CC BY
208
Acute toxicity of insectoacaricide drops “Bars”.Yarovaya N.V., Salnikova O.G. Nizhegorodsk Reference Centre of Rosselhoznadzor.
Summary. One determined the following acute toxicity parameters of “Bars®” at peroral administration to mice and at application on skin to rats: LD50 = 1900 and LD50 = 3700 mg/kg of body weight respectively.
ПРИЖИЗНЕННАЯ ДИАГНОСТИКА ДИРОФИЛЯРИОЗА
Ястреб В.Б.
ВНИИ гельминтологии им. К.И. Скрябина
Учитывая то, что клинические признаки при дирофиляриозе являются неспецифическими, решающее значение при постановке диагноза имеют лабораторные исследования с целью выявления в крови микрофилярий или специфических для паразита антигенов. Диагностика дирофиляриоза занимает ведущее место в системе мероприятий, направленных на лечение и профилактику заболевания, как у животных, так и человека. Наибольшего внимания заслуживают методы прижизненной диагностики, позволяющие предупредить распространение инвазии и существенно снизить затраты на содержание зараженных животных. Поскольку виды Dirofilaria immitis и D. repens обладают разной степенью патогенности по отношению к собакам, очень важна дифференциальная диагностика микрофилярий на видовом уровне. Для диагностики «скрытой» инвазии, а также для изучения эффективности макрофилярицидной терапии применяются иммунологические методы диагностики по выявлению специфических антигенов или антител в сыворотке крови собак.
В настоящее время активно продолжается поиск эффективных и экологичных методов прижизненной диагностики дирофиляриоза как в ветеринарной, так и медицинской практике.
К прижизненной диагностике относят прямое исследование крови, методы концентрации, фильтрации, количественной и дифференциальной диагностики, а также иммунологические и молекулярные методы.
Метод толстой раздавленной капли крови является самым простым и быстро выполнимым. Кровь перед исследованием тщательно перемешивают, наносят 3 капли на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют при малом увеличении микроскопа. Движущиеся микрофилярии хорошо заметны в поле зрения микроскопа. Этот метод не требует химреактивов и лабораторного оборудования, но эффективен только при высокой микрофиляриемии.
Метод концентрации. J.D. Knott (10) предложил метод, сущность которого заключается в том, что в пробирку с 1 мл крови добавляют 10 мл 2%-ного раствора формалина и смесь центрифугируют в течение 5 минут при скорости 1500 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок смешивают в
587
равных частях с 0,1%-ным раствором метиленовой сини. Из окрашенного осадка делают влажный мазок и исследуют под микроскопом.
Метод фильтрации через миллипоровые фильтры предложен J.P. Wylie (19). В шприц набирают 1 мл крови, смешивают с гепарином и добавляют 10 мл гемолизирующего раствора. Полученный раствор гемолизированной крови пропускают через миллипоровый фильтр с размером пор 8 мкм. Затем через фильтр медленно пропускают 5 - 10 мл раствора толуидинового синего. Далее фильтр промывают, отсоединяют от держателя и исследуют под микроскопом. В.Г. Супряга и А.И. Андреенков (4) предложили для медицинской практики метод диагностики филяриатозов у лиц с низкой плотностью микрофилярий в крови. Авторы предложили модификацию, с помощью которой микрофилярии обнаруживают на окрашенных ультрафильтрах отечественного производства, через которые пропускают под вакуумом гемолизированную кровь.
Методы количественной диагностики. Для практикующих врачей и научных целей в химиотерапевтических опытах необходимо проводить выявление микрофилярий с учетом их количества и жизнеспособности. Для этого используют метод концентрации крови с дистиллированной водой по В.Б. Ястребу (5).
J.R. Lindsey (11) предложил для подсчета микрофилярий метод, при котором кровь набирают в шприц с гепарином и смешивают. Затем делают 3 мазка, высушивают и окрашивают раствором Гимза. Если в мазке в среднем обнаруживают менее 1 микрофилярии, то считают, что в 1 мл цельной крови меньше 50 микрофилярий.
Еще один метод количественной диагностики предложили Д.Р. Архипова и И.А. Архипов (1) с использованием меланжера и счетной камеры Фукса-Розенталя. Кровь берут из ушной вены в смесительную пипетку (меланжер) до метки I и до метки II заполняют раствором, состоящим из ледяной уксусной кислоты, раствора фуксина и дистиллированной воды в соотношении 3:4:93. Для равномерного смешивания меланжер с кровью и раствором кладут на вибратор на 2 - 3 минуты. К чистой и сухой камере Фукса-Розенталя притирают покровное стекло до появления так называемых колец Ньютона. Затем раствор в меланжере встряхивают, и каплю (но не первую) наносят на среднюю часть пластинки камеры и под микроскопом подсчитывают количество микрофилярий во всех квадратах. Подсчитанное количество микрофилярий делят на степень разбавления (10) и емкость камеры (3,2 мм3) и умножают на 20. Получают количество микрофилярий в 20
3
мм крови.
Методы дифференциальной диагностики. Поскольку виды дирофилярий и дипеталонем обладают разной степенью патогенности по отношению к собакам, очень важна дифференциальная диагностика микрофилярий на видовом уровне.
A.E.R. Taylor (15) детально изучала морфологию микрофилярий с использованием специального окрашивания и ультрафиолетового микроскопирования и установила следующие различия для D. immitis и D.
588
repens в мкм: длина - 260±5 и 290±10; ширина - 4,5 и 6,0; расстояние от головного конца тела до: а) нервного кольца - 20 и 23; б) экскреторной поры -30 и 30; в) экскреторной клетки - 40 и 33; г) анальной поры - 74 и 70 соответственно.
Для идентификации микрофилярий L. Chalifoux и R.D. Hunt (6) использовали их реакцию на действие кислой фосфатазы. Микрофилярии имеют разные места окрашивания энзимных клеток в результате нафтол ASTR-фосфатной реакции. Активность кислой фосфатазы у двух видов филярий различна: у микрофилярий D. immitis четко окрашиваются энзимные клетки в области экскреторной и анальной пор, тогда как у микрофилярий D. repens четко окрашиваются энзимные клетки только в области анальной поры. M.A. Peribanez et al. (13) предложили для дифференциации микрофилярий D. immitis и D. repens коммерческий тест Leucognost-SP®. Он также основан на реакции микрофилярий к действию кислой фосфатазы, как и предыдущий метод, но является более быстрым и простым.
Микрофилярии D. immitis и D. repens различаются по форме головного и хвостового концов. Головной конец микрофилярий D. repens имеет округлую форму, короткий и прозрачный, а у D. immitis - конической формы и темного цвета. Хвостовой конец у микрофилярий D. immitis заострен, а у D. repens - нитевидный, вытянутый, загнутый на конце в виде ручки зонтика.
G. Favia et al. (7), Ю.Г. Бескровная, С.А. Нагорный (2) предложили дифференцировать D. immitis и D. repens на молекулярном уровне, используя полимеразную цепную реакцию (ПЦР).
Иммунологические методы. Традиционно диагноз дирофиляриоза у собак устанавливают по наличию микрофилярий в крови. Основным препятствием для постановки такого диагноза является «скрытое» течение инвазии, т.е. без циркулирующих в крови микрофилярий, которое может регистрироваться, по данным разных исследователей, у 25 - 35% собак. «Скрытая» инвазия может быть связана с препатентной стадией паразита, однополыми гельминтами, очень низкой микрофиляриемией, микрофилярицидной терапией и др. причинами. В таких случаях «скрытую» инвазию возможно выявить только иммунологическими методами.
K.H. Kato (9) предложил иммунологическую тест-систему, позволяющую выявлять антитела, вырабатываемые в организме собаки в ответ на заражение дирофиляриями. Поскольку этот метод основан на определении антител к паразиту, оп позволяет диагностировать заболевание, как в явной, так и в скрытой форме. Однако низкие титры антител к дирофиляриям, наблюдающиеся во многих случаях «скрытой» инвазии, ограничивают диагностические возможности этого метода. Более того, выявлены перекрестные реакции с антителами других видов нематод (токсокар, трихоцефал и др.), паразитирующих у собак, что повышает процент ложноположительных результатов (8, 18).
589
Недостатки описанных выше методов послужили стимулом к дальнейшим исследованиям, направленным на разработку более эффективных альтернативных методов диагностики дирофиляриоза собак.
G.J. Weil et al. (16) показали возможность диагностики инвазии D. immitis по присутствию специфических антигенов этого паразита в циркулирующей крови. При смешивании сыворотки крови зараженной собаки и стандартизированной антисыворотки происходит иммунологическая реакция, свидетельствующая о присутствии паразита. Получены и описаны гибридомные клеточные линии, образующие моноклональные антитела к этим антигенам. Разработана и запатентована иммунологическая тест-система (17), которая выпускается под коммерческим названием FILAROCHEK™ CANINE HEARTWORM ANTIGEN TEST KIT производства MALLINCKRODT Inc., Нью-Йорк.
В настоящее время для диагностики дирофиляриоза собак в основном используют тесты, которые позволяют определять циркулирующие в крови антигены, выделяемые взрослыми самками гельминтов, но инвазия выявляется непостоянно, а только в тех случаях, когда в организме животных обитает от трех и более самок, возраст которых старше 7 месяцев. Наборы, основанные на определении антигенов с помощью тестов ELISA, иммунохроматографии и гемагглютинации, применяют для индивидуального и группового исследования. Сравнение эффективности всех трех диагностических тестов с использованием 108 положительных и 100 отрицательных на D. immitis проб сывороток собак показало, что чувствительность и специфичность были очень высокими, а статистические различия между тестами отсутствовали (12).
Клинико-инструментальные методы диагностики. В некоторых случаях, особенно при «скрытой» инвазии, могут быть полезны инструментальные методы диагностики (рентгенография грудной клетки, эхокардиография, электрокардиография), которые позволяют косвенно диагностировать заболевание по изменениям внутренних органов. Используя эти методы, оценивают изменения в легочных артериях (расширение, демаркация) легких (инфильтрация), сердце (кардиомегалия, расширение правого желудочка и предсердия, недостаточность трехстворчатого клапана), наблюдают плевральный выпот или асцит (3, 14).
Литература: 1. Архипова Д.Р., Архипов И.А. // Тр. Всер. ин-та гельминтол. - 2004. - Т. 40. - С. 18 - 22. 2. Бескровная Ю.Г., Нагорный С.А. // Матер. докл. науч. конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - М., 2008. - С. 73 - 75. 3. Пульняшенко П.Р., Чаркин В.А. // Матер. 1-й Международн. науч.-практ. 590еет. конф. по проблемам мелких жив-ных, Одесса, Украина. - 2002. - С. 101 - 105. 4. Супряга В.Г., Андреенков А.И. // Мед. паразитол. и паразитар. болезни. - 1978. - № 6. - С. 100 - 102. 5. Ястреб В.Б. //Сб.мат.науч.конф. «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями». - 2004. - вып.5.- С. 443 - 445. 6. Chalifoux L., Hunt R.D. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1971. - V. 158. - P. 601 - 605. 7. Favia G., Lanfrancotti A.,
590
Torre A. et al. // Parasitology. - 1996. - V. 113, N 6. - P. 567 - 571. 8. Gillis J.M., Smith R.D., Todd K.S. // Aver. J. Vet. Res. - 1984. - V. 45, N 11. - P. 2288 - 2292. 9. Kato K.H. U.S.A. Patent. Immunoassay. - 1982. - N 4,322,495. 10. Knott J.I. // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1939. - V. 33. - P. 191 - 196. 11. Lindsey J.R. // J. Amer. Vet. Assoc. - 1965. - V. 146. - P. 1106 - 1114. 12. McCall J.W. // Abstracts the 18th Intern. Conf. WAAVP, Stresa, Italy. - 2001. - P. 184. 13. Peribanez M.A., Lucientes J., Arce S. et al. // Vet. Parasitol. - 2001. - V. 102, N 12. - P. 173 - 175. 14. Schrey C.F., Trautvetter E. // Waltham Focus. - 1998. - V. 8, N 3. - P. 23 - 30. 15. Taylor A.E.R. // J. Helminthol. - 1960. - V. 34, N 1-2. - Р. 27 - 38. 16. Weil G.J., Malane M.S., Powers K.G. // Am. J. Trop. Med. Hyg. - 1984. -V. 33. - P. 425 - 430. 17. Weil G.J. U.S.A. Patent. Circulating antigens of Dirofilaria immitis, monoclonal antibodies specific therefore and methods of preparing such antibodies and detecting antigens. - 1985. - N 4,839,275. 18. Wilkins R.J., Ciurea D. // Vet. Med. - 1985. - V. 80, N 6. - P. 42 - 45. 19. Wylie J.P. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1970. - V. 156, N 10. - P. 1403 - 1405.
Vital diagnosis of Dirofilaria spp. infection. Yastreb V.B. All-Russian K.I. Skryabin Scientific Research Institute of Helminthology.
Summary. One discussed the methods of vital diagnosis of Dirofilaria spp. infection.
591
