CC BY
69
УДК 579.66:547.94
И. И. Хабибуллина, А. В. Лукьянова, Н. И. Петухова, В. В. Зорин
Исследование влияния твина-80 на рост и активность энантиоселективных биокатализаторов Bacillus spp. 77-1 и 79-54 в процессах кинетического разделения рацемической смеси втор-бутилацетата
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 243-19-35; е-mail: bio@rusoil.net
Исследовано влияние различных добавок на рост и активность энантиоселективных биокатализаторов Bacillus spp. 77-1 и 79-54 в процессах кинетического разделения рацемической смеси втор-бу-тилацетата. Выявлено положительное влияние твина-80 в процессах интенсификации кинетического разделения сложных эфиров.
Ключевые слова: биотрансформация, активность, биокатализатор, втор-бутилацетат.
Синтонами многих низкомолекулярных биорегуляторов могут служить стереоизомеры различных спиртов, оксиэфиров и сложных эфиров 1. Эффективным способом получения таких соединений являются методы энантиосе-лективной биотрансформации с помощью ферментов и клеток микроорганизмов 2. Такие биокатализаторы не требуют дорогостоящих коферментов, могут проявлять высокую сте-реоселективность, широкую субстратную специфичность и каталитическую активность как в водной среде, так и в органическом растворителе.
Ранее в результате тестирования гидро-лазной активности обширной группы почвенных микроорганизмов удалось выявить штаммы Bacillus spp. 77-1 и 79-54, продуцирующие высокоселективные ферменты, способные катализировать процессы энантиоселективного гидролиза вторичных спиртов и диолов 3' 4.
В настоящей работе с целью интенсификации процессов кинетического разделения рацемических смесей эфиров вторичных спиртов с помощью найденных штаммов осуществлено исследование влияния содержания твина-80 в ростовой среде на гидролазную активность штаммов Bacillus spp. 77-1 и 79-54 в отношении втор-бутилацетата.
Известно, что твины, относящиеся к группе неионогенных поверхностно-активных веществ, могут оказывать стимулирующее влияние на рост микроорганизмов, биосинтез и активность синтезируемых липолитических фер-
ментов
5-7
Культивирование микроорганизмов проводили твердофазным способом на среде с панкреатическим гидролизатом рыбной муки и твином-80 (10 г/л). Для сравнения гидролаз-ной активности исследуемых штаммов использовали в качестве контроля среду без добавления твина и среду с добавлением оливкового масла (1%).
В результате исследования активности од-носуточного биокатализатора Bacillus sp. 77-1 в процессе гидролиза рацемической смеси втор-бутилацетата было установлено, что добавка твина-80 в среду увеличивает активность катализатора на 10% по сравнению со средой без добавок или примерно на 5% по сравнению с добавкой оливкового масла (рис. 1) .
т 0,8
*
0.6Н
£
Ö 0 4Н
о
к «
|5
о
к
1-4
0,2-
0
1 2 3
Возраст биомассы, сут □ без добавок ■ Твин 80 □ оливковое масло
Рис. 1. Зависимость гидролазной активности штамма Bacillus sp. 77-1 от возраста биомассы и содержания добавок в среде
Аналогичный эффект твина-80 проявляется и в случае трансформации втор-бутилаце-тата двух- и трехсуточным биокатализатором, однако, с увеличением возраста биомассы ее активность значительно снижается.
Причина такого падения активности в процессе роста культуры Bacillus sp. 77-1, вероятно, обусловлена характерным для данного штамма интенсивным спорообразованием, индуцирующимся уже в конце первых
Дата поступления 21.03.07
Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. №1
суток культивирования (рис. 2). Об этом свидетельствует увеличение числа колониеобразу-ющих единиц в высевах двух- и трехсуточных культур, предварительно прогретых при температуре 75 °С в течение 10 мин с целью инактивации вегетативных клеток.
80
60
g 40 20
0
/-Д
/ /1
1
3
Возраст биомассы, сут Рис. 2. Динамика процесса спорообразования штамма ВаеШ1ш sp. 77-1 при росте на среде с твином 80
Bacillus sp. 79-54 на среде с твином-80. При этом, вероятно, синтез данного фермента не индуцируется триглицеридом — естественным субстратом липазы, поскольку в присутствии оливкового масла увеличения активности биокатализатора не наблюдается.
Анализ кинетики и уровня конверсии рацемического втор-бутилацетата исследуемыми биокатализаторами, полученными на среде с оптимальной концентрацией твина-80, свидетельствует о сохранении их высокоэнантиосе-лективных свойств (рис. 4).
„= 100
s-а а s-
ю
75 -
50
25 -
При исследовании влияния твина-80 в составе ростовой среды на активность штамма Bacillus sp. 79-54 в процессе трансформации втор-бутилацетата также было выявлено стимулирующее действие этого соединения. Обнаружено, что положительное влияние твина-80 на односуточную биомассу проявляется незначительно, тогда как в случае трехсуточной биомассы активность биокатализатора в присутствии данной добавки увеличивается почти в 1.5 раза по сравнению со средой без добавок (рис. 3).
0,5 0,45 0,40,350,30,250,20,15 0,1 0,05 0
Время, час
- 79-54 ■
-77-1
е
о о к
ев §
К
м ев Ч О
S
1-4
Возраст биомассы, сут □ без добавок ■ Твин 80 □ оливковое масло
Рис. 3. Зависимость гидролазной активности штамма ВаеШш р. 79-54 от возраста биомассы при выращивании на различных средах
Полученные данные позволяют предположить индукцию синтеза фермента, ответственного за процесс кинетического разделения рацемического эфира, при выращивании штамма
Рис. 4. Кинетика гидролиза втор-бутилацетата штаммами Bacillus sp. 77-1 и Bacillus sp. 79-54, выращенными на среде с твином-80
Предполагается, что найденный подход может быть использован не только для интенсификации процессов кинетического разделения сложных эфиров с помощью клеточных биокатализаторов Bacillus sp. 77-1 и Bacillus sp. 79-54, также и в процессах парциального ацилирования спиртов.
Экспериментальная часть
Микроорганизмы выращивали на агари-зованном панкреатическом рыбном гидролиза-те с добавлением 1% твина-80 или оливкового масла на чашках Петри при 30 0С в течение 24—72 ч, затем биомассу различного возраста собирали с поверхности среды, дважды промывали 0.05 М фосфатным буфером (pH 7.0), затем трижды обрабатывали ацетоном (1:3) при перемешивании, после чего центрифугировали при 6000 об/мин. Полученный порошок высушивали при комнатной температуре.
Гидролиз втор-бутилацетата осуществляли в стандартных условиях в 0.05 М фосфатном буфере рН=7.0 при температуре 30 0С, при перемешивании в течение 3—5 ч. Концентрация биомассы исследуемых штаммов находилась на уровне 10—13 мг(АСВ)/мл. Субстрат вводили в концентрации 5 г/л, контролируя уровень его конверсии и накопления продукта методом ГЖХ. После окончания
0
реакции биокатализатор отделяли от реакционной среды центрифугированием в течение 15 мин при 6000 об/мин.
Изменение концентрации субстрата и продукта реакции контролировали методом ГЖХ на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, колонкой (3000x3 мм) 5% БЕ-30 на хроматоне AW, температурой колонки 80 0С и скоростью газа-носителя (азот) — 10 мл/мин.
Спорообразование бактерий оценивали по отношению количества колоний, выросших при высеве на агаризованную среду (КОЕ) прогретой при 75 0С в течение 10 мин суспензии клеток к количеству колоний, выросших на суспензии клеток.
Литература
1. Ohtani T., Nakatsukasa H., Kamezawa M., et al.// J.Mol.Cat.B: Enz.- 1998.- № 4.- Р. 53.
2. Grogan G. J., Holland H. L. // J. Mol. Cat. B: Enz.- 2000.- V. 9.- P. 1.
3. Коновалов А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2000.- Т. 7, № 5.- С. 49.
4. Коновалов А. А., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2003.- Т. 10, № 1.- С. 64.
5. Brown M. R. W., Winsley B. E. // J. Gen. Microbiol..- 1969.- Т. 56, № 1.- Р. 99.
6. Salton M. R. J. // J. Gen. Microbiol.- 1951.Т. 5, № 1.- Р. 56.
7. Табак М. Я., Щелокова С. С. // Микробиология.- 1979.- Т. 48, № 14.- С. 658.
