CC BY
35
© C.B. Рогатых, C.B. Мурадов, 2016
УДК 550.72
C.B. Рогатых, C.B. Мурадов
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ К ПРОВЕДЕНИЮ МОДЕКУДЯРНО-БИОДОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА АБОРИГЕННЫХ МИКРОБНЫХ АССОЦИАЦИЙ МЕДНО-НИКЕДЕВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ"
Настоящая статья содержит методические рекомендации к описанию методов качественного и количественного определения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphillum в производственных и лабораторных пробах. Описаны методы, направленные на выявление последовательностей ДНК, характерных для вышеупомянутых микроорганизмов. Ключевые слова: биовыщелачивание, ПЦР в реальном времени, ацидофильные микроорганизмы, автохтонное микробное сообщество, медно-никелевое месторождение.
В настоящее время применение микроорганизмов в целях извлечения металлов из руд широко используется в мировом масштабе. В России использование биотехнологий при добыче полезных ископаемых также придается большое значение. Горнорудная промышленность относится к главным отраслям экономики Камчатского края. Согласно планам экономического развития Камчатки, в ближайшее время будут разрабатываться различные месторождения цветных металлов.
Современное внедрение технологии биовыщелачивания невозможно без четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора [1, 2]. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор. Это позволит
Данная работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта ДВО РАН «Определение видового и количественного состава бактериальных сообществ, участвующих в процессе биовыщелачивания сульфидных руд» (№ 13-111-В-06-093).
интенсифицировать процессы биовыщелачивания не только путем проведения модельных экспериментов с различными микробными ассоциациями, но и оперативно контролировать и отслеживать процесс выщелачивания, вносить коррективы и управлять микробной популяцией при мониторинге процесса.
Поэтому целью настоящего исследования стало определение структуры сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, принимающих участие в технологии биовыщелачивания, в ее качественной характеристике, а основными задачами - создать молекулярно-биологический алгоритм исследования этих сообществ в ходе процесса биовыщелачивания и разработать комплекс ПЦР-тест-систем для выявления основных представителей исследуемого сообщества.
В результате работы разработаны рекомендации к проведению качественного анализа микроорганизмов Acidithioba-аИт ferrooxidans, A. thiooxidans, Su¡fobaci¡¡us thermosu¡fido-oxidans, Регюр^та acidiphi¡um, которые являются универсальными для сообществ микроорганизмов, выщелачивающих сульфидные руды, и могут быть применены для экспресс-анализа видового разнообразия хемолитотрофных микроорганизмов в экспериментах по выявлению максимальной эффективности микробных сообществ и на производстве для быстрого и точного анализа проб выщелачивающего раствора. Метод выявления ДНК хемолитотрофных микроорганизмов, используемых в биовыщелачивании с помощью тест-систем, основан на использовании полимеразной цепной реакции с детекцией результатов амплификации после завершения реакции с помощью ПЦР-детектора или в режиме «реального времени» с помощью детектирующего амплификатора.
На этапах качественного и количественного определения методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» применяются тест-системы из видоспецифичных и универсальных праймеров. Качественное и количественное определение хемолитотрофных микроорганизмов в пробах с помощью тест-систем и оборудования состоит из следующих этапов: выделение ДНК из исследуемого образца; тестирование выделенной ДНК на амплификаторе (для качественного определения) или термо-циклере (для количественного определения); последующий учет
результатов с помощью гель-электрофореза; для количественного определения учет результатов проводится после проведения ПЦР, проведение гель-электрофореза не требуется.
Первый этап - выделение ДНК. Реактивы - а) лизирующий буфер (6М гуандин-изотио-цианат, 50mM Tris-HCl pH 6,4, 20mM EDTA, 1,3 % Triton X-100, ЗАО «ДНК-Технология», Россия); б) реагент для преципитации (изопропанол 100 %); в) ТЕ-буфер для растворения (10 мМ Tris-HCl pH 8,6, 1 мМ ЭДТА рН 8,0); г) фосфатный буфер (PBS рН 1,8-2,0, Amresco, США); д) водонасыщеный фенол рН 7,2; е) смесь хлороформа и изоами-лового спирта 100 % в соотношении 24:1; ж) этиловый спирт 70 %. Оборудование и расходные материалы - центрифуга «MiniSpin Plus» («Eppendorf AG», ФРГ); центрифуга типа «Вор-текс» (ООО «BioSan», Датвия); твердотельный термостат «Термит» (ЗАО «ДНК-Технология», Россия) на 25-100 оС; набор од-ноканальных дозаторов переменного объёма; настольный бокс с бактерицидной лампой; одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся пробирки на 1,5 мл (ЗАО «Хеликон», Россия); отдельный халат и одноразовые перчатки; двухкамерный холодильник.
Исследуемый материал (500 мкл) отцентрифугировать на 13 000 об/мин 15 минут, убрать надосадочную жидкость, добавить 500 мкл фосфатного буфера, перемешать на вортексе и отцентрифугировать на 13 000 об/мин 5-10 минут.
Удалить надосадочную жидкость, к осадку добавить 400 мкл предварительно прогретого до полного растворения осадка лизирующего буфера [2]. Термостатировать при 65 °С в течении 30 минут. Добавить в пробирку 400 мкл водонасыщен-ного фенола, перемешать. Добавить 400 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (соотношение 24:1), перемешать. Центрифугировать 10 мин при 13000 об/мин.
Верхнюю водную фазу перенести в новую пробирку, к ней добавить 800 мкл смеси хлороформа и изоамилового спирта (соотношение 24:1), перемешать. Центрифугировать 10 мин при 13000 об/мин. Верхнюю фазу перенести в новую пробирку, к ней добавить 800 мкл реагента для преципитации, осторожно перемешать. Центрифугировать 5 мин при 13000 об/мин. Удалить надосадочную жидкость, добавить 400 мкл
этанола, перемешать. Центрифугировать 5 мин при 13 000 об/мин. Удалить надосадочную жидкость, осадок высушить в термостате при температуре 55 °С не более 10 мин.
Осадок растворить в 50 мкл ТЕ-буфера путем периодического перемешивания и нагрева при 55 °С. Выделенные образцы ДНК хранить при -20 °С не более одного месяца.
Второй этап - Качественное определение. Реактивы - ПЦР-буфер (93 мМ Трис-HCl рН 8,6, 25 мМ (NHbSO^ 1,8 мМ MgCk, 0,003 % Tween-20, ЗАО «ДНК-Технология», Россия); праймеры, указанные в табл. 1 (ООО «Евроген», Россия); очищенная плазми-да, содержащая вставки микроорганизмов из чистых культур A. thiooxidans, A. ferrooxidans, F. acidiphillum и S. thermosulfidooxidans (ООО «Евроген», Россия); нуклеотиды - набор 100 мМ растворов dATP, dGTP, dCTP, TTP в воде (ЗАО «Биосан», Россия); Taq-полимераза (ЗАО «ДНК-Технология», Россия); минеральное масло (ЗАО «ДНК-Технология», Россия). Оборудование и расходные материалы - многоканальный амплификатор «Терцик» (ЗАО «ДНК-Технология»); центрифуга «Фуга/вортекс микро-спин FV-2400» (ООО «BioSan», Латвия); набор одноканальных дозаторов переменного объёма; одноразовые наконечники с аэрозольным барьером для пипеток переменного объема, одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР на 0,5 мл («Eppendorf»).
Таблица 1
Последовательности праймеров
№ Организм, применение Название Последовательность 5'-3'
1 видоспецифическая амплификация А.Аюох1<СапБ AtF AGGACGAAAAGGTGGGTG
AtR ATTTCACGACAGACCTAATGC
2 видоспецифическая амплификация АЛеггоохИапэ AfF GAGGACGAAAAGGTGGGTT
AfR ATTTCACGACAGACCTAACGT
3 видоспецифическая амплификация Р. аЫ&рЬШиш Fer-d CCTGAAGCTTAACTCCAGAAA GT
Fer-r1 TCTTTGTAATGCGCGTGTAGC
4 видоспецифическая амплификация 5. &егшозиИ1с1оох1с1ап5 Sulf-d1 ACCTTCGGGTCAGCGGCGG
Sulf-r GCCGGTCTTCGTCCCGACA
5 универсальная амплификация всех эубактерий и архей upr2-d TGCATGGCYGTCGTCAGCTCGT
upr3-r TGACGGGCGGTGTGTRCAAGG
Приготовление 1,25 кратного ПЦР-буфера. Для приготовления 1 л 1,25х-буфера слить 116 мл 1М Tris-HCl (pH 8,6), 4,5 мл 0,5М MgCl2, 0,38 мл 10 % Tween-20 и довести объем mQ примерно до 900 мл. Растворить в 50 мл mQ 4,6 г сульфата аммония и прилить к основному раствору. Довести объем до 1 л в мерной посуде. Стерилизовать автоклавированием. Хранить при +4 °С.
Приготовление реакционной смеси для ПЦР. Предварительно разморозить праймеры (см. табл. 1), оставив их при комнатной температуре на 10 мин. В реакционную пробирку объемом 0,6 мл добавить: 28 мкл буфера, по 0,14 мкл прай-меров 1 и 2, по 0,24 мкл нуклеотидов, 0,5 мкл полимеразы, довести бидистиллированной водой до 30 мкл, добавить 5 мкл образца ДНК (общий объем смеси 35 мкл). Добавить 20 мкл минерального масла, центрифугировать на вортексе 3-5 с. В качестве положительного контроля использовать плазмиду, содержащую специфическую вставку. В качестве отрицательного контроля использовать стерильный TE-буфер, прошедший все этапы пробоподготовки.
Программа постановки ПЦР. 1 цикл - 94 °С - 3 мин; 25 циклов - 94 °С - 20 с, температура отжига праймеров для каждой бактерии (68 °С для A. thiooxidans, A. ferrooxidans, 66 °С для F. acidiphillum, 64 °С для S. thermosulfidooxidans, 62 °С для универсальных праймеров) - 20 с (регистрация резльтатов при ПЦР-РВ), 72 °С - 10 с; хранение 10 °С.
Третий этап - регистрация результатов амплификации. Реактивы - набор для агарозного электрофореза (ЗАО «ДНК-Технология», Россия) (включая: буфер трис-борат для гелей, агароза 1 % (Sigma Aldrich, США), бромистый этидий EtBr 0,01 %, буфер трис-борат для электрофореза); маркер молекулярного веса GeneRuler 100bp DNA Ladder («Farmentas», США) (включая: ДНК-маркер молекулярного веса «DNA Ladder», буферная система с красителем бромфеноловым синим «6X DNA Loading Dye»); деионизованная вода. Оборудование и расходные материалы - камера для горизонтального электрофореза «SE-2» (ЗАО «Хеликон», Россия); источник питания «Эльф-4» для электрофореза (ЗАО «ДНК-Технология», Россия); трансиллюминатор ECX-20М (Viber Lourmat, Франция); видеосистема гель-документирования или фотоаппарат; центрифуга «Фу-
га/вортекс микро-спин FV-2400» (ООО «BioSan», Латвия); од-ноканадьные дозаторы переменного объёма.
Приготовление 10-кратного TBE-буфера. Для приготовления 1 л 10-кратного TBE-буфера добавить в мерную колбу 108 г 89 мМ TRIS (основного), 55 г 89 мМ борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (pH 8,0) и довести объем деионизированной водой до 1 л.
Подготовить маркер молекулярного веса: в пробирку на 0,5 мл добавить 2 мкл ДНК-маркера, 1 мкл буферной системы с красителем и 3 мкл деионизованной воды, перемешать на вортексе.
Приготовление агарозного геля. Для приготовления рабочего раствора ТБе-буфера (трис-боратный) для электрофореза содержимое пакета с надписью «буфер для э/ф» (9,55 г) растворить в 1 л дистиллированной воды. Готовят 1 % агарозный гель. Для этого взвесить 2 г агарозы и залить ее в термостойкой колбе 200 мл электрофорезного буфера. Агарозу расплавить в микроволновой печи, доводя ее до кипения (до полного исчезновения пузырьков). Колбу с агарозой охладить до температуры 4060 °С. Внести 3 мкл раствора бромистого этидия и залить в специальную форму со вставленными в нее гребенками на тол-шину 5 мм (зубцы гребенок заливной камеры должны быть погружены в гель на 3 мм). Дать остыть в течение 15 мин. После застывания геля гребенки осторожно вынуть. К 5 мкл каждого исследуемого образца добавить 1 мкл краски, перемешивается. Гель вместе с формой поместить в аппарат для электрофореза, заполненный электрофорезным буфером. Буфер должен покрывать гель приблизительно на 1-2 мм. Образцы с краской нанести в лунки по 6 мкл, в специально отведенную лунку добавить 6 мкл ДНК-маркера, камера закрывается крышкой и подсоединяется к источнику питания, который ставится на 400 мА, 240 вольт, 80 ватт, 5-10 минут (необходимо следить за полоской краски, чтобы она не вытекла за пределы геля). После отключения от источника питания из камеры вынуть гель и поместить на трансиллюминатор. Гель фотографируется или видеосистемой гель-документирования или фотоаппаратом.
Учет результатов. В дорожке (или дорожках) соответствую-шей положительному контрольному образцу (или образцам) должна быть яркая специфическая светяшаяся полоса на уровне
длин ампликонов, указанных выше. Длина ампликона определяется по дополнительной дорожке, содержащей маркеры длины. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящуюся, большей или меньшей интенсивности, полосу на том же уровне. Отрицательными считаются образцы, в дорожках которых нет подобных полос. В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу, не должно быть высокомолекулярных полос (выше уровня 100 п.н.). Результаты анализа не подлежат учету в следующих случаях:
• если в дорожке, соответствующей положительному контролю, отсутствует специфическая полоса. Причиной могла явиться ошибка в подготовке реактивов, постановке ПЦР или сбой программы амплификатора;
• если в отрицательном контроле выявляется специфическая полоса, значит произошла контаминация реактивов или проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР (без пробоподготовки) для выявления источника контаминации. Если недостоверный результат повторился хотя бы один раз, необходимо сменить реактивы.
Количественное определение. Подготовка и проведение полимеразной цепной реакции в реальном времени. Создать протокол амплификации, для чего: в окне «протокол» выбрать опцию «добавить тест», в появившемся окне выбрать тест «количественный»; указать количество исследуемых образцов.
Приготовление реакционной смеси для ПЦР. Предварительно разморозить праймеры, оставив их при комнатной температуре на 10 минут. В реакционную пробирку объемом 0,6 мл добавить: 28 мкл буфера, по 0,14 мкл праймеров 1 и 2, по 0,24 мкл нуклеотидов, 0,5 мкл полимеразы, 0,75 мкл красителя SYBR Green I, довести бидистиллированной водой до 30 мкл, добавить 5 мкл образца ДНК (общий объем смеси 35 мкл). Осадить капли со стенок пробирок центрифугированием на вортексе в течение 2-3 сек. Добавить 20 мкл минерального масла, все пробирки центрифугировать при 1000 об/мин в течение вортексе 3-5 сек. В качестве положительного контроля
использовать плазмиду, содержащую специфическую вставку. В качестве отрицательного контроля можно использовать стерильный ТБ-буфер, прошедший все этапы пробоподготовки.
Установить все пробирки в блок амплификатора и провести ПЦР в режиме, приведенном в табл. 2, с учетом объема реакционной смеси, равного 35 мкл. Пробирки установить в соответствующие лунки амплификатора, выбрав опцию «применить» перейти в окно «запуск программы амплификации» запустить программу амплификации выбрать директорию для сохранения результатов амплификации. Регистрация и учет результатов амплификации проводится автоматически во время амплификации с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектирующим амплификатором.
Данные рекомендации к проведению качественного анализа хемолитотрофных микроорганизмов могут служить основой комплексного подхода к определению качественного и количественного (с использованием детектирующих термоциклеров, основанных на применении ПРЦ-РВ [3]) составов смешанных сообществ микроорганизмов. Результаты работы будут использованы при исследовании штаммового полиморфизма А. ¡еггоох1ёапз, идентификации микроорганизмов без выделения в чистые культуры, определения адаптации штаммов микроорганизмов к условиям биовыщелачивания [4; 5], подбору сообщества, обладающего наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта -ценных металлов. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях НИГТЦ ДВО РАН, осуществляющих научный контроль в процессах лабораторного и полупромышленного выщелачивания, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке.
Таблица 2
Программа постановки ПЦР-РВ для амплификатора
№ п/п Температура Время Количество циклов
1. 94°С 3 минуты 1
2. 94°С 10 с 40
65°С * 20 с
72°С 10 с
3. 10°С Хранение -
Приложение. * - регистрация результатов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каравайко Г.И., Росси Дж., Агате А., Грудев С., Авакян З.А. Био-геотехнология металлов. М.: Центр международных проектов ГКНТ, 1989. 375 с.
2. Трухин Ю.П., Хайнасова Т.С., Певенец О.О. Разработка технологии бактериально-химического выщелачивания сульфидной кобальт-медно-никелевой руды // Вестник ДВО РАН. 2011. № 4. С. 101-104.
3. Рогатых С.В., Докшукина А.А., Певенец О.О., Мурадов С.В., Кофиади И.А. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов // Микробиология. 2013. Том 82. № 2. С. 212-217.
4. Рогатых С.В., Докшукина А.А., Хайнасова Т.С., Мурадов С.В., Кофиади И.А. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур ацидофильных хемоли-тотрофных микроорганизмов // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т. 47. № 2. С. 226-230.
5. Хайнасова Т.С., Рогатых С.В., Кузякина Т.И., Корнилова Т.И. Окисленная руда как источник выделения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов для биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2013. № 10. С. 127134. ВЗШ
КОРОТКО ОБ АВТОРАХ -
Рогатых Станислав Валентинович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, электронная почта, rogatykhsv@yandex.ru, Мурадов Сергей Васильевич - кандидат биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник,
Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук.
UDC 550.72
GUIDELINES FOR CARRYING OUT MOLECULAR BIOLOGICAL ANALYSIS OF NATIVE MICROBIAL ASSOCIATIONS COPPER-NICKEL DEPOSITS
Rogatykh S.V., Ph.D, Senior Research Associate, Research Geotechnological center of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Russia,
Muradov S.V., Ph.D., Associate Professor, Senior Researcher, Research Geotech-nological center of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Russia.
These guidelines contain a description of the methods of qualitative and quantitative determination of acidophilus microorganisms Chemolithotrophic Acidithiobacillus thiooxi-dans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans and Ferroplasma acidiphillum in industrial and laboratory samples. Methods aimed at the identification of DNA sequences specific to the above-mentioned microorganisms.
Key words: bioleaching, real-time PCR, acidophilus microorganisms autochthonous microbial community, copper-nickel deposit. REFERENCES
1. Karavajko G.I., Rossi Dzh., Agate A., Grudev S., Avakjan Z.A. Biogeotehnologija metallov (Biogeotechnology metals). Moscow: Centr mezhdunarodnyh proektov GKNT, 1989. 375 p.
2. Truhin Ju.P., Hajnasova T.S., Levenec O.O. Razrabotka tehnologii bakterial'no-himicheskogo vyshhelachivanija sul'fidnoj kobal't-medno-nikelevoj rudy (Development of technology for bacterial-chemical leaching of sulphide cobalt-copper-Nickel ore) // Vestnik DVO RAN. 2011. No 4. pp. 101-104.
3. Rogatyh S.V., Dokshukina A.A., Levenec O.O., Muradov S.V., Kofiadi I.A. Ocenka kachestvennogo i kolichestvennogo sostava soobshhestv kul'tiviruemyh acidofil'nyh mikroorganizmov metodami PCR-RV i analiza biblioteki klonov (Evaluation of qualitative and quantitative community composition of cultivated acidophilic microorganisms by methods of real-time PCR and analysis of library clones) // Mikrobiologija. 2013. V. 82. No 2. pp. 212-217.
4. Rogatyh S.V., Dokshukina A.A., Hajnasova T.S., Muradov S.V., Kofiadi I.A. Is-pol'zovanie tehnologii PCR v real'nom vremeni dlja ocenki jeffektivnosti metodov vydelenija DNK iz kul'tur acidofil'nyh hemolitotrofnyh mikroorganizmov (the Use of technology realtime PCR to assess the effectiveness of the methods of DNA extraction from cultures of acidophilus chemolithotrophic microorganisms) // Prikladnaja biohimija i mikrobiologija. 2011. V. 47. No 2. pp. 226-230.
5. Hajnasova T.S., Rogatyh S.V., Kuzjakina T.I., Kornilova T.I. Okislennaja ruda kak istochnik vydelenija acidofil'nyh hemolitotrofnyh mikroorganizmov dlja biovyshhelachivanija sul'fidnyh medno-nikelevyh rud (The oxide ore as a source of acidophilus chemolithotrophic selection of microorganisms for the bioleaching of sulphide copper-Nickel ores) // Gornyj informacionno-analiticheskij bjulleten'. 2013. No 10. pp. 127-134.
