CC BY
27
МЕТОДИКА СКРИНИНГА ШТАММОВ-ПРОДУЦЕНТОВ ЛИПОЛИТИЧЕСКИХ
ФЕРМЕНТОВ
Мамедова Л.В.1, Пучкова Л.И. 2, Лебедев Л.Р.3 ©
1Дипломница, ФГБОУ ВО Кубанский государственный университет, Краснодар;
2к.б.н., ведущий научный сотр. ФБУН ГНЦ ВБ Вектор; д.м.н., зав. лабораторией нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков, Институт медицинской биотехнологии ФБУН ГНЦ ВБ Вектор, Бердск, Россия.
Аннотация
Апробирована методика скрининга микроорганизмов на наличие секретируемых липолитических ферментов для различных субстратов. Методика основана на выявлении физических изменений вокруг внесенных в лунки субстратов от воздействия ферментов микроорганизмов, выращенных на среде с агаром. В перспективе методика может быть полезной для поиска новых продуцентов секретируемых ферментов - липаз.
Ключевые слова: скрининг, липазы, субстратная специфичность. Keywords: screening, lipase, the substratal specificity.
Липазы нашли применение при разработке моющих средств, обработке мехового сырья, очистке жиросодержащих сточных вод, в пищевой промышленности (при изготовлении сыра). В связи с расширением употребления продуктов, содержащих пальмовое масло, животные жиры, замедляющие процессы переваривания, спрос на препараты для улучшения пищеварения, содержащие липазы, увеличивается. В основном используются препараты животного происхождения: панкреатин, фестал, мезим и др. Разработка липолитических препаратов специфического субстратного действия на основе микробиологического сырья позволит снизить технологические затраты на их производство.
Цель работы состояла в разработке и апробации методики скрининга штаммов-продуцентов липолитических ферментов и их субстратной специфичности.
Материалы и методы исследования
В работе использовали штаммы Rhizobium, Staphylococcus, Saccharomyces cerevisiae, полученные из Коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», а также исследовали штаммы Bacillus, полученные из коллекции и высеянные из воздуха. Для культивирования клеток использовали агаризованные питательные среды ГРМ (ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, г.Оболенск), рН 7,2±0,2, содержащие индикатор рН -феноловый красный. Лунки в геле агара делали пробойником - стальной трубкой диаметром 4 мм.
Результаты и обсуждение
При проведении первичного скрининга микроорганизмов-продуцентов гидролаз в расплавленную и охлажденную до 45-50°С агаровую среду вносили твин-20 до конечной концентрации 1% (по объему), перемешивали и разливали по чашкам Петри. На чашки высевали уколом клетки микроорганизмов, полученные из коллекции, либо оставляли их открытыми на 30-60 мин. В последнем случае источником микроорганизмов служила воздушная среда. Чашки помещали в термостат на 18 или 40 ч. О наличии секретируемых гидролитических ферментов судили по изменению окраски агара вокруг выросших колоний с красной на желтую (рис.1). Изменение значения рН и цвета индикатора обусловлено образованием свободных жирных кислот при гидролизе твина.
© Мамедова Л.В., Пучкова Л.И., Лебедев Л.Р., 2016 г.
Рис.1 Выявление колоний клеток, секретирующих гидролитические ферменты.
Для отбора наиболее продуктивных штаммов колонии выявленных микроорганизмов суспендировали в 100 - 150 мкл стерильного изотонического раствора и по одинаковому количеству клеток в объеме 30 мкл вносили в лунки, проделанные в агаре пробойником. Чашки помещали в термостат на 18 ч. Об относительной продуктивности штаммов судили по величине зоны изменения окраски вокруг лунок (рис.2).
Рис.2 Сравнительное определение продуктивности штаммов клеток по гидролитическим ферментам.
Выбирали наиболее продуктивные по гидролазам микроорганизмы и для определения спектра субстратной специфичности секретируемых ими гидролитических ферментов выбранные штаммы клеток выращивали на чашках до образования газона. Затем в лунки агара вносили по 30 мкл 1%-ных суспензий субстратов. Чашки помещали в термостат на 18 ч. О субстратной специфичности ферментов судили по величине зоны изменения окраски вокруг лунок (рис.ЗА). Параллельно проводили анализ на чашках с агаром, в котоый перед его заливкой был внесен раствор СаС12 до конечной концентрации 0,05%. В этом случае вокруг лунок при положительной реакции (наличии секретируемого гидролитического фермента) вокруг лунок образовывался ореол из преципитата солей кальция с жирными кислотами [1] (рис.3 Б).
А Б
Рис.3. Определение спектра субстратной специфичности секретируемых гидролаз Bacillus sp. на различных субстратах. А - верхний ряд, слева направо: твин-20, -40, -60, -80. Нижний ряд, слева направо: оливковое масло, пальмовое, рапсовое, подсолнечное. Б -преципитаты кальция с жирными кислотами из (слева направо) из пальмового, рапсового, подсолнечного масла.
Результаты скрининга микроорганизмов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты анализа микроорганизмов на продуктивность секретируемых гидролаз
Род Количество Из них - продуцентов Из них - продуцентов
микроорганизмов штаммов гидролаз липаз
Rhizobium 4 2 1
Staphylococcus 4 1 0
Saccharomyces 4 3 2
Bacillus 23 7 4
Из данных таблицы видно, что не все секретируемые гидролазы являются липазами. Они могут гидролизовать твины с появлением преципитата кальция с образовавшимися при гидролизе свободными жирными кислотами, но не гидролизовать жиры.
Таким образом, предложена и апробирована методика скрининга штаммов-продуцентов липолитических ферментов и их субстратной специфичности. Методика позволяет на одной чашке с агаром анализировать до 20-30 колоний клеток на наличие секретируемых гидролаз, оценивать их сравнительную продуктивность по гидролизу различных субстратов.
Работа проведена при реализации программ обучения бакалавров и магистрантов [2].
Литература
1. Никитин В.М. Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов.-Кишинев.-Картя Молдовеняскэ .-1986.-С.155-156.
2. Лебедев Л.Р., Ильичёв А.А., Карпенко Л.И., Базарнова Н.Г. Особенности составляющих образовательной программы биотехнолога фармацевтического профиля // Биофармацевт. журн.-2015. - Т.7, №5. -С.40-43.
