CC BY
22
МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
117
УДК 619:616.995.121 00|: 10.31016/1998-8435-2018-12-2-117-120
Методика гистохимической окраски на активность кислой фосфaтазы для идентификации личинок первой стадии нематод видов Dirofilaria ¡ттй1з, О. гврвпБ, АсапХЬосЬе\\опета дгасипсиШдеъ и А. гесопёкит
из крови собак
Владимир Михайлович Шайтанов 1, Валерий Брониславович Ястреб 2
1-2 Всероссийский научно-исследовательский институт фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений им. К. И. Скрябина, 117218, Москва, ул. Б. Черёмушкинская, д. 28
(Одобрена методической комиссией «Инвазионные болезни животных» РАН 21 сентября 2017 г., протокол № 2)
Поступила в редакцию: 25.11.2017; принята в печать: 11.04.2018
Аннотация
Модифицирована методика окраски на активность кислой фосфатазы, позволяющая дифференцировать между собой личинок первой стадии нематод четырех видов: Dirofilaria immitis, D. repens, Acanthocheilonema dracunculoides, A. reconditum из крови собак. Метод основан на локализации кислой фосфатазы в разных участках тела у разных видов микрофилярий. Для визуализации используется реакция гидролиза субстрата, который катализирует кислая фосфатаза, и образование в этих местах нерастворимого окрашенного преципитата. Приведен перечень оборудования и реактивов, дано краткое описание процесса подготовки клинического материала, проведения окраски и критериев дифференциации видов по окраске.
Ключевые слова: дифференциация, микрофилярии, гистохимическая окраска, кислая фосфатаза.
Для цитирования: Шайтанов В. М., Ястреб В. Б. Методика гистохимической окраски на активность кислой фосфатазы для идентификации личинок первой стадии нематод видов □¡гоА1апа ¡ттИлБ, й. герепБ, Асап^осИеПопета dracunculoides и А. гесопЖит из крови собак // Российский паразитологический журнал. 2018. Т. 12. № 2. С. 117-120. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2018-12-2-117-120
© Шайтанов В. М., Ястреб В. Б.
Technique of Histochemical Staining on the Activity of Acid Phosphatase for Identification of Larvae of the First Stage of Nematodes of Dirofilaria Immitis, D. Repens, Acanthocheilonema Dracunculoides and A. Reconditum Species from the Blood Of Dogs
Vladimir M. Shaytanov 1, Valery B. Yastreb 2
1-2 All-Russian Scientific Research Institute of Fundamental and Applied Parasitology of Animals and Plants named after K. I. Skryabin, 28, Bolshaya Cheremushkinskaya str., Moscow, 117218
(Approved by the methodological commission "Invasive Animal Diseases" of the Russian Academy of Sciences on September 21, 2017, protocol No. 2)
Submitted 25.11.2017; accepted for printing: 11.04.2018
Abstract
The technique of staining on the activity of acid phosphatase has been modified, which makes it possible to differentiate between larvae of the first stage of nematodes of four species: Dirofilaria immitis, D. repens, Acanthocheilonema dracunculoides, A. reconditum from the blood of dogs. The method is based on the localization of acid phosphatase in different parts of the body in different types of microfilariae. For visualization, the substrate hydrolysis reaction, which catalyzes acid phosphatase, and the formation of an insoluble stained precipitate in these areas is used. The list of equipment and reagents is attached, a brief description of the process of preparation of clinical material, coloring and criteria of differentiation of species by color is given.
Keywords: differentiation, microfilariae, histochemical staining, acid phosphatase.
For citation: Shaytanov V. M., Yastreb V. B. Technique of histochemical staining on the activity of acid phosphatase for identification of larvae of the first stage of nematodes of Dirofilaria immitis, D. repens, Acanthocheilonema dracunculoides and A. reconditum species from the blood of dogs. Rosiyskiy parazitologicheskiy zhurnal = Russian Journal of Parasitology. 2018; 12(2):117-120. https://doi.org/10.31016/1998-8435-2018-12-2-117-120
Назначение и область применения
Методика предназначена для практикующих ветеринарных специалистов и сотрудников профильных научно-исследовательских учреждений. Личинки филяриид имеют мало дифференциальных признаков и сложны в определении. В научных целях важно различать нематод на стадии личинки для изучения морфологии, физиологии, эпизоотологии, клинической паразитологии и др. В практических целях также важно выявлять, в первую очередь, инвазию D. immitis у собак, как наиболее патогенную для них, и в меньшей степени - D. repens [1]. Метод впервые был предложен T. Barka в 1962 г. для окраски клеток крови [3]; в паразитологии для окраски филярий его впервые применили L. Chalifoux и R. D. Hunt в 1971 г. [4]. Методика неоднократно модифицировалась [2, 5]. Последняя модификация была опубликована в 2001 г. с использованием тест-сиситемы Leucognost-SP [6]. В условиях России эти тест-системы не всегда доступны и коммерчески не выгодны. Закупка отдельных реактивов для окраски также обходится дорого, не всегда удобна и подходит только узкому кругу специалистов. Российский набор «Гемстандарт-КФ», выпускаемый для цитохимического определения кислой фосфатазы в лейкоцитах, с изменениями в ходе пробопод-готовки и хода реакции, наиболее удобен и доступен для широкого круга специалистов.
Суть метода
Реакция выявления активности кислой фосфатазы проходит в две стадии. Первая стадия (реакция ферментативного расще-
пления) - гидролиза нафтол-А8-фосфата с участием фермента кислой фосфатазы в ацетатном буфере. Вторая стадия (реакция сочетания) - взаимодействие нафтола-Л8 с пара-розанилином с образованием комплексного соединения азокрасителя. Данное соединение выпадает в качестве преципитата в области тела личинки с большей активностью кислой фосфатазы. Личинки разных видов филярий отличаются по локализации кислой фосфата-зы в теле паразита.
Оборудование и реактивы
Термостат; центрифуга; набор
«Гемстандарт-КФ» и входящие в него реактивы: нафтол-Л8-фосфат, диметилформамид, ацетат натрия, парарозанилин, азотистокис-лый натрий; дистиллированная вода; 96%-ный этанол; воронки; колба на 100 мл; колба на 1000 мл; эппендорфы на 2 мл; предметные стекла; пробирки с антикоагулянтом; центрифужные пробирки на 10 мл, емкость Хеллен-дахела для окраски мазков.
Подготовка клинического материала
Для окраски используют мазки цельной крови с антикоагулянтом, мазки из осадка, полученного методом концентрации с дистиллированной водой. Для приготовления мазков на сухое предметное стекло, ближе к узкому краю, наносят пипеткой небольшую каплю крови или осадка. Предметное стекло держат на столе или в левой руке за узкие края. Правой рукой приставляют шлифованное стекло узким краем к стеклу с кровью справа от кап-
ли под углом 45° и продвигают его влево до соприкосновения с каплей крови. Выжидают до тех пор, пока кровь расплывется по всему ребру шлифованного стекла, и затем плавным движением проводят его слева направо до тех пор, пока не будет исчерпана вся капля. Капля крови должна быть небольшой и соразмерна так, чтобы весь мазок помещался на стекле, не доходя до его края. После приготовления мазок следует высушить на воздухе.
Приготовление растворов
Приготовление ацетатного буфера. Содержимое флакона ацетата натрия растворить в колбе (вместимостью 1000 мл) в 500 мл дистиллированной воды.
Приготовление раствора № 1. Растворить содержимое одного флакона нафтол-Л8-фосфата в 0,5 мл диметилформамида, долить 40 мл ацетатного буфера.
Приготовление 4%-ного раствора азоти-стокислого натрия. Содержимое флакона с азотистокислым натрием растворить в 10 мл дистиллированной воды.
Приготовление раствора № 2. В эппендор-фе смешать 8 капель парарозанилина и 8 капель 4%-ного раствора азотистокислого Ыа.
Приготовление рабочего раствора. Раствор № 1 слить с раствором № 2. Тщательно смешать, отфильтровать. Измерить рН с помощью рН-метра или лакмусовой полоски; рН раствора должен быть 5,0-5,5.
Ход реакции и дифференциация личинок
1. Сухие мазки крови или осадка после метода концентрации зафиксировать 96%-ным этанолом. Достаточно однократно погрузить мазки в 96%-ный этанол.
2. Мазки после фиксации высушить.
3. Поместить в свежеприготовленный рабочий раствор (лучше в емкость Хеллендахе-ла, вертикально, во избежание образовании преципитата на стекле). Инкубировать в темноте в термостате при температуре 37°С в течение 2 ч.
4. Промыть водопроводной водой и высушить окрашенные стекла.
5. При недостаточном прокрашивании поместить обратно в рабочий раствор на 1 ч.
6. При просмотре мазка фон будет светло-желтый; окрашенными в красный цвет будут только поры микрофилярий и некоторые участки тела личинки. При необходимости можно докрасить мазки азур-эозином (наборы для быстрого окрашивания «Лейкодиф200»).Дляличиноквида D. repens характерно окрашивание анальной поры, а у личинок D. immitis окрашивается экскреторная и анальная поры. Личинки A. dracunculoides проявляют специфичное окрашивание в области экскреторной поры, образуя так называемое «кольцо» основного тела, расположенного в центре между порами, и анальной поры. Личинки A. reconditum окрашиваются полностью, но более интенсивно в области между экскреторной и анальной порами.
Литература
1. Ястреб В. Б. Прижизненная диагностика диро-филяриоза // Матер. Науч. Конф. Всерос. о-ва гельминтол. РАН «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». 2011. Вып 12. С. 588-592.
2. Balbo T., Abate O. Histochemical differentiation of microfilariae of Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens and Dipetalonema sp. Parassitologia. 1972; 14: 240-244.
3. Barka T. Cellular localization of acid phosphatase activity. J. Histochem. Cytochem. 1962;10: 231-232.
4. Chalifoux L., Hunt R. D. Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis and Dipetalonema reconditum. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1971; 158(5): 601-605.
5. Ortega-Mora L. M., Gomez-Bautista M., Rojo-Vazquez F. A. The acid phosphatase activity and the morphological characteristic of Dipetalonema dracunculoides (Cobbold, 1870) microfilariae. Vet. Parasitol. 1989; 33: 187-190.
6. Peribanez M. A., Lucientes J., Arce S., Morales M., Castillo J. A, Gracia M. J. Histochemical differentiation of Diroflaria immitis, Diroflaria repens and Acanthocheilonema dracunculoides microflariae by staining with a commercial kit, Leucognost-SP. Vet. Parasitol. 2001; 102: 173-175.
References
1. Yastreb V. B. Life-time diagnostics of dirofilariasis. Mater. Nauch. Konf. Vseros. o-va gel'mintol. RAN «Teoriya i praktika bor'by s parazitarnymi boleznyami» = Materials of the Scientific Conference of the All-Russian Helminthology Society of the
Russian Academy of Sciences "Theory and Practice of Combating Parasitic Diseases". 2011. (12): 588-592. (In Russ.)
2. Balbo T., Abate O. Histochemical differentiation of microfilariae of Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens and Dipetalonema sp. Parassitologia. 1972; (14): 240-244.
3. Barka T. Cellular localization of acid phosphatase activity. J. Histochem. Cytochem. 1962; (10): 231-232.
4. Chalifoux L., Hunt R. D. Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis and
Dipetalonema reconditum. J. Am. Vet. Med. Assoc. 1971; 158(5): 601-60S.
5. Ortega-Mora L. M., Gomez-Bautista M., Rojo-Vazquez F. A. The acid phosphatase activity and the morphological characteristic of Dipetalonema dracunculoides (Cobbold, 1870) microfilariae. Vet. Parasitol. 1989; (33): 187-190.
6. Peribáñez M. A., Lucientes J., Arce S., Morales M., Castillo J. A, Gracia M. J. Histochemical differentiation of Diroflaria immitis, Diroflaria repens and Acanthocheilonema dracunculoides microflariae by staining with a commercial kit, Leucognost-SP. Vet. Parasitol. 2001; (102): 173-175.
