениям суперорганизмами являются большинство, если не все населяющие планету животные и растения [2]. Еще в 1907 году А. С. Фаминцын, развивая идею симбиоза, опубликовал книгу, в которой высказал предположение о том, что хлоропласты растений произошли от одноклеточных водорослей-симбионтов. Затем в 20-х годах прошлого века К. С. Мережковский и Б. М. Козо-Полянский выдвинули аналогичную гипотезу относительно симбиоти-ческой природы митохондрий. Оба предположения практически полностью подтвердились, однако произошло это только в конце прошлого века. В настоящее время предками митохондрий считаются альфа-протеобактерии, а предками
пластид — цианобактерии. Среди современных бактерий к предкам митохондрий ближе всего пурпурные бактерии Rhodospirillum rubrum, способные и к фотосинтезу, и к аэробному дыханию. Таким образом, эволюционное преобразование симбиоза явилось важным шагом на пути становления эука-риотической клетки. Появление же ядра произошло, по-видимому, также в результате симбиоза, однако когда это случилось — до или после возникновения органелл, доподлинно не известно.
В процессе эволюции митохондрии и хлоропласты сохранили только самые необходимые функции своих предков-бактерий, предоставив все остальное клетке-хозяину. Однако, известен и ряд других внутриклеточных бактерий-симбионтов, находящихся, как полагают, на разных этапах превращения в органоиды (органеллы). Наиболее показательным примером на сегодняшний день является бактерия Carsonella ruddii — внутриклеточный симбионт мелких насекомых листоблошек (Psyllidae), питающихся исключительно соком растений. Ее геном содержит всего 159662 пары оснований ДНК и кодирует только 182 белка [3]. Из свободноживущих бактерий наименьший геном имеет Mycoplasma genitalium, однако и он приблизительно в 3,6 раза больше по размеру (580 тыс. пар нуклеотидов) и содержит 470 кодирующих генов. По своей величине геном C. ruddii сопоставим с геномом митохондрий, составляющим 40-100 тыс. пар нуклеотидов у низших эукариот, 200-400 тыс. пар нуклеотидов у растений, 15-20 тыс. пар нуклеотидов у животных.
Геном бактерий рода Buchnera, эндоцитобионтов тлей, имеет также очень небольшой размер [4], но все же он существенно больше, чем у C. ruddii. Buchnera поставляет хозяину вещества (преимущественно аминокислоты), отсутствующие в соке растений, которым тли питаются, и при этом сама не может существовать вне организма хозяина. Бактерия заселяет специализированные клетки — P-бакте-риоциты, каждый из которых содержит несколько симбиосом, образовавшихся из плазматической мембраны, причем суммарно все бактериоциты могут содержать до 5,6 х 106 бактерий.
Примером бактерии, находящейся, как полагают, на самой ранней стадии превращения в органоид, может служить Ruthia magnifica, сохранившая практически полную биохимическую самостоятельность. Обитает она в клетках жаберного эпителия двустворчатого моллюска Calyptogena magnifica, живущего на морском дне вблизи так называемых «черных курильщиков» — гидротермальных источников с высокой концентрацией сероводорода. R. magnifica фиксирует неорганический углерод за счет энергии, получаемой при окислении сероводорода. Необходимыми для этого газами (сероводород, кислород и CO2) ее обеспечивает сам моллюск, поставляя их из окружающей среды. R. magnifica снабжает своего хозяина органическими веществами, в том числе аминокислотами и витаминами, а также утилизирует аммиак, образующийся в процессе метаболизма хозяина, используя его для синтеза аминокислот. По систематическому положению R. magnifica относится к гамма-протеобактериям, то
есть к той же группе, что и Escherichia coli и многие внутриклеточные симбионты червей, насекомых и других животных. Размер ее генома составляет 1,2 млн. пар нуклеотидов, что существенно меньше, чем у большинства свободноживущих хемоавтотрофов, однако в составе ее небольшого генома сохранились все наиболее характерные для этих бактерий гены [5].
Наиболее обширный класс симбионтов составляют микроорганизмы, населяющие желудочно-кишечный тракт животных. Зависимость хозяина от микробиоты при этом может быть облигатной, как, например, у термита, или факультативной, как у человека. Термиты питаются древесиной, точнее клетчаткой, однако сами не имеют необходимых для ее переваривания ферментных систем. До недавнего времени считалось, что ведущая роль в переработке клетчатки принадлежит простейшим, обитающим в кишечнике термитов. Однако, как недавно выяснилось, переваривают целлюлозу не сами простейшие, а их эндоцитобионты, относящиеся к порядку Bacteroidales и имеющие условное название phylotype CfPt1-2. Сам термит только измельчает кусочки древесины до нужной консистенции, далее они попадают в клетки простейших и там гидролизуют-ся эндоцитобионтами. Последние, как оказалось [6], осуществляют также и фиксацию азота (ранее у представителей Bacteroidales этой способности не отмечалось) и утилизируют продукты азотного обмена, которые образуют их хозяева — простейшие.
Бактерии, относящиеся к порядку Bacteroidales, занимают доминирующее положение и в составе микробиоты кишечника человека, составляя по различным данным от 28 до 48 % всех представителей микробиоты кишечника. Считается, что они участвуют в метаболизме сложных полисахаридов, модулируют местный иммунный ответ и препятствуют заселению кишечника патогенными микроорганизмами [7, 8].
В переработке клетчатки у жвачных животных также участвуют простейшие (инфузории) и их симбиотические бактерии. В рубце (первый и самый большой отдел четырехкамерного желудка жвачных животных) у коров обнаружено около 60 видов инфузорий, у овец — 30 видов, у козы и северного оленя — 20 видов. Обычно в рубце конкретного животного обнаруживается 14-16 видов инфузорий. Инфузории составляют 106 клеток/мл рубцового содержимого — т.е. от 40 до 80 % микробной биомассы рубца. Однако в микробиоте жвачных животных у них имеются конкуренты — грибы и свободноживущие бактерии. Последние
при этом не только гидролизуют клетчатку, но и служат кормом для инфузорий.
Наличие симбионтов часто вызывает редукцию собственной пищеварительной системы хозяина. У моллюска Calyptogena magnifica, упоминавшегося выше, эта редукция зашла не слишком далеко. Однако встречаются и животные, полностью лишенные каких-либо органов пищеварения. К ним, например, относятся глубоководные нитевидные морские черви — погонофоры и родственные им вестиментиферы [9], живущие на склонах «черных курильщиков», то есть у тех же геотермальных источников, что и C. magnifica. Во взрослом состоянии у этих животных полностью отсутствуют кишечник, рот и анус. Вместо этого их тело содержит массивный орган — трофосому, наполненную множеством вакуолей с бактериями, которые осуществляют хемосинтез, используя для этого CO2 и энергию окисления сероводорода до элементарной серы. Сероводород выделяют черные курильщики, а кислород поступает из глубинной воды, окружающей зоны гидротермальных источников. Хозяин доставляет оба вещества бактериям, используя для этого свою кровеносную систему с сетью капилляров, проникающих внутрь клеток трофосомы. В крови сероводород обратимо связывается белковой частью гемоглобина, а кислород — гемом. Сам хозяин при этом получает питание за счет переваривания части симбиоти-ческих бактерий.
В организме погонофор также имеется специализированный орган — замкнутый с обоих концов срединный канал, являющийся гомологом трофосомы вестиментифер. Однако населяют этот орган не сульфидокисляющие бактерии, а бактерии, получающие энергию путем окисления метана, поступающего из подводных скоплений нефти и газа. Бактериальные симбионты вестиментифер и погонофор не передаются по наследству. Их заглатывают личинки червей, которые, в отличие от взрослых особей, имеют нормально развитый рот и кишечник. В дальнейшем рот и анус исчезают, а кишечник превращается в орган бактериального питания — трофосому. У погонофор трофосома сохраняет просвет и больше похожа на кишечник, чем сильно видоизмененная трофосома вестиментифер. Предки этих животных, как и многие современные донные беспозвоночные, сначала, по-видимому, просто питались бактериями, затем некоторые виды бактерий поселились у них в кишечнике и, проникнув в его клетки, превратились в симбионтов.
Взаимодействие микробиоты и организма-хозяина
Как следует из приведенных примеров, основная функция симбиотической системы суперорганизмов заключается в повышении общей эффективности потребления питательных веществ. Взаимодействие хозяина и микробиоты при этом строится на взаимовыгодном обмене пищевыми субстратами и «услугами» (предоставление экологической ниши и др.) и осуществляется по «рыночным» законам равноправного партнерства, согласно которым каждая из частей симбиоза преследует исключительно собственные цели, однако при этом достигается
благополучие и гармоничное развитие всего суперорганизма. Условием поддержания устойчивости симбиоза является «делегирование» ряда функций от хозяина микробиоте и наоборот. Этот процесс сопровождается морфологическими, биохимическими и генетическими изменениями взаимодействующих сторон и повышением их обоюдной зависимости. Одним из универсальных способов делегирования является, по всей видимости, неспособность животных синтезировать определенные (незаменимые) аминокислоты и витамины. Вполне
вероятно, что симбиозы, в которых делегирование отсутствовало или проявлялось в недостаточной степени, оказались неустойчивыми и не сохранились в процессе эволюции.
У человека, как и у других суперорганизмов, ми-кробиота выполняет множество функций, описанию которых посвящена не одна монография [10]. Симбиотические микроорганизмы суперорганизма существуют в условиях постоянной конкуренции с микробами, поступающими вместе с пищей из внешней среды. Одним из результатов этой борьбы является иммунная защита хозяина. Для поддержания целостности микробиоценоза различные его виды обмениваются веществами, синтезированными из непригодных для человека субстратов, или/и утилизируют «вредные» продукты жизнедеятельности других бактерий и самого хозяина. Подобные взаимодействия приводят к образованию сложных систем межклеточных контактов. Так, например, осуществляется взаимодействие бакте-рий-«бродильщиков» и метаногенных архей. Первые из них образуют молекулярный водород, который подавляет их собственный рост, а вторые, находясь с ними в непосредственном контакте, используют этот водород для восстановления углекислого газа с образованием метана. Способностью утилизировать водород микробного происхождения обладают и другие гидрогенотрофы, например, ацетогенные фирмикуты и сульфат-редуцирующие протеобакте-рии, перерабатывающие его соответственно в ацетат или сероводород [11, 12].
С позиций кибернетики устойчивый симбиоз возможен только тогда, когда обмен пищевыми субстратами дополняется регуляторным диалогом между участниками симбиоза. Человек, по сути, «сотрудничает» с микробиотой, используя механизмы метаболической интеграции — явления, существование которого сравнительно недавно было постулировано отечественными учеными на основании многолетних исследований в области медицины критических состояний [13]. Микро-биота не только поставляет человеку питательные вещества (в том числе и те, которые он не способен синтезировать самостоятельно), но и воздействует на хозяина при помощи регуляторных механизмов, вызывая соответствующие изменения в его метаболизме и даже морфологические изменения органов и тканей. В результате этого происходит увеличение длины и площади поверхности кишки (что способствует увеличению общей численности бактерий в кишке), количества эпителиальных клеток, а также крипт и ворсинок. Бокаловидные клетки начинают выделять больше муцина, необходимого для существования пристеночной микробиоты. Сама микробиота изменяет состав муцина, утилизируя белки, гликопротеины, стерины, пептиды и другие соединения, выделяемые хозяином. Подтверждено, например, что в случае дефицита диетических полисахаридов гликаны слизи кишечника могут служить приемлемым источником энергии для некоторых бактероидов (Bacteroides thetaiotaomicron) и представителей бактериального типа УеггисоткгоЫа (Akkermansia muciniphila). В результате деградации слизи Akkermansia muciniphila продуцирует олиго-сахариды и короткоцепочечные жирные кислоты
(КЖК), стимулирующие, в свою очередь, рост и метаболическую активность ассоциированных со слизистым слоем бактерий, обеспечивая, таким образом, колонизационную резистентность к патогенным микроорганизмам. [14]. Благодаря этому муцин становится более пригодным для ее существования. Одновременно бактерии образует новые пептиды, аминокислоты, амины, гормоны, витамины, жирные кислоты, дефензины, нейропептиды, ферменты, оксид азота и другие биологически активные вещества, способные осуществлять регуляторные функции в организме хозяина. Доказано, что многие продукты микробного метаболизма действуют именно как сигнальные молекулы, оказывая прямое влияние на метаболизм организма-хозяина и соответственно на функции кишечника, печени, головного мозга, а также на процессы в жировой и мышечной ткани. Микробные ферменты принимают непосредственное участие в метаболизме полисахаридов и желчных кислот, а также (совместно с ферментами организма-хозяина) играют значимую роль в метаболизме холина — важнейшего компонента клеточных мембран. Нарушения в составе микробиоты повышают риск инфекционных и других соматических заболеваний (включая онкологические), снижают качество и продолжительность жизни [15].
Современные исследования показали, что микробиота способна регулировать поведение хозяина, повышая тем самым свои шансы на выживание. Одним из примеров подобного влияния является групповое поведение саранчи. Обратили внимание на это явление еще в начале прошлого века. В 1915 г. русский натуралист Б. П. Уваров (1888-1970), изучавший биологию одиночной и стадной саранчи, пришел к выводу, что это две фазы одного и того же насекомого. При определенных условиях саранча собирается в стаи, в результате чего существенно увеличивается плотность ее популяции. В зависимости от плотности в естественных и экспериментальных популяциях саранчи изменяется скорость роста и развития животных, их поведение и морфологические особенности. Механизм этого эффекта, получившего название «эффекта группы» [16], долгое время оставался неизвестным, и только недавно выяснилось, что саранча собирается в стаи под действием специальных феромонов агрегации, причем за синтез этих веществ отвечает не хозяин, а его симбиотические бактерии, обитающие в задней кишке насекомых. У восточной перелетной саранчи Locusta migratoria manilensis таких веществ 5: нонаналь, гексаналь, бензальдегид, циклогекса-нол и 2,5-диметилпиразин. В ответ на появление этих соединений в среде обитания у животных повышается синтез нейромедиаторов — серотонина и дофамина, которые инициируют и поддерживают стадное поведение саранчи. Под действием определенных инфекций (паразитарных микроспоридий) численность бактерий, ответственных за синтез феромонов, уменьшается, что влечет за собой и уменьшение выделения этих веществ в окружающую среду. В итоге происходит нарушение стадного поведения саранчи [17].
В аспекте влияния паразита на поведение хозяина в настоящее время широко обсуждается действие паразитических протистов Toxoplasma gondii на крыс
и мышей. Зараженные этим паразитом животные не только меньше боятся поедающего их хищника (кошки), но и сами ищут места, которые кошка посещает и «отмечает» их (мочится). Для паразита этот эффект благоприятен, поскольку он может размножаться половым способом только в организме кошки, то есть в том случае, когда его хозяин (крыса, мышь) будет съеден. Предполагается, что механизм этого изменения связан с повышением уровня дофамина у зараженных мышей [18, 19]. Есть сведения о том, что и в организме человека эти паразиты также оказывают влияние на его поведение. Однако возможность проведения соответствующих исследований на человеке ограничена по этическим соображениям.
Полученные в экспериментах in vitro результаты тем не менее свидетельствуют, что представители микробиоты человека способны поставлять ему такие нейромедиаторы как, например, у-аминомасляная кислота (ГАМК). Эта кислота образуется бактериями микрофлоры путем декарбоксилирования глутами-новой кислоты, которая и сама является нейроме-диатором. Глутаминовая кислота весьма важна для бактерий, поскольку служит не только структурным компонентом белков, но и используется в реакциях переаминирования для синтеза всех остальных аминокислот. В окружающую среду бактерии выделяют ее не от «хорошей жизни», а только в том случае, когда им необходимо быстро понизить кислотность внутриклеточного пространства. Если внеклеточная среда при этом обладает достаточной буферной емкостью, то глутаминовая кислота нейтрализуется, превращаясь в собственную соль. Возможна, однако, и другая ситуация, когда в результате изменения концентрации глутаминовой кислоты внешняя среда «закисляется». В этом случае имеется еще один вариант — клетки бактерий, используя собственные ферменты, осуществляют декарбоксилирование глутаминовой кислоты. В результате этого она теряет одну из двух кислотных функциональных групп, превращаясь в у-аминомасляную кислоту. С точки зрения бактерий, производящих эту кислоту только для того, чтобы понизить рН внеклеточной среды, ГАМК является относительно бесполезным соединением, однако ее появление в среде свидетельствует о наличии стрессовой для бактерий ситуации (закисление среды). Природа позаботилась о том, чтобы появление этого вещества в кишечнике хозяина приводило к такой его реакции, которая была бы полезна для микробов. Имеющиеся данные позволяют полагать, что у человека существует единая система, объединяющая действие ГАМК, синтезированной микробиотой, и ГАМК, произведенной в синапсах центральной нервной системы. Важным является и то, что бактериальная ГАМК, помимо всего прочего, влияет на моторную деятельность толстой кишки, приводя к изменению состава среды обитания бактерий [20, 21].
Кроме ГАМК и глутаминовой кислоты местные и системные эффекты могут оказывать такие бактериальные метаболиты, как серотонин, гистамин, норадреналин, дофамин, аспарагиновая кислота, ß-аланин, холин, алкилхолины, фосфорилхолин, цАМФ, цГМФ, масляная кислота и некоторые другие. Помимо самих нейромедиаторов в культуральной жидкости нормальных симбионтов обнаруживаются их предшественники и продукты утилизации.
Количество диоксифенилаланина (ДОФА, предшественник дофамина) в среде и биомассе E. coli может достигать одного микромоля. Этого вполне достаточно для воздействия на весь организм хозяина и, в особенности, на его нервную систему. По отношению к микроорганизмам нейротрансмиттеры могут выполнять функции аутостимуляторов роста [22]. Проникая в клетки хозяина нейромедиаторы и другие метаболиты микробиоты способны влиять на экспрессию генов или изменять характер их действия, участвуя тем самым в дифференцировке клеток. При этом в гистологически разных тканях одно и то же соединение способно по-разному влиять на одни и те же гены или же действовать на разные гены.
Помимо нейромедиаторов микробиота человека поставляет и ряд других регуляторных соединений, показательным примером которых является оксид азота (NO). В его образовании участвуют, например, факультативные анаэробы полости рта, восстанавливающие нитраты до нитритов, которые в желудке (при подкислении) образуют оксид и диоксид азота (NO2). Масляная кислота (бутират), образуемая в больших количествах бактериями микрофлоры, увеличивает экспрессию индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) [23], повышая тем самым производство NO клетками сосудистого эндотелия. Поскольку эндотелий является самым большим эндокринным органом, участвующим в контроле свертывания крови, тонуса сосудов, артериального давления, фильтрационной функции почек, сердечных сокращений, метаболического обеспечения мозга и других процессов, это означает, что метаболиты бактерий могут генерализованно влиять на функции практически всех систем и органов.
Кроме того, установлено, что короткоцепочеч-ные жирные кислоты (ацетат, пропионат, бутират), важнейшие метаболиты кишечной микробиоты, являются агонистами рецепторов свободных жирных кислот — FFAR3 (GPR41) и FFAR2 (GPR43), которые с недавних пор рассматриваются как потенциальные терапевтические мишени у пациентов с различными воспалительными заболеваниями и метаболическими расстройствами. В исследованиях показано, что КЖК, связывая рецепторы свободных жирных кислот энтероэндокринных L-клеток, могут стимулировать продукцию энтероглюкаго-на — глюкагоноподобного пептида-1 (ГПП-1, GLP-1), улучшающего секрецию инсулина и обладающего антидиабетическим эффектом. Посредством FFAR2 (GPR43) КЖК регулируют гомеостаз регуляторных T-клеток кишечника, препятствуя развитию колита, индуцируют хемотаксис нейтрофилов, а также могут подавлять воспаление в иммунных клетках [24]. Особое место среди КЖК занимает масляная кислота, которая не только является основным источником энергии для колоноцитов, но и оказывает выраженное иммуномодулирующее и противовоспалительное действие, предохраняя организм хозяина от развития воспалительных заболеваний не только кишечника, но и других органов. Помимо этого, бутират способен подавлять пролиферацию и активировать апоптоз клеток колоректальной карциномы и даже восстанавливать нарушенную активность ключевых ферментов цикла Кребса при митохондриальной дисфункции [25, 26].
Управляемый микробиоценоз как приоритетная задача клинической микробиотологии
Поддержание микроэкологического статуса организма человека (суперорганизма), по мнению проф. Е. И. Ткаченко,— одно из решающих условий здоровья, а дисбиоз — закономерное следствие практически любой патологии, а в ряде случаев и ее причина. Подтверждением справедливости этого утверждения является анализ изменения структуры заболеваемости за истекшее столетие: от инфекционной патологии — к так называемой «терапевтической», всплеск которой совпал с началом применения антибиотиков, изменивших микробиоту, ее регуля-торные влияния и, как следствие, структуру и функции различных органов. Это позволило вначале сформулировать представление о так называемых «терапевтических инфекциях» — слабовирулентной и слабопатогенной микробиоте, сосуществующей с организмом хозяина на принципах комменсализма или мутуализма, но способной, при наличии определенных факторов риска, приводить к развитию терапевтической патологии [27].
В последующем данные о локальных и системных эффектах микробиоты, ее трофических путях, взаимоотношениях внутри микробного сообщества и взаимодействии с организмом человека, полученные учеными различных специальностей, дали возможность рассматривать микробиоту уже как систему (или отдельный орган), участвующую в поддержании здоровья и развитии самых различных заболеваний. Результаты многочисленных экспериментальных и клинических исследований позволили сформулировать систему взглядов и теоретических положений как основу нового учения — клинической микробиотологии, а также обосновать важнейшие принципы структурно-функциональной организации микробиоты [28].
Состав микробиоты человека индивидуален и во многом определяется его генетическими особенностями [29]. Это было показано в различных исследованиях, в том числе и при сравнении микробиоты однояйцевых и разнояйцевых близнецов, а также братьев и сестер, воспитывавшихся вместе и порознь. Относительно низкое сходство было обнаружено и у проживающих вместе супругов.
Значительное влияние на состав микробиоты оказывает характер питания. Так, например, в фекалиях вегетарианцев содержится существенно меньше бактероидов и нередко отсутствует Faecalibacterium prausnitzii. Среди европейцев наибольшее количество F. prausnitzii отмечалось у шведов, которые больше всех в Европе потребляют мяса и рыбы [30]. Поскольку F. prausnitzii относится к основным компонентам микробиоты кишечника, эти результаты являются важным свидетельством зависимости состава микробиоты от характера питания.
Еще более интересный пример был получен при анализе микробиоты жителей Японии. В составе их микробиоты был обнаружен уникальный представитель бактероидов — Bacteroides plebius, имеющий в составе своего генома ген порфириназы, позволяющий расщеплять порфиран — сульфати-рованный углевод, содержащихся в порфире и других красных водорослях. Кроме того, по соседству
с геном порфириназы у B. plebius имеется 16 генов, связанных с перевариванием полисахаридов и только 6 из них оказались родственными генам других кишечных Bacteroides. Остальные гены, как и ген порфириназы, похожи больше всего на гены морских бактерий, питающихся водорослевыми полисахаридами. Предполагается, что B. plebius приобрела эти гены от морских бактерий путем горизонтального переноса. Известно 6 штаммов этой бактерии, причем все они обнаружены исключительно у жителей Японии. В геномах 24 других видов рода Bacteroides, которые обитают в кишечнике жителей других стран, нет ни порфириназ, ни других ферментов для расщепления специфических углеводов водорослей. Укоренение в микробиоте японцев вида B. plebius связано, по-видимому, с постоянным использованием в пищу сырых морепродуктов [31].
Состав микробиоты изменяется с возрастом человека. Изначально стерильный желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) новорожденного постепенно заселяется микробиотой матери и окружающей среды. Первыми в ЖКТ появляются эшерихии и энтерококки. И те, и другие являются факультативными анаэробами, легко переносят пребывание вне организма, а попадая в ЖКТ — обеспечивают условия для заселения более требовательных к окружению бактерий, таких как Bacteroides, Bifidobacterium и Clostridium. В первые дни после рождения в ЖКТ часто выявляются коринебакте-рии, лактобациллы, микрококки и пропионовокис-лые бактерии. В дальнейшем происходит сравнительно быстрое становление основной микробиоты, состав которой существенно зависит от характера питания младенца. При искусственном вскармливании микробиоценоз ребенка быстро становится похожим на микробиоценоз взрослого человека с преобладанием бифидобактерий и бактероидов и, в меньшей степени,— клостридий. У детей на грудном вскармливании состав микробиоценоза проще, и преобладают в нем только бифидобакте-рии [32]. Различия между грудным и искусственным вскармливанием почти исчезают на втором году жизни, когда состав фекальной микробиоты у детей начинает походить на ее состав у взрослых. В пожилом возрасте увеличивается содержание энтеробактерий, уменьшается количество бифидобактерий и других анаэробов. Состояние здоровья пожилых людей тем хуже, чем больше у них число бактерий семейства Enterobacteriaceae [30]. Что касается соотношения представителей основных бактериальных типов, то считается, что во взрослой популяции в составе микробиоты кишечника преобладают фирмикуты, а у детей и, возможно, пожилых и престарелых людей доминирующим бактериальным типом являются бактероиды. Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes у взрослых составляет около 4,0-6,0, достигая даже значений 10,0 и выше, в то время как у детей оно, как правило, меньше и может не превышать 1,0 [33]. Правда, о каких-либо общих закономерностях возрастных изменений данного соотношения говорить пока
еще рано, поскольку исследования малочисленны, а их результаты противоречивы [34].
Приведенные примеры свидетельствуют о том, что состав микробиоты человека может быть существенно изменен в результате определенных внешних воздействий, в том числе, возможно, и путем интродукции микроорганизмов, содержащихся в пробиотических препаратах и продуктах питания. Потенциально заселить кишечник лабораторных животных могут очень многие бактерии, включая те виды, которые не относятся к индигенной ми-кробиоте. На стадии формирования искусственного микробиоценоза у гнотобионтов эти бактерии легко приживаются и в последующем могут сохраняться в составе установившегося микробиоценоза неограниченно долго. Однако внедрить новый штамм в уже сформировавшийся микробиоценоз, даже если этот штамм является типичным представителем индигенной микробиоты, удается довольно редко. Это означает, что в поддержании состава микробиоты кишечника главную роль играют взаимодействия микроорганизмов друг с другом, а не с организмом хозяина [35]. Если удалить какую-либо индигенную бактерию из микробиоценоза, а затем попытаться интродуцировать ее в этот же микробиоценоз снова, то сделать это будет не легче, чем внедрить любую другую бактерию. Эффективное применение так называемых аутопробиотиков, содержащих аутологичные бактериальные штаммы (штаммы, выделенные от того же человека, которому они в последующем будут вводиться), наталкивается, таким образом, на те же самые сложности, что и попытка внедрения чужих бактерий, например, при трансплантации фекальной микробиоты от других доноров или клиническом применении промышленных пробиотических штаммов.
Как уже обсуждалось, бактерии обеспечивают иммунную защиту хозяина. Эта функция не является для них основной, а связана лишь с необходимостью сохранить собственную экологическую нишу. Согласно имеющимся данным, определенные виды бактерий способны обеспечить защиту хозяина от многих инфекционных заболеваний, включая СПИД, а также значительно уменьшить риск развития онкологических заболеваний. Эти микроорганизмы, однако, встречаются только у некоторых членов человеческой популяции, и, будь они в наличии у всех ее представителей, мы бы чувствовали себя гораздо более защищенными от инфекций, чем в настоящее время. Решение проблемы повышения иммунной защиты организма-хозяина за счет микробиоты упирается в отсутствие методов интродукции «полезных» бактерий в микробиоценозы человека.
Относительно ряда микроорганизмов (например, патогенных и условно-патогенных) мы определенно знаем, что их присутствие в ЖКТ нежелательно. Это значит, что наряду с методами интродукции следует разрабатывать и методы направленной элиминации бактерий, альтернативные современной антибактериальной терапии. Все это позволяет полагать, что выживание человека в современном мире непосредственно связано с решением задачи управляемого микробиоценоза, которая является принципиально разрешимой и требует при этом значительно меньше
вложений, чем на разработку, например, косметических средств.
По некоторым данным состав микробиоценоза человека насчитывает до 2000 различных штаммов. Чтобы осознанно управлять этой сложной системой, необходимо иметь информацию о том, какие функции выполняют все ее члены, учитывая при этом особенности их метаболизма и характер функциональных и трофических связей как между собой, так и с хозяином. Ситуация осложняется еще и тем, что большинство микроорганизмов представлены некультивируемыми формами, не способными расти на известных в настоящее время питательных средах. Можно полагать, что некультивируемые бактерии — это именно те бактерии, которые вместе с человеком прошли весь его сложный эволюционный путь, утратив при этом способность расти вне организма хозяина. Скорее всего, именно они являются истинными симбионтами и полноправными членами суперорганизма. Благополучие истинных симбионтов, однако, зависит от бактерий-«сожи-телей», способных расти как в организме человека, так и вне его, и обеспечивающих постоянство среды обитания для микроорганизмов, утративших способность жить вне организма хозяина.
Именно на эти культивируемые бактерии существует возможность целенаправленно влиять, полагая, что необходимые условия для существования некультивируемых форм они способны обеспечить самостоятельно. Низкая активность микроорганизмов может быть связана со многими причинами, например с характером питания хозяина, образом его жизни, приемом антибиотиков или наличием в ЖКТ специфических штаммов-антагонистов, подавляющих их активность. И все же основной причиной, как правило, являются биологические особенности самих штаммов, не позволяющие им занять «достойное» место в экологической нише. Прежде всего, это низкая скорость роста, чувствительность к факторам антагонизма других бактерий и недостаточная эффективность собственных факторов антагонизма. Кардинальным решением этого вопроса является замена таких малоактивных штаммов на более активные и эффективные.
Исходя из этих положений, задача управляемого микробиоценоза приобретает вполне реалистический характер. Для ее решения, прежде всего, следует разработать способы внедрения тех культивируемых бактерий, которые могут принести доказанную пользу, например, штаммов, обеспечивающих иммунную защиту человека, а также ауто-логичных штаммов, предварительно выделенных и сохраненных в специализированном банке. Такие штаммы могут быть использованы для восстановления исходного микробиоценоза, например, после интенсивного курса антимикробной терапии.
В процессе изучения и методы трансплантации фекальной микробиоты от других доноров (здоровых добровольцев). Несмотря на объективные сложности при интродукции чужих бактерий в микробиоценоз кишечника пациента, в отдельных исследованиях получены весьма обнадеживающие результаты. Так, например, через 4, 8 и даже 24 недели после так называемой фекальной бактериотерапии
(эндоскопическое введение в кишечник реципиента суспензии фекалий от здоровых доноров) микробные популяции в кале пациентов состояли в основном из бактерий, полученных от здоровых добровольцев [36]. В США создан банк образцов фекалий (OpenBiome), полученных от здоровых доноров, для использования в терапии пациентов с тяжелыми формами рецидивирующей диареи, вызванной антибиотикоустойчивыми штаммами Clostridium difficile (www.openbiome.org). С сентября 2013 г. по февраль 2014 г. банк OpenBiome предоставил 13 больницам и клиникам США 135 доз фекальных образцов (по цене 250 долларов за дозу), соответствующим образом протестированных, отфильтрованных, замороженных и готовых к клиническому применению. [37].
В хорошо сбалансированном микробиоценозе внедрение нового члена часто сопровождается вытеснением одного или нескольких старых членов. Таким образом, при разработке методов интродукции одновременно будет происходить накопление данных о закономерностях сукцессии и элиминации штаммов из микробиоты. В конечном итоге движение исследовательской мысли в этом направлении должно привести к созданию способов элиминации нежелательных бактерий, например, патогенных микроорганизмов на стадии носительства или же на острой стадии инфекционного процесса.
С точки зрения биотехнологии интродукция бактерий в микробиоценоз человека или животных является, по сути, пересевом с одной среды на другую. Этот процесс обычно сопровождается более или менее длительным периодом адаптации клеток, так называемым лаг-периодом. Короткий лаг-период наблюдается в том случае, если состав обеих сред и условия выращивания на них практически идентичны. Это означает, что если целью работы является интродукция бактерии в микробиоценоз толстой кишки, то соответствовать этой экологической нише должны и питательная среда, и аппарат, в котором проводится выращивание. Наилучшим образом условия толстой кишки можно воспроизвести в реакторе идеального вытеснения, разработанном для проведения химических процессов и представляющем собой длинную термостатированную трубку, которую при необходимости заполняют насадкой. Насадка может содержать катализаторы реакций, добавки или просто представлять собой инертный наполнитель. Реактор действует непрерывно, при этом на его вход подают исходные компоненты, а на выходе получают продукты реакции. Если реактор используется для выращивания микроорганизмов, то на его вход непрерывно подают питательную среду и посевную культуру, смешиваемые в нужной пропорции. Эта смесь продвигается внутри реактора со сравнительно небольшой скоростью. Бактерии в это время потребляют питательный субстрат и размножаются. При правильно выбранном режиме к моменту выхода из реактора культура успевает использовать весь субстрат, перемещавшийся с ней в том же элементарном объеме, и, соответственно, достигает стационарной фазы роста.
Используя такой стеклянный реактор, группе исследователей удалось получить искусственный
микробиоценоз (continuous flow culture, CFC), весьма похожий на микробиоценоз человека и развивающийся по тем же законам. Культура в реакторе, как и в кишечнике, состояла из множества взаимодействующих видов бактерий и характеризовалась обильным пристеночным ростом. Поскольку механизмы адгезии бактерий к стеклянным стенам реактора и к стенке кишечника имеют мало общего, основной причиной пристеночного роста авторы считают прикрепление микроорганизмов друг к другу, то есть образование биопленки, а не способность индивидуальных бактерий прикрепляться к клеткам кишечного эпителия [35].
Аналогия толстой кишки с химическим реактором на этом не кончается. На входе в толстую кишку, сразу после илеоцекального клапана, находится слепая кишка, концентрация микроорганизмов в которой значительно выше, чем в предыдущих отделах ЖКТ. Судя по всему, микробиота слепой кишки представляет собой некое «депо» факультативно анаэробных бактерий (преимущественно кишечной палочки и представителей группы Lactobacillus-Enterococcus), доля которых достигает 50 % (анализ по 16S рРНК). Кроме того, в слепой кишке существенно больше бактероидов, чем в расположенной выше подвздошной кишке, а также представлены клостридии, полностью в тонкой кишке отсутствующие. Общая же доля представителей бактероидов (Bacteroides, Porphyromonas и Prevotella spp.) и клостридий (Clostridium, Eubacterium и Ruminococcus spp.), являющихся строгими анаэробами, в слепой кишке относительно невелика и составляет около 13 % [38].
С точки зрения биотехнологии слепая кишка (вместе с аппендиксом) представляет собой небольшой (ее длина, как и поперечник, составляет в среднем 5-8 см) биореактор, обеспечивающий постоянное поступление микроорганизмов в толстую кишку. Продвигаясь далее по толстой кишке бактерии размножаются, в результате чего их содержание в просветной и пристеночной микробиоте увеличивается. Доля строгих анаэробов также повышается, достигая в прямой кишке 44 % от общего числа фекальных бактерий (анализ по 16S рРНК), в то время как доля факультативных анаэробов падает до 7 % [38]. Сравнение пристеночной микробиоты из дистального отдела подвздошной кишки, восходящей ободочной кишки и прямой кишки показало, что численность бактероидов в этом направлении возрастает с 27 до 49 %, клостридий кластера XIVa — с 20 до 34 %, а клостридий кластер а IV с 7 до 13 % [39].
Почему же бактерии при пересеве с одной среды на другую и при изменении условий выращивания нуждаются в длительной адаптации? Поиски ответа на этот вопрос занимали микробиологов по крайней мере с начала прошлого века, однако удовлетворительный ответ был получен совсем недавно. Произошло это во многом благодаря появлению новой парадигмы, согласно которой поведение бактерий рассматривают с биосоциальных позиций, то есть практически с тех же, что поведение человека и животных [22]. В рамках этой парадигмы популяции бактерий представляют собой
организованные группы, согласованно развивающиеся и отвечающие на воздействия извне благодаря наличию многочисленных внутригрупповых межклеточных связей. Теоретически эти связи могут быть любыми — тактильными, полевыми
(осуществляться при помощи электростатических или электромагнитных полей), акустическими (например, ультразвуковые сигналы), но на практике до настоящего времени достоверно известно лишь о химической коммуникации.
Экзометаболиты бактерий и их регуляторные функции
История изучения химической коммуникации микроорганизмов уходит своими корнями в начало прошлого века. В 1901 году студент 3 курса Лёвенского (Лувенского) университета (КаШоНеке ишуе^НеИ: Leuven, Лёвен, Бельгия) Е. Вильдье (Е. ШШ1еге) выполнил работу, в которой показал, что после засева клетки дрожжей выделяют в среду определенные вещества, названные им «биосом» (греч.— жизнь), которые способствуют их росту и брожению, но не являются при этом основными источниками питания микроорганизмов [40]. Это открытие в последующем оказалось одной из важных вех в истории микробиологии, послужив отправной точкой для изучения витаминов.
Бактериям повезло меньше. Изучая их рост, Отто Ран в 1906 году также пришел к выводу, что продолжительность периода адаптации бактерий (лаг-периода) и скорость их роста определяются концентрацией неких веществ, образуемых и выделяемых в среду самими бактериями. Чем больше этих соединений в среде, тем быстрее завершается адаптация бактерий, и начинается их рост. Установить химическую природу этих веществ, получивших название аутостимуля-торов роста бактерий, оказалось не так просто. Попытки их идентификации растянулись на целое столетие [41, 42], причем последняя из них была предпринята относительно недавно в лаборатории известного британского биохимика и апологета современной метаболомики Дугласа Келла и также окончилась неудачей [43]. Начиная эту работу, Келл, по-видимому, не знал, что некоторые из аутостимуляторов уже идентифицированы в Санкт-Петербургском институте особо чистых биопрепаратов [44, 45, 46]. По существу в лаборатории Келла в сокращенном варианте были проделаны те же эксперименты, что и исследователями из Санкт-Петербурга, однако искомая активность на заключительном этапе очистки была потеряна. Можно полагать, что произошло это по нескольким причинам. Во-первых, авторы искали только одно вещество и не были готовы к значительной потере активности из-за разделения нескольких соединений, действующих синергично. Во-вторых, авторы, насколько можно судить по публикации, не обладали надежными методами тестирования биологической активности, позволившими бы выявить эту активность даже при частичной ее потере. И, наконец, в-третьих, авторы, вероятно, рассчитывали открыть принципиально новое вещество, однако в исследуемых фракциях его не обнаружили.
Регуляцию химическими соединениями обычно связывают с действием специализированных веществ, не участвующих в конструктивном метаболизме или в каких-либо иных (не регуляторных)
процессах. К специфическим регуляторам у бактерий относят, прежде всего, регуляторы «чувства кворума» (quorum sensing) — ацилированные лак-тоны гомосерина, короткие пептиды и некоторые другие соединения [41, 47]. Полученный авторами результат, однако, совсем не укладывался в эти рамки: первыми идентифицированными ауто-стимуляторами роста изучавшегося ими пробио-тического штамма E. coli M-17 оказались янтарная и глутаминовая кислоты. Изучение свойств других метаболитов, выделяемых бактериальными клетками (экзометаболитов), показало, что многие из них также выполняют важные регуляторные функции [44-46].
Так у E. coli M-17 функции аутостимуляторов роста, помимо янтарной и глутаминовой кислот, могут выполнять уксусная кислота (точнее ее соль — ацетат) или аминокислоты лизин и метио-нин, функции аутоингибиторов роста — уксусная, молочная, муравьиная и аспарагиновая кислоты. Цистеин и метионин являются регуляторами редокс-потенциала. Глицин при определенных условиях выполняет функции регулятора бактериального апоптоза. Кроме того, существуют еще и метаболиты-синергисты, которые действуют только вместе, а поодиночке практически не влияют на рост культуры. Одно и то же соединение при этом может иметь несколько функций. Какую именно функцию оно будет выполнять, зависит от конкретной физиологической или экологической ситуации (стадия роста или голодания), его концентрации, концентрации других соединений, условий окружающей среды и ряда иных факторов. Так, например, ацетат при низких и средних концентрациях стимулировал рост культуры, а при высоких — подавлял его. Совокупное действие композиции из нескольких аутостимуляторов при этом было значительно выше, чем каждого из них. Кроме того, ее активность была выше при наличии в среде «нейтральных» соединений и даже «ингибиторов» роста. Добавление ацетата к смеси метаболитов-ингибиторов приводило к изменению знака самого эффекта — замене ингибирующего действия на стимулирующее. Свойства ацетата позволили предположить, что он является плот-ностно-зависимым фактором, влияющим на смену фаз развития культуры и обеспечивающим «чувство кворума» у E. coli M-17. В пользу этого предположения свидетельствовала и динамика ацетата в процессе роста культуры [41, 42].
В разных ситуациях одни и те же функции могут выполнять различные соединения. Так, например, при пересеве быстро растущей культуры E. coli M-17 функции стимулятора ее роста в новой среде будет выполнять ацетат. Если же на свежую среду пересеять голодающую культуру, то вместо ацетата аналогичные функции будет выполнять сукцинат.
Одни и те же метаболиты по-разному действуют на бактерии разных штаммов и видов. Аспарагино-вая кислота ингибировала рост E. coli M-17, но при этом являлась стимулятором роста E. coli BL, индол и гистидин ингибировали рост обеих эшерихий, но не влияли или слабо стимулировали рост Salmonella enteritidis, лактат не влиял на рост E. coli M-17 или слабо стимулировал его, но подавлял рост E. coli BL и S. enteritidis и т.д. Все это позволило предположить, что метаболиты играют важную роль в экологических взаимоотношениях бактерий [42].
Многочисленные эксперименты по выращиванию различных бактерий на разных средах и в различных условиях показали, что в процессе роста клетки постоянно обмениваются метаболитами с окружающей средой, причем этот процесс начинается сразу после засева культуры на свежую среду. Часть соединений при этом быстро поглощается клетками, а другие метаболиты выделяются в окружающую среду. В результате уже в первые минуты после засева формируется новая среда, содержащая аутостимуляторы роста и максимально способствующая росту культуры. Если клеток мало, они сильно истощены или не способны выделить нужное количество аутостимуляторов роста по какой-то другой причине (или/и поглотить из среды соединения, тормозящие их рост), то рост не начнется до тех пор, пока не установится необходимый для его инициации состав экзометаболитов. Необходимое для завершения этого процесса время называется, как уже отмечалось, лаг-периодом [41, 42].
Наличие биологической активности у выделяемых клетками метаболитов никак не согласуется с господствовавшей до недавнего времени теорией, согласно которой в окружающую среду выделяются только (или преимущественно) те соединения, которые являются невостребованными продуктами метаболизма (по сути, «отбросами»), образующимися в избытке из-за несбалансированности внутриклеточных биосинтетических процессов. Другим аргументом против теории «несбалансированности» являются результаты, полученные при изучении динамики (то есть изменений концентраций) экзометаболитов в процессе культивирования бактерий. Как было установлено в многочисленных экспериментах, ни одно из соединений не имело динамики, позволяющей считать их избыточными или невостребованными продуктами метаболизма. Даже простейшие карбоновые кислоты, такие как уксусная или муравьиная, на одних стадиях роста выделялись культурой, а на других — поглощались. Некоторые
Низкомолекулярные метаболиты в
Какое же отношение имеют метаболиты к выращиванию бактерий в реакторе идеального вытеснения или к их росту в кишечнике хозяина? По всей видимости,— самое непосредственное. Как следует из приведенных выше данных, каждый этап роста культуры и каждый способ ее выращивания характеризуется собственным набором экзометаболитов. Если культуру из среды с одним набором экзометаболитов перевести в среду с другим набором этих соединений, то ей потребуется
аминокислоты в процессе роста культуры выделялись и поглощались бактериями по несколько раз. Иногда весь процесс выделения-поглощения занимал не более 1 часа (время между отборами проб среды). Поскольку для бактериальной культуры это сравнительно короткий промежуток времени, невольно напрашивается аналогия между выделением-поглощением метаболитов и передачей сигнала через синаптическую щель между нейронами путем выделения и обратного захвата нейромедиаторов [48, 49].
Все эти данные позволяют полагать, что эк-зометаболиты необходимы бактериям не только для инициации роста, но и для его поддержания на всех стадиях. Однако наиболее убедительным доказательством последнего являются эксперименты с диализными культурами, показавшие, что удаление экзометаболитов путем постоянного диализа среды выращивания бактерий приводит к замедлению их роста. Эти же эксперименты показали, что остановка роста также связана с накоплением метаболитов, поскольку их удаление, хотя и замедляет рост, но позволяет при этом получать культуры сверхвысокой плотности (около 150 х 109 кл/мл), то есть практически пастообразную биомассу. Ингибирование роста экзометаболитами — это экологически обоснованная тактика поведения популяций организмов, позволяющая избежать перенаселенности даже при избытке питательного субстрата. Метаболиты не просто тормозят рост, а коренным образом меняют физиологию бактерий, причем основной целью этих изменений является повышение устойчивости клеток к стрессовым воздействиям [50]. В специально проведенных экспериментах было показано, что высокие концентрации одного из основных метаболитов E. coli, ацетата, приводят к повышенной экспрессии по крайней мере 37 белков и понижению экспрессии 60 других ферментов. Повышали экспрессию транспортные белки, переносчики аминокислот и пептидов, ферменты метаболизма, стрессовые белки, белки стационарной фазы, а также белок LuxS, ответственный за синтез аутоиндуктора «чувства кворума» АИ-2. В результате выживаемость бактерий в экстремальных условиях повышалась в 50-400 раз. Другой метаболит, формиат, подавлял синтез 10 из 37 индуцированных ацетатом белков. Имеются сведения об аналогичном регуляторном действии рН, пропионата, бутирата и синергическом действии pH и КЖК [51, 52]. Эти результаты объясняют механизмы индивидуального действия и взаимовлияния экзометаболитов.
клинической практике
некоторое время, чтобы адаптироваться к новым условиям, и только после этого рост возобновится. Если же состав экзометаболитов в обеих средах близок или даже идентичен, культура продолжит свой рост без какой-либо задержки. Именно эта ситуация наблюдается при интродукции культуры в ЖКТ реципиента непосредственно из реактора идеального вытеснения.
О том, что экзометаболиты выполняют важные функции в развитии популяций бактерий
стало ясно уже к концу 1980-х годов [53]. Примерно тогда же Т. Я. Вахитовым было высказано предположение, что культуральные жидкости, полученные при выращивании пробиотических бактерий, могут быть использованы для повышения эффективности бактериальных препаратов или даже в качестве самостоятельных средств для нормализации микробиоты человека. Полученные в последующем экспериментальные данные подтвердили это предположение и послужили основой для разработки двух метаболитных препаратов — АРК-1 и АРК-2 [41].
Технология приготовления этих препаратов включала получение культуральной жидкости (КЖ) бактерий с высоким содержанием аутостимуляторов роста, ультрафильтрацию КЖ — для удаления высокомолекулярных балластных веществ и ее лиофильное высушивание. КЖ для приготовления АРК-1 получали при выращивания пробиотических бактерий E. coli M-17 в ферментере в специально подобранных условиях, а для приготовления АРК-2 — в процессе голодания культур E. coli M-17 при высокой концентрации клеток. Способ получения АРК-2 отличался большей сложностью, но и сам препарат при этом был значительно активнее: его минимальная действующая концентрация составляла около 10 мкг/мл.
В дальнейшем, после идентификации аутости-муляторов роста, удалось показать, что активность препаратов зависит от совокупного действия содержащихся в них низкомолекулярных карбоно-вых кислот (янтарная, молочная, уксусная, муравьиная) и аминокислот (глутаминовая кислота, лизин, метионин и др.). В подтверждение этого был разработан препарат «Актофлор-С», содержащий 13 экзометаболитов пробиотических бактерий и существенно (в 8-15 раз) превосходящий по активности все свои прототипы. Более высокая активность актофлора-С объяснялась отсутствием балластных веществ и оптимальным соотношением биологически активных компонентов [41, 47].
Так же как и его прототипы, актофлор-С селективно стимулировал рост E. coli M-17 и других пробиотических бактерий (лактобациллы и бифи-добактерии), повышал уровень антагонистической активности пробиотических штаммов в отношении патогенных микроорганизмов, при добавлении в смешанные жидкие культуры патогенных и пробиотических бактерий способствовал вытеснению первых. Препараты АРК обладали имму-номодулирующим действием, ускоряли развитие новорожденных животных, оказывали общий оз-доравливающий эффект, успешно использовались для нормализации микробиоты кишечника у больных хроническими мочеполовыми хламидиозами, были эффективны при лечении сальмонеллезной инфекции у животных. Хорошие результаты показало использование актофлора-С при лечении подростков, больных пневмонией [54].
Помимо «чистых» метаболитных препаратов, имеется успешный опыт использования комбинированных препаратов, содержащих, наряду с метаболитами, пребиотические вещества или про-биотические штаммы. Так, относительно недавно
в клиническую практику был введен пероральный комбинированный препарат масляной кислоты (бутирата) и инулина с непосредственной доставкой действующих веществ в толстую кишку. Как уже сообщалось выше, бутират является основным энергетическим субстратом для слизистой оболочки кишечника, модулирует воспалительные процессы и клеточную дифференциацию, стимулирует физиологическую пролиферацию эпителия кишечника, образование слизи и усиливает микроциркуляцию в слизистой оболочке. Последние исследования показали, что бутират также восстанавливает плотные контакты при нарушениях кишечного барьера, характерных для воспалительных заболеваниях кишечника (ВЗК), влияя на экспрессию клаудина-2, окклюдина, внутриклеточных PDZ-белков Zonula occludens (ZO-1, ZO-2) и так называемого re-PDZ-белка цингулина путем ингибирования ФНО-а и интерлейкина-13 (ИЛ-13) [55]. В результате метаболизма инулина, наиболее изученного на сегодняшний день пребио-тика, также образуется эндогенная масляная кислота и стимулируется рост полезной микрофлоры (бифидо- и лактобактерий). Инновационная лекарственная форма препарата на основе полимерной мультиматриксной системы (NMX) обеспечивает высвобождение действующих веществ на протяжении всей толстой кишки.
Терапевтическая эффективность препарата при воспалительных заболеваниях кишечника подтверждена целым рядом клинических исследований, показавших, что пероральный бутират в комбинации с месалазином безопасен, хорошо переносится и может повысить эффективность стандартной терапии при активном язвенном колите. Assisi R. F. et al. (2008) также продемонстрировал эффективность комбинированной терапии месалазином и бутиратом в комбинации с инулином (3 табл. в день) у 196 пациентов с легкими/ среднетяжелыми формами язвенного колита. Добавление бутирата/инулина к месалазину привело к достоверной редукции клинических симптомов уже через 2 мес. Через 6 мес терапии 86 % пациентов (в отличие от ожидаемых 60-65 %) находились в фазе клинической ремиссии [56].
В недавнем клиническом метаболомическом исследовании нами было показано, что применение бутирата в комбинации с инулином на фоне базисной терапии месалазином у больных язвенным колитом улучшает клиническую симптоматику, метаболомический профиль сыворотки крови, и показатели микробиоценоза, достоверно устраняя анаэробный дисбаланс, повышая долю бутират-продуцирующих бактерий и нормализуя патологически повышенный уровень янтарной кислоты, связанной с воспалением [57, 58].
Дисбиоз толстой кишки, являющийся одним из ведущих патогенетических факторов ВЗК, приводит к серьезным метаболическим сдвигам в организме человека. Одним из таких изменений является повышение уровня дикарбоновых кислот (янтарной и фумаровой). Согласно современным представлениям, янтарная кислота микробного происхождения рассматривается
как провоспалительная сигнальная молекула, индуцирующая воспаление, а уровень янтарной кислоты в крови — как один из возможных маркеров воспаления и гипоксии [59, 60]. Прием комбинированного препарата бутирата и инулина в течение 4 недель на фоне базисной терапии приводил к достоверной нормализации патологически повышенного уровня янтарной кислоты у больных язвенным колитом, подтверждая гипотезу о возможности бутирата модулировать активность ключевых ферментов цикла Кребса [26]. Количественная оценка состояния микробиоценоза толстой кишки выявила достоверное устранение анаэробного дисбаланса (снижение доли бактероидов, связанных с хроническим воспалением, что отражалось в уменьшении соотношения Bacteroides fragilis/Faecalibacterium prausnitzii до нормальных значений — < 80), повышение доли некультивируемых бутират-про-дуцирующих бактерий (примерно в 1,5 раза) и уменьшение количества условно-патогенных микроорганизмов (Escherichia coli, Clostridium difficile, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis/ vulgaris, Staphylococcus aureus) у пациентов с язвенным колитом, получавших бутират/инулин в дополнение к базисной терапии. Стоит отметить, что повышение доли бутират-продуцирующих бактерий, играющих ключевую роль в энергетическом обеспечении кишечного эпителия, а также положительная динамика соотношения Bacteroides fragilis/Faecalibacterium prausnitzii на фоне приема масляной кислоты и инулина наблюдались и в группе практических здоровых лиц [61].
Открытым оставался вопрос о возможности использовать биологически активные экзометаболи-ты для повышения эффективности бактериальных пробиотических препаратов, в том числе и для обеспечения интродукции пробиотических бактерий в ЖКТ хозяина. С этой целью был разработан препарат «Витафлор-форте», содержащий помимо всех компонентов бактериального пробиотика «Витафлор» (штаммы Lactobacillus acidophilus Д-75 и Д-76) [62 Петров Л. Н. и др., 2008] еще и основные
Заключение
Основываясь на приведенных в работе материалах, авторы статьи видят широкие перспективы для разработки новых высокоэффективных бактериальных, метаболитных и бактериаль-но-метаболитных препаратов — пробиотиков и метабиотиков (в том числе метапребиотиков и метапробиотиков). Для реализации этих перспектив необходимо разработать комплексную программу, сосредоточив усилия ведущих специалистов не столько на создании новых пробиотических препаратов коммерческого назначения, сколько на разработке научных основ и методов интродукции и элиминации бактерий из микробиоценозов. Необходимым условием для этого является возможность проводить эксперименты на гнотобионтах, создавая модельные микробиоценозы и изучая на этих моделях закономерности интродукции и элиминации бактерий из
метаболиты пробиотических бактерий, такие как ацетат, формиат, сукцинат и некоторые другие. Исследование его свойств показало, что бактерии в составе препарата менее чувствительны к лио-фильному высушиванию и другим повреждающим факторам, быстрее реактивируются в энтеральных средах и обладают более высокой антагонистической активностью в отношении патогенной микрофлоры. При сальмонеллезной инфекции у мышей витафлор-форте обладал существенно большей эффективностью, чем витафлор.
Имеющиеся в литературе, а также собственные экспериментальные данные позволяют полагать, что предел совершенствования бактериальных пробиотиков еще не достигнут. Дальнейшие улучшения, по нашему мнению, могут быть осуществлены путем расширения штаммовой формулы препаратов (с 1-2 до 3-4 и более штаммов бактерий), использования более адекватных условий выращивания микроорганизмов, приближенных к условиям роста в кишке (реактор полного вытеснения), а также путем введения в состав препарата микрочастиц сорбента. Бактерии, иммобилизованные на сорбенте, имеют дополнительную степень защиты и, благодаря этому, лучше реактивируются при попадании в ЖКТ. Можно полагать, что процесс реактивации будет ускоряться также и за счет «группового» поведения («чувства кворума») близко расположенных на сорбенте клеток. Для более полной реализации «чувства кворума», однако, необходимо, чтобы бактерии находились как можно ближе друг к другу, для чего необходимо разработать более емкие сорбенты с меньшим размером частиц. В комплексном бактериально-ме-таболитном препарате сорбент будет выполнять и еще одну функцию — сорбировать введенные в состав препарата метаболиты, а затем медленно высвобождать их по мере необходимости. Привлекательной является идея биоразлагаемого сорбента, который, в дополнение ко всему, будит служит еще и источником питания, причем не только для интродуцируемых бактерий, но и для представителей резидентной микрофлоры хозяина.
ЖКТ. Кроме того, авторам представляется, что подобная программа могла бы стать приоритетным национальным проектом, тем более что основоположником пробиотикотерапии является наш великий соотечественник И. И. Мечников. Управляемый микробиоценоз — это то направление, в котором Россия остается конкурентоспособной. В отличие от многих других научных программ, требующих основательной приборной и технологической базы, разработка методов управляемого микробиоценоза не требует значительных вложений, а при правильной организации работ уже в недалеком будущем сможет принести ощутимые прибыли, вытеснить с рынка иностранные продукты, не имеющие доказанных лечебных или профилактических свойств, и, в конечном итоге, способствовать оздоровлению нации.
Литература
1. Lederberg J. Infectious history // Science.—2000.— Vol. 288, Issue 5464.— P. 287-293.
2. Марков А. В. Рождение сложности. Эволюционная биология сегодня. Неожиданные открытия и новые вопросы / Элементы.— М.: Астрель, Corpus, 2010.— 552 с.
3. Nakabachi A., Yamashita A., Toh H., Ishikawa H., Dunbar H. E., Moran N. A., Hattori M. The 160-kilobase genome ofthe bacterial endosymbiont Carsonella // Science.—
2006.— Vol. 314, Issue 5797.— P 267.
4. Gil R., Sabater-Munoz B., Latorre A., Silva F. J., Moya A. Extreme genome reduction in Buchnera spp.: toward the minimal genome needed for symbiotic life // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.— 2002.— Vol. 99, No. 7.— P. 4454-4458.
5. Newton I. L., Woyke T., Auchtung T. A., Dilly G. F., Dut-ton R. J., Fisher M. C., Fontanez K. M., Lau E., Stewart F. J., Richardson P. M., Barry K. W., Saunders E., Detter J. C., Wu D., Eisen J. A., Cavanaugh C. M. The Calyptogena magnifica chemoautotrophic symbiont genome // Science.—
2007.— Vol. 315, Issue 5814.— P. 998-1000.
6. Hongoh Y., Sharma V. K., Prakash T., Noda S., Toh H., Taylor T. D., Kudo T., Sakaki Y., Toyoda A., Hattori M., Ohku-ma M. Genome of an endosymbiont coupling N2 fixation to cellulolysis within protist cells in termite gut // Science.—
2008.— Vol. 322, Issue 5904.— P. 1108-1109. doi: 10.1126/ science.1165578.
7. Eckburg P. B., Bik E. M., Bernstein C. N., Purdom E., Deth-lefsen L., Sargent M., Gill S. R., Nelson K. E., Relman D. A. Diversity of the human intestinal microbial flora // Science.— 2005.— Vol. 308, Issue 5728.— P. 1635-1638.
8. Hong P. Y., Wu J. H., Liu W. T. Relative abundance of Bacteroides spp. in stools and wastewaters as determined by hierarchical oligonucleotide primer extension // Appl. Environ. Microbiol.— 2008.— Vol. 74, No. 9.— P. 2882-2893. doi: 10.1128/AEM.02568-07.
9. Малахов В. В., Галкин С. В. Вестиментиферы — бескишечные беспозвоночные морских глубин.— М.: KMK Sсiеntific Press Ltd, 1998.— 205 с.
10. Шендеров Б. А. Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т.—М.: Грантъ, 1998, 2001.
11. Nakamura N., Lin H. C., McSweeney C.S., Mackie R.I., Gas-kins H. R. Mechanisms of microbial hydrogen disposal in the human colon and implications for health and disease // Annu. Rev. Food Sci. Technol.— 2010.— Vol. 1.— P. 363-395.
12. Flint H. J., Scott K. P., Duncan S. H., Louis P., Forano E. Microbial degradation of complex carbohydrates in the gut // Gut Microbes.— 2012.— Vol. 3, No. 4.— P. 289-306.
13. Белобородова Н. В. Интеграция метаболизма человека и его микробиома при критических состояниях // Общая реаниматология.— 2012.— Т. VIII, № 4.— С. 42-54.
14. Everard A., Belzer C., Geurts L., Ouwerkerk J. P., Druart C., Bindels L. B., Guiot Y., Derrien M., Muccioli G. G., Del-zenne N. M., de Vos W. M., Cani P. D. Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.— 2013.— Vol. 110, No. 22.— P. 9066-9071.
15. Tremaroli V., Backhed F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism // Nature.—2012. — Vol. 489, Issue 7415.— P. 242-249.
16. Шварц С. С., Пястолова О. А., ДобринскаяЛ. А., Рунко-ва Г. Г. Эффект группы в популяциях водных животных и химическая экология.— М.: Наука, 1976.— 152 с.
17. Shi W., Guo Y., Xu C., Tan S., Miao J., Feng Y., Zhao H., St. Leger R. J., Fang W. Unveiling the mechanism by which microsporidian parasites prevent locust swarm behavior // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.— 2014.— Vol. 111, No. 4.— P. 1343-1348.
18. Berdoy M., Webster J. P., Macdonald D. W. Fatal attraction in rats infected with Toxoplasma gondii // Proc. Biol. Sci.— 2000.— Vol. 267, No. 1452.— P. 1591-1594.
19. Kaushik M., Knowles S. C., Webster J. P. What makes a feline fatal in Toxoplasma gondii's fatal feline attraction? Infected rats choose wild cats // Integr. Comp. Biol.— 2014. — Vol. 54, No. 2.— P. 118-128.
20. Бабин В. И., Домарадский И. В., Дубинин А. В., Кондра-кова О. А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры // Рос. хим. ж.— 1994.— Т. 38, № 6.— С. 67-78.
21. Barrett E, Ross RP, O'Toole PW, Fitzgerald GF, Stanton C. y-Aminobutyric acid production by culturable bacteria from the human intestine // J. Appl. Microbiol.— 2012.—Vol. 113, No. 2.— P. 411-417.
22. Олескин А. В. Нейрохимия и симбиотическая микрофлора человека: биополитические аспекты // Вестн. Рос. акад. наук.— 2009.— Т. 79, № 5.— С. 431-438.
23. Morikawa A, Sugiyama T., Koide N., Mori I., Mu M. M., Yoshida T., Hassan F., Islam S., Yokochi T. Butyrate enhances the production of nitric oxide in mouse vascular endothelial cells in response to gamma interferon // J. Endotoxin Res.— 2004.— Vol. 10, No. 1.— P. 32-38.
24. Cani P. D., Everard A., Duparc T. Gut microbiota, enteroen-docrine functions and metabolism // Curr. Opin. Pharmacol.— 2013.— Vol. 13, No. 6.— P. 935-940.
25. Singh N., Gurav A., Sivaprakasam S., Brady E., Padia R., Shi H., Thangaraju M., Prasad P. D., Manicassamy S., Munn D. H., Lee J. R., Offermanns S., Ganapathy V. Activation of Gpr109a, receptor for niacin and the commensal metabolite butyrate, suppresses colonic inflammation and carcinogenesis // Immunity.— 2014.— Vol. 40, No. 1.— P. 128-139.
26. Valvassori S. S., Calixto K. V., Budni J., Resende W. R., Varela R. B., de Freitas K. V., Gongalves C. L., Streck E. L., Queve-do J. Sodium butyrate reverses the inhibition of Krebs cycle enzymes induced by amphetamine in the rat brain // J. Neural. Transm.— 2013.— Vol. 120, No. 12.— P. 1737-1742.
27. Ткаченко Е. И. Питание, эндоэкология человека, здоровье, болезни. Современный взгляд на проблему их взаимосвязей // Терапевтический архив.— 2004.— Т. 76, № 2.— С. 67-71.
28. Ткаченко Е. И., Орешко Л. С., Ситкин С. И. Гастроэнтерология XXI века с позиций многомерной биологии // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга.— 2012.— № 2-3.— С. 2-5.
29. Zoetendal E. G., Akkermans A. D.L., Akkermans-van Vliet W. M., de Visser J. A.G.M., de Vos W. M. The host genotype affects the bacterial community in the human gastrointestinal tract // Microb. Ecol. Health Dis.— 2001.— Vol. 13. — P. 129-134.
30. Mueller S., Saunier K., Hanisch C., Norin E., Alm L., Midt-vedt T., Cresci A., Silvi S., Orpianesi C., Verdenelli M. C., Clavel T., Koebnick C., ZunftH. J., Doré J., Blaut M. Differences in fecal microbiota in different European study populations in relation to age, gender, and country: a cross-sectional study // Appl. Environ. Microbiol.— 2006.— Vol. 72, No. 2.— P. 1027-1033.
31. Hehemann J. H., Correc G., Barbeyron T., Helbert W., Czjzek M., Michel G. Transfer of carbohydrate-active enzymes from marine bacteria to Japanese gut microbiota // Nature.— 2010.— Vol. 464, Issue 7290.— P. 908-912.
32. Favier C. F., Vaughan E. E., De Vos W. M., Akkermans A. D. Molecular monitoring of succession of bacterial communities in human neonates // Appl. Environ. Microbiol.— 2002.— Vol. 68, No. 1.— P. 219-226.
33. Mariat D., Firmesse O., Levenez F., Guimarâes V., Sokol H., Doré J., Corthier G, Furet J. P. The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age // BMC Microbiol. — 2009.— Vol. 9. — 123.
34. Biagi E., Nylund L., Candela M., Ostan R., Bucci L., Pini E., Nikkïla J., Monti D., Satokari R., Franceschi C., Brigidi P., De Vos W. Through ageing, and beyond: gut microbiota and inflammatory status in seniors and centenarians // PLoS One.— 2010.— Vol. 5, Issue 5.— e10667.
35. Freter R., de Maclas M. E.N. Factors affecting the colonisation of the gut by lactobacilli and other bacteria // In: Probiotics: prospects of use in opportunistic infections. Old Herborn University Seminar Monograph.— Herborn-Dill (Germany), 1995.— P. 19-34.
36. Grehan M. J., Borody T. J., Leis S. M, Campbell J., Mitchell H., Wettstein A. Durable alteration of the colonic microbiota by the administration of donor fecal flora // J. Clin. Gastroenterol.— 2010.— Vol. 44, No. 8.— P. 551-561.
37. Smith M., Kassam Z., Edelstein C., Burgess J., Alm E. Open-Biome remains open to serve the medical community // Nat. Biotechnol.— 2014.— Vol. 32, No. 9.— P. 867.
38. Marteau P., Pochart P., Doré J., Béra-Maillet C., Bernalier A., Corthier G. Comparative study ofbacterial groups within the human cecal and fecal microbiota // Appl. Environ. Microbiol.— 2001.— Vol. 67, No. 10.— P. 4939-4942.
39. Green G. L., BrostoffJ., Hudspith B., Michael M., Mylona-ki M., Rayment N., Staines N., Sanderson J., Rampton D. S., Bruce K. D. Molecular characterization of the bacteria adherent to human colorectal mucosa // J. Appl. Microbiol.— 2006.— Vol. 100, No. 3.— P. 460-469.
40. Wildiers E. Nouvelle substance indispensable au développement de la levure // La Cellule.— 1901.— Vol. 18.— P. 313-332.
41. Вахитов Т.Я. Метаболическая регуляция и коммуникация у бактерий и высших организмов // М. М. Тере-ховский (1740-1796) и развитие экологической микробиологии. СПб., 2006.— С. 133-167.
42. Вахитов Т. Я., Петров Л. Н. Регуляторные функции экзометаболитов бактерий // Микробиология.— 2006.— Т. 75, № 4.— С. 483-488.
43. Weichart D. H., Kell D. B. Characterization of an autostimu-latory substance produced by Escherichia coli // Microbiology.— 2001.— Vol. 147, No. 7.— P. 1875-1885.
44. Вахитов Т. Я., Виснольд Н. В., Протасов Е. А., Петров Л. Н. Выделение и идентификация аутостиму-ляторов роста Escherichia coli М-17 // Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» — 1999.— Т. 3, № 1.— С. 116-117.
45. Вахитов Т.Я., Яшина О. Ю., Петров Л. Н., Королюк А. М. Действие препарата аутостимуляторов роста Escherichia coli M-17 (актофлор) на рост чистых и смешанных культур бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.— 2000.— № 3.— С. 20-24.
46. Вахитов Т. Я., Протасов Е.А, Виснольд Н.В, Толпа-ров Ю. Н., Петров Л. Н. Выделение и идентификация аутостимуляторов роста Escherichia coli // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.— 2003.— № 2.— С. 7-12.
47. Петров Л. Н., Бондаренко В. М., Вахитов Т. Я., Воробьев А. А. QS-системы у бактерий и перспективы создания новых метаболитных пробиотических препаратов // Вестник Российской Академии медицинских наук.— 2006.— № 1.— С.38-45.
48. Полевая Е. В., Вахитов Т. Я., Яковлева Е. П. Штаммоспец-ифические особенности в составе и динамике карбо-новых кислот при выращивании бактерий Escherichia coli и Salmonella enteritidis // Научный журнал КубГАУ.— 2012.— № 3 (77).— IDA: 0771203049.
49. Полевая Е. В., Вахитов Т. Я., Шалаева О. Н., Берсон Ю. М. Сравнительный анализ состава и динамики аминокислот, выделяемых бактериями в среду культивирования на примере выращивания Escherichia coli и Salmonella enteritidis // Научный журнал КубГАУ.— 2012.— № 6 (80).— IDA: 0801206038.
50. Kirkpatrick C, Maurer L. M, Oyelakin N. E, Yoncheva Y. N, Maurer R., Slonczewski J. L. Acetate and formate stress: opposite responses in the proteome of Escherichia coli // J. Bacte-riol.— 2001.— Vol. 183, No. 21.— P. 6466-6477.
51. Stancik L. M., Stancik D. M., Schmidt B, Barnhart D. M, Yoncheva Y. N., Slonczewski J. L. pH-dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli // J. Bacteriol.— 2002.— Vol. 184, No. 15.— P. 4246-4258.
52. Gantois I., Ducatelle R., Pasmans F., Haesebrouck F., Haute-fort I., Thompson A., Hinton J. C., Van Immerseel F. Butyrate specifically down-regulates Salmonella pathogenicity island 1 gene expression // Appl. Environ. Microbiol.— 2006.— Vol. 72, No. 1.— P. 946-949.
53. Вахитов Т. Я., Ососкова Л. И., Яшина О. Ю., Морозова Э. Н., Куликов С. В. Ауторегуляторы развития бактериальных популяций // Актуальные проблемы биотехнологии: Материалы 1 Отраслевой конференции молодых ученых (Кольцово, 1988).— М., 1989.— С. 27-28.
54. Гончар Н. В., Касснер Л. Н., Коренев П. Б., Илькович Ю. М., Могилина С. В., Петров Л. Н., Вахитов Т. Я. Пробиоти-ки как средства повышения эффективности лечения внебольничной пневмонии у подростков // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.— 2011.— № 1.— С. 78-84.
55. Ploger S., StumpffF., Penner G. B., Schulzke J. D., Gabel G., Martens H., Shen Z., Gtinzel D., Aschenbach J. R. Microbial butyrate and its role for barrier function in the gastrointestinal tract // Ann. N. Y. Acad. Sci.— 2012.— Vol. 1258.— P. 52-59.
56. Assisi R. F.; GISDI Study Group. Combined butyric acid/ mesalazine treatment in ulcerative colitis with mild-moderate activity. Results of a multicentre pilot study // Minerva Gastroenterol. Dietol.—2008.— Vol. 54, No. 3.— P. 231-238.
57. Sitkin S., Tkachenko E., Vakhitov T., Oreshko L., Zhigalova T. Serum metabolome in mild-moderate active ulcerative colitis and celiac disease // United European Gastroenterology Journal.— 2013.— Vol. 1, Suppl. 1.— P. A508.
58. Ситкин С. И., Ткаченко Е. И., Вахитов Т.Я., Орешко Л. С., Жигалова Т. Н. Метаболом сыворотки крови по данным газовой хроматографии — масс-спектрометрии (ГХ-МС) у пациентов с язвенным колитом и больных целиакией // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология.— 2013.— № 12.— С. 44-57.
59. Komaromy-Hiller G., Sundquist P. D., Jacobsen L. J., Nuttall K. L. Serum succinate by capillary zone electrophoresis: marker candidate for hypoxia // Ann. Clin. Lab. Sci.— 1997.— Vol. 27, No. 2.— P. 163-168.
60. TannahiM G. M., Curtis A. M., Adamik J., Palsson-McDermott E.M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-ф through HIF-1a // Nature.— 2013.— Vol. 496, Issue 7444.— P. 238-242.
61. Sitkin S., Tkachenko E., Vakhitov T., Oreshko L., Zhigalova T. Oral butyrate plus inulin improve serum metabolomics profile and gut microbiota composition in ulcerative colitis and celiac disease // J. Crohn's Colitis.— 2014.— Vol. 8, Suppl. 1.— P. S232.
62. Петров Л. Н., Вербицкая Н. Б., Добрица В. П., Галкин Г. Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики: биотехнология, клиника, алгоритмы выбора.— СПб.: ФГУП Гос. НИИ ОЧБ.— 2008.— 136 с.
