CC BY
29
-Ф-
УДК 542.6.063
DOI: 10.24411/1728-323X-2018-12060
СИСТЕМЫ ПРАЙМЕРОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СООБЩЕСТВА ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ (КАМЧАТКА)
С. В. Рогатых, старший научный сотрудник, Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук, Петропавловск-Камчатский, rogatykhsv@yandex.ru
В статье приведены экспериментальные данные, полученные при разработке тест-систем, основанных на поли-меразной цепной реакции, необходимых для качественного и количественного анализа оценки структуры сообществ хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов: Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphil-lum, выделенных из сульфидных руд медно-никелевого месторождения Шануч (полуостров Камчатка). На основании последовательностей, полученных для образцов A. thiooxidans и A. ferrooxidans, были созданы системы оли-гонуклеотидов, обладающие видовой специфичностью, которые использовали впоследствии в реакции генотипиро-вания. Для разработки праймеров S. thermosulfidooxidans и F. acidiphillum были использованы последовательности базы данных GenBank. Выравнивание полученных последовательностей позволило выявить вариабельные участки в геномах A. thiooxidans и A. ferrooxidans и использовать их впоследствии при написании видоспецифичных олиго-нуклеотидов. Специфичность праймеров, использованных в исследовании, проверяли методом секвенирования. Последовательности всех полученных ПЦР-продуктов соответствовали последовательностям, полученным для коллекции клонов.
This paper presents the experimental data obtained in the development of test systems based on the polymerase chain reaction necessary for a qualitative and quantitative analysis of the structure of the communities of chemilithotrophic acido-philic microorganisms Acidithiobacillus thiooxidans, Acidi-thiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans and Ferroplasma acidiphillum isolated from sulfide ores of copper-nickel deposit Shanuch (Kamchatka). On the basis of the sequences obtained for the samples of A. thiooxidans and A. ferrooxidans, oligonucleotide systems with species specificity were created, which were subsequently used in the genotyp-ing reaction. To develop primers S. thermosulfidooxidans and F. acidiphillum, sequences of the GenBank database were used. The alignment of the sequences obtained revealed the variable regions in the genomes of A. thiooxidans and A. ferrooxidans and subsequently used them when writing species-specific oli-gonucleotides. The specificity of the primers used in the study was checked by sequencing. The sequences of all the PCR products obtained corresponded to the sequences obtained for the clone collection.
Ключевые слова: биовыщелачивание, олигонуклео-тиды, ацидофильные микроорганизмы, микробное сообщество, медно-никелевое месторождение.
Keywords: bioleaching, oligonucleotides, acidophilic microorganisms, microbial community, copper-nickel deposit.
Биогидрометаллургия позволяет перерабатывать бедные и некондиционные руды, упорные концентраты, технологические продукты и отходы металлургического производства. В биогидрометаллургических процессах, таких как биовыщелачивание и биоокисление, применяют в общей сложности около 20 видов микроорганизмов, способных использовать неорганические вещества рудного материала [1].
Современное использование технологии биовыщелачивания невозможно без четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор.
Целью исследования является дальнейшее усовершенствование методики, основанной на полимеразной цепной реакции в реальном времени и позволяющей осуществлять качественный и количественный анализ бактериальных сообществ, вовлеченных в процесс биовыщелачивания сульфидных руд.
Во многих работах [1—4] предполагается, что в автохтонных сообществах хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из окисленной и неокисленной сульфидной руды медно-никелевого месторождения Шануч (полуостров Камчатка), содержатся Acidithiobacillus thiooxidans, A. ferrooxidans, A. caldus, A. ferrivorans, Alicyclobacillus disulfidooxidans, Sulfobacillus acidophilus, S. thermosulfidooxidans, археи Ferroplasma acidiphilum, "F. acidarmanus", F. cup-ricumulans и др. Для качественного определения образцов этих микроорганизмов в выщелачивающих растворах нами были разработаны видоспецифичные праймеры, способные достоверно выявлять основные биовыщелачиваю-щие микроорганизмы.
Последовательности 16S рРНК были получены из открытых баз данных последовательностей ДНК и экспериментально. При разработке праймеров также использовались нуклеотидные последовательности, полученные ранее в результате секвенирования клонов [5]. На первом этапе были синтезированы два универсальных праймера,
-Ф-
Рис. 1. ПЦР-продукты, полученные с универсальных праймеров с вариабельными участками (указаны стрелкой), которые впоследствии были использованы для создания видо- и родоспецифичных олигонуклеотидов
располагающиеся в консервативных участках последовательности. Участки, амплифицируемые с помощью этих праймеров, составляли 420 п.н. в длину и содержали несколько высоковариабельных доменов. Эти вариабельные домены были впоследствии использованы для подбора мест отжига видоспецифичных праймеров (рис. 1).
На основании последовательностей, полученных для образцов А. Шоох1йат и А. /егговх1йат, были созданы системы олигонуклеотидов, обладающие видовой специфичностью. Эти олиго-нуклеотиды использовали впоследствии в реакции генотипирования.
Генотипирование образцов А. Шоох1йат и А. /еггоох1йат проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией накопления продуктов реакции «в реальном времени». Каждый образец тестировали в двух повторностях. Визуализацию накопления продуктов ПЦР проводили с использованием разрушаемых гибри-дизационных проб типа «такман». ПЦР проводили в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») по следующей программе: 94 °С - 10 с., 64 °С - 20 с., 72 °С - 10 с. в течение 40 циклов, измерение флуоресценции при 64 °С.
Метод генотипирования основан на использовании линейных гидролизующихся проб типа «такман». Олигонуклеотид, комплементарный продукту ПЦР, метят флуорофором и гасителем флуоресценции. В отсутствие мишени флуоро-фор и гаситель сближены (поскольку олигонук-леотид свернут за счет реализации максимально возможного числа водородных связей) и флуоресценция подавлена. При накоплении соответствующего продукта реакции, проба гибридизу-ется на соответствующий ампликон, что ведет к ее разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности 7ад-полимеразы. При разрушении интенсивность сигнала возрастает пропорционально накоплению продукта, что регистрируется прибором и представляется в виде графика накопления флуоресценции.
Для видовой идентификации проводят ПЦР с праймерами, каждый из которых специфичен одному из вариантов последовательности вариабельного участка ДНК. Таким образом, ПЦР-про-дукт образуется только в том случае, если анализируемый образец содержит данный вид бактерий. Если же в реакции с видоспецифичными прай-мерами отсутствует искомый образец, то ПЦР-продукт не образуется. Использование и видоспецифичных зондов, и видоспецифичных прай-меров позволяет повысить точность проводимого анализа.
Поскольку существуют д анные о незначительных генетических отличиях в пределах исследуемого региона у представителей одних и тех же видов, обитающих в различных биоценозах, нами была проведена проверка генетической гетерогенности чистых линий культур. Это было необходимо для получения референсной последовательности и разработки видо- и родоспецифич-ных праймеров на конкретный тип нуклеотидной последовательности. При постановке ПЦР нами были использованы универсальные праймеры, позволяющие амплифицировать ген 16S рРНК большинства известных бактерий и архей (530F и 1490R). ПЦР-продукт был очищен на колонках производства Quiagen США, и клонирован в компетентных клетках E. coli с использованием наборов реактивов pGEM-T Vector Systems производства Promega (США). Затем были отобраны 16 колоний из расчета по 4 колонии на каждый тип образца культур. ДНК бактерий, содержащую вставку, секвенировали с помощью автоматического секвенатора ABI 3000. В секвенсной ПЦР-реакции использовали праймеры, комплементарные участкам вектора, фланкирующим вставку.
В результате секвенирования нами были получены нуклеотидные последовательности для двух культур: A. thiooxidans и A ferrooxidans (рис. 2). При сравнении с последовательностями, содержащимися в базе д анных GenBank Национального ц ен-тра биотехнологической информации США, было выявлено 97 %-ное совпадение последователь-
-Ф-
Рис. 2. Последовательности, полученные при секвенировании ДНК компетентных клеток E. coli, содержащей исследуемую вставку:
a — последовательность, полученная для A. ferrooxidans, b — последовательность, полученная для А. thiooxidans
Рис. 3. Последовательности, полученные при секвенировании ДНК компетентных клеток E. coli, содержащей исследуемую вставку:
а — последовательность, полученная для Sulfobacillus, b — последовательность, полученная для Ferroplasma, с — пример смешанной последовательности, полученной при прямом секвенировании ПЦР-продуктов, амплифициро-ванных при помощи универсальных праймеров
ностей, полученных в результате секвенирования и последовательностей, описанных ранее, как ре-ференсных (архетипных, модельных) для видов А. thiooxidans и А. ferrooxidans (номера доступа последовательностей приведены в табл. 1). Это позволило использовать эти данные при разработке праймеров. Выравнивание полученных последовательностей позволило выявить вариабельные участки в геномах А. thiooxidans и А. ferrooxidans и использовать их впоследствии при написании видоспецифичных олигонуклеотидов.
В случае с родовыми культурами Sulfobacillus и Ferroplasma была получена последовательность, демонстрирующая недостоверное сходство с участком гена 168 рРНК нескольких типов микроорганизмов (рис. 3, a, Ь). Следует также отметить, что при секвенировании продуктов, полученных в результате ПЦР с использованием универсальных праймеров, была получена смешанная последовательность, свидетельствующая о наличии гетерогенного генетического материала в образце культуры (рис. 3, с).
Использовать эти последовательности для разработки праймеров не представлялось возможным. Поэтому для разработки родоспецифичных праймеров нами были использованы последовательности базы данных ОеиБапк Национального центра биотехнологической информации США (номера доступа последовательностей приведены в табл. 1).
С помощью интернет-баз данных, содержащих известные последовательности ДНК, было выявлено, что универсальные праймеры соответствуют последовательностям 168 рДНК многих бактерий и архей, в то время как специфические праймеры обладали высокой специфичностью на видовом уровне. Система для амплификации состоит из трех олигонуклеотидов, каждый из которых имеет в своем составе специфичный для данного вида участок. Два из них необходимы для
Видоспецифичные праймеры, использованные в работе
Таблица 1
№ Последовательность 5'-3' Специфичность Номер доступа последовательности гена 16S рРНК в GenBank
1. TCTTCGGACCTCGCGCTGG A. thiooxidans AY552086
GTCAACAGCAGGCGATATTAGCAC
2. AATCTGCTATTGACGTGAATCC A. ferrooxidans AF465604
CATGAACCATACCGTGGTAAC
3. CCTGAAGCTTAACTCCAGAAAGT F. acidiphilum AJ224936
TCTTTGTAATGCGCGTGTAGC
4. ACCTTCGGGTCAGCGGCGG S. thermo-sulfidooxidans X91080
GCCGGTCTTCGTCCCGACA
-Ф-
Рис. 4. Результаты ПЦР в реальном времени: a — с праймерами, специфичными для А. thibbxidans, Ь — для A. ferrooxidans, с — для рода Ferroplasma, d — для рода SulfobacШus
амплификации и один — гибридизационный — несет метку и предназначен для визуализации процесса накопления специфического продукта. Системы праймеров в эксперименте показали высокую специфичность и точность (рис. 4). На рисунке видно, что сигнал присутствует в пробирках с образцами культур A. thiooxidans и A. ferro-oxidans и в пробирках с образцами родовых культур Ferroplasma sp. и SulfbbacШus sp. Результаты воспроизводимы на культурах бактерий.
Во всех случаях были получены ПЦР-продук-ты, соответствующие последовательностям, специфичным для видов A. thiooxidans и A. ferrooxi-dans, Ferroplasma sp. и SufbbaciUж sp. При проверке праймеров, специфичных для видов A. thibbxidans и A. ferrbbxidans, использовали панель образцов, содержащих каждый из типов исследуемых культур. Сигнал был обнаружен только в пробирках, содержащих искомые виды. Для остальных образцов был зафиксирован отрицательный результат. Полученные данные свидетельствуют о высокой надежности метода при оценке видового состава смешанных культур. Специфичность праймеров, использованных в исследовании, проверяли методом секвенирования. Последовательности всех полученных ПЦР-продуктов соответствовали последовательностям, полученным для коллекции клонов.
В большинстве последних отечественных работ по интенсификации процесса биовыщелачивания не определяется качественный и количественный состав микробной ассоциации, вносимой в выщелачивающий раствор. В основном используют аборигенную микрофлору, находящуюся в исходной пульпе, подразумевая, что аборигенная микрофлора адаптируется к условиям, происходящих в выщелачивающем растворе.
В течение длительного времени считалось, что выщелачивание сульфидов протекает благодаря только тионовым бактериям A. ferrooxidans. Использование в качестве источников энергии широкого круга окисляющих субстратов (сульфидов, элементарной серы и др.), устойчивость бактерий к ионам тяжелых металлов и низким значениям рН, а также широкий уровень изменчивости в экстремальных условиях среды обусловили ведущую роль A. ferrooxidans в бактериально-химических условиях вскрытия золота или выщелачивания цветных металлов [3]. При этом методы интенсификации были направлены на получение активных штаммов A. ferrooxidans и оптимизации среды их жизнедеятельности. Однако в работе П. А. Заулочного [6] сделан вывод о том, что ресурсы по интенсификации процесса бактериального окисления концентратов с использованием монокультуры A. ferrooxidans исчерпаны. В то же время за рубежом и даже в России уже используются патентованные технологии использования смешанных микробных культур — технология BIOX™ на руднике Фэйрвью (Fairview, Южная Африка) использует смешанную микробную ассоциацию в составе A. ferrooxidans, A. thio-oxidans и Leptospirillum ferrooxidans [7]; технология BacTech на заводе Beaconsfield (Австралия) — микробную ассоциацию из A. caldus и L. ferrooxidans; технология BIONORD® на Олимпиадинс-ком месторождении в России — ассоциацию из Sulfobacillus olimpiadicus, F. acidiphillum и L. ferrooxidans [4]; на руднике Килембе (Kilembe, Уганда) — ассоциацию из L. ferrooxidans, A. ferrooxidans, A. caldus, S. thermosulfidooxidans [8]; технология GeoLeach™ на руднике Агнес (Agnes, Южная Африка) использует A. ferrooxidans, A. thio-oxidans, L. ferrooxidans, археи родов Sulfolobus и Acidianus [9]; на руднике Соткамо (Sotkamo, Финляндия) — ассоциацию из A. ferrooxidans, A. thio-oxidans или A. albertensis, A. caldus и L. ferrooxidans [10].
Как видно, перечень используемых микроорганизмов довольно узок и специфичен для определенной территории использования. Анализ практики применения микроорганизмов в технологиях переработки минерального сырья показал, что использование ассоциации микроорганизмов, состоящих из высокоактивных штаммов (умеренно-термофильных в сочетании с мезо-фильными бактериями) является перспективным направлением интенсификации процесса выщелачивания [2]. Возможно, пересмотр состава микробной ассоциации впоследствии будет иметь значение для получения другой ассоциации, обладающей лучшей окисляющей способностью, чем сейчас.
-Ф-
Библиографический список
1. Булаев А. Г., Першина Е. В., Украинцев И. В. Состояние развития современных биогидрометаллургических технологий и перспективы их использования в России // Цветные металлы. — 2016. — № 10. — С. 29—35.
2. Хайнасова Т. С., Левенец О. О. Бактериально-химическое выщелачивание как экологически безопасный способ переработки сульфидной кобальт-медно-никелевой руды // Разведка и охрана недр. — 2015. — № 1. — С. 49—54.
3. Кондратьева Т. Ф., Булаев А. Г., Муравьев М. И. Микроорганизмы в биогеотехнологиях переработки сульфидных руд. — М.: Наука, 2015. — 206 с.
4. Совмен В. К., Гуськов В. Н., Белый А. В. Переработка золотоносных руд с применением бактериального окисления в условиях Крайнего Севера. — Новосибирск: Наука, 2007. — 144 с.
5. Рогатых С. В., Докшукина А. А., Левенец О. О., Мурадов С. В., Кофиади И. А. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов // Микробиология. — 2013. — Том 82. — № 2. — С. 212—217.
6. Заулочный П. А. Интенсификация технологии бактериального выщелачивания упорных золотосульфидных концентратов с использованием ассоциации микроорганизмов, включая умеренно-термофильные бактерии: дис. ... канд. техн. наук: 25.00.13. — М., 2011. — 168 с.
7. Aswegen P. C. van, Niekerk J. van, Olivier W. The BIOX™ process for the treatment of refractory gold concentrate // In: Biomining. Ed. by D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. — P. 1—35.
8. Foucher S., Battaglia-Brunet F., d'Hugues P., Clarens M., Godon J. J., Morin D. Evolution of the bacterial population during the batch bioleaching of a cobaltiferous pyrite in a suspended-solids bubble column and comparison with a mechanically agitated reactor // Hydrometallurgy. — 2003. — No. 71. — P. 5—12.
9. Harvey T. J., Bath M. The GeoBiotics GEOCOAT® Technology — progress and challenges // In: Biomining. Ed. By D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. — P. 97—112.
10. Puhakka J. A., Kaksonen A. H., Riekkola-Vanhanen M. Heap Leaching of Black Schist // In: Biomining. Ed. By D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. — P. 139—152.
PRIMER SYSTEMS USED TO IDENTIFY REPRESENTATIVES OF THE COMMUNITY OF CHEMOLITHOTROPHIC MICROORGANISMS IN THE SHANUCH DEPOSIT (KAMCHATKA)
S. V. Rogatykh, Senior Researcher, rogatykhsv@yandex.ru, Research Geotechnological Centre, Far Eastern Branch of Russian Academy of Sciences, Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia.
References
1. Bulaev A. G., Pershina E. V., Ukraincev I. V. The state of development of modern biohydrometallurgical technologies and the prospects for their use in Russia // Non-ferrous metals. 2016. No. 10. P. 29—35. [in Russian]
2. Hajnasova T. S., Levenec O. O. Bacterial-chemical leaching as an environmentally safe method for processing sulphide cobalt-copper-nickel ore // Exploration and protection of mineral resources. 2015. No. 1. P. 49—54. [in Russian]
3. Kondrat'eva T. F., Bulaev A. G., Murav'ev M. I. Microorganisms in biogeotechnologies for processing sulphide ores. Moscow, Nauka, 2015. 206 p. [in Russian]
4. Sovmen V. K., Gus'kov V. N., Belyj A. V. Processing of gold-bearing ores with application of bacterial oxidation in conditions of the Far North. Novosibirsk, Nauka, 2007. 144 p. [in Russian]
5. Rogatykh S. V., Dokshukina A. A., Levenets O. O., Muradov S. V., Kofiadi I. A. Evaluation of Quantitative and Qualitative Composition of Cultivated Acidophilic Microorganisms by Real-Time PCR and Clone Library Analysis // Microbiology. 2013. Vol. 82. No. 2. P. 210—214. [in Russian]
6. Zaulochnyj P. A. Intensifikacija tehnologii bakterial'nogo vyshhelachivanija upornyh zolotosul'fidnyh koncentratov s is-pol'zovaniem associacii mikroorganizmov, vkljuchaja umerenno-termofil'nye bakterii: dis. ... kand. tehn. nauk: 25.00.13. Moscow, 2011. 168 p. [in Russian]
7. Aswegen P. C. van, Niekerk J. van, Olivier W. The BIOX™ process for the treatment of refractory gold concentrate // In: Biomining. Ed. by D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. P. 1—35.
8. Foucher S., Battaglia-Brunet F., d'Hugues P., Clarens M., Godon J. J., Morin D. Evolution of the bacterial population during the batch bioleaching of a cobaltiferous pyrite in a suspended-solids bubble column and comparison with a mechanically agitated reactor // Hydrometallurgy. 2003. No. 71. P. 5—12.
9. Harvey T. J., Bath M. The GeoBiotics GEOCOAT® Technology — progress and challenges // In: Biomining. Ed. By D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. P. 97—112.
10. Puhakka J. A., Kaksonen A. H., Riekkola-Vanhanen M. Heap Leaching of Black Schist // In: Biomining. Ed. By D. E. Rawlings and D. Barrie Johnson. Springer—Verlag Berlin Heidelberg, 2007. P. 139—152.
