CC BY
59
© C.B. Рогатых, Л.А. Позолотина, А.И. Косииина, 2016
УДК 550.72
C.B. Рогатых, Л.А. Позолотина, А.И. Косииина
ВЫЯВЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ ОТЖИГА ПРАЙМЕРОВ ПНР-ТЕСТ-СИСТЕМ ИЛЕНТИФИКАЦИИ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕЛНО-НИКЕЛЕВЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ
Представлены экспериментальные данные по проведению градиентной полимеразной цепной реакции с целью выявления оптимальной температуры отжига праймеров. ПЦР-тест-система олигонуклеоти-дов, использованная в работе, реализуется при выполнении работ по созданию коллекции аборигенных ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов различных руд сульфидных медно-никелевых месторождений. Показано влияние температуры отжига праймеров на выделенную пробу ДНК основных представителей биовышелачиваю-шегося сообшества.
Ключевые слова: месторождение Шануч, полимеразная цепная реакция, хемолитотрофные микроорганизмы, тест-системы олигонуклео-тидов.
Территория Российской Федерации, в том числе и Камчатский край, располагает минерально-сырьевой базой, способной развить в широких масштабах биометаллургию. Шанучское месторождение на западе Камчатки обладает богатыми сульфидными медно-никелевыми рудами для переработки [1]. Современное внедрение технологий биометаллургии невозможно без знания четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор [2-4 и др.]. Это позволяет интенсифицировать процессы биовыщелачивания не только путем проведения модельных экспериментов с различными микробными ассоциациями, но и оперативно контролировать и отслеживать процесс выщелачивания, вносить коррективы и управлять микробной популяцией при мониторинге процесса.
В настоящее время определение видового состава сообществ ведется, как правило, с использованием молекулярно-биологических методов, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК, с помощью технологий анализа библиотеки клонов, секвенирования по Сэнгеру или NGS, гибридизационного ДНК-анализа in situ и других. В НИГТЦ ДВО РАН разработан и внедрен в исследовательский процесс проект методических рекомендаций проведения качественного и количественного молекулярно-биологического исследования смешанных бактериальных сообществ, используемых в реакторах при биовыщелачивании, основанный на по-лимеразной цепной реакции в режиме реального времени. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось выявление оптимальной температуры отжига праймеров, входищих в состав ПЦР-тест-систем. Оптимальную температуру отжига праймеров определяли постановкой градиентной ПЦР с температурой отжига праймеров в диапазоне 60-72оС с последующей оценкой количества ПЦР-продукта методом агарозно-го гель-электрофореза.
Выделение ДНК смешанных культур автохтонных хемоли-тотрофных микроорганизмов, полученных из окисленной и не-окисленной руд кобальт-медно-никелевого месторождения Шануч (Камчатка), осуществляли по методике, описанной ранее [5]. В выделенном микробном сообществе предположительно находились Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphillum. ПЦР проводили с помощью набора GenPak®PCR Core производства ООО «Лаборатория Изоген» (Москва) на амплификаторе Eppendorf AG22331 Haamburg (Германия) по следующей программе: 95оС - 30 с, TM - 30 с, 72оС - 20 с в течение 40 циклов. Системы олигонуклеотидов представлены в табл. 1. Электрофорез проводили в 1 % агарозном геле 30 мин при 200 мА, 65 Вт, 300 В.
Результаты приведены на рис. 1. На нем видно, что оптимальной температурой отжига праймеров для A. thiooxidans (первые лунки в группах температур) не выявлено. Это скорее всего связано с тем, что в исследуемой пробе данный вид не представлен. Оптимальными температурами отжига праймеров
Таблица 1
Системы олигонуклеотидов, использованные в работе [6]
№ п/п Название Последовательность 5'-3' Специфичность
1. ТСТТСССДССТСССССГСС А. thiooxidans
СТСДДСДССДССССДТДТТДС СДС
2. ДГ ДДТСТССТДТТСДССТСДДТСС А. ferrooxidans
ДЖ СДТСДДССДТДСССТССТДДС
3. Рег-6 ССТСДДССТТДДСТССДСДДДС Т Р. acidiphilum
Рег-г1 ТСТТТСТДДТСССССТСТДСС
4. Би1М1 ДССТТССССТСДССССССС Б. thermosulfido-oxidans
БиК-г СССССТСТТССТССССДСД
5. ирг2-6 ТССДТСССУСТССТСДССТССТ Универсальность на общую биомассу микробного сообщества
ирг3-г ТСДСССССССТСТСТНСДДСС
Рис. 1. Электрофореграммы ПЦР-продуктов, наработанных с использованием праймеров для А. thiooxidans, А. ferrooxidans, Б. termosulfidooxidans, Г. acidiphilum, универсальных на общую биомассу микробного сообщества соответственно. Температура отжига праймеров: лунки 1-5 - 60,1оС, лунки 6-10 - 61,9оС, лунки 11-15 -64,9оС, лунки 16-20 -66,5°С, лунки 21-25 -68,1оС, лунки 26-30 -69,6оС, лунки 31-35 - 72,0°С, М - маркер молекулярного веса
для A. ferrooxidans (вторые лунки в группах) являются от 60,1 до 64,9°С. Оптимальной температурой отжига праймеров для Б. termosulfidooxidans (третьи лунки в группах) является весь спектр поставленных температур, за исключением 72,0оС. Для Р. acidiphilum оптимальной температурой отжига праймеров (четвертые лунки в группах температур) также не выявлено. Это также связано с тем, что в исследуемой пробе данный вид
не представлен или тест-системы плохо сработали и амплификация прошла неудачно. Оптимальной температурой отжига для универсальных на общую биомассу микробного сообщества праймеров (пятые лунки в группах) является весь спектр поставленных температур.
Обобщив данные, можно сделать вывод о том, что для используемых ПЦР-тест-систем оптимальной температурой отжига праймеров является температура в 64,9°С. ПЦР-тест-системы, используемые в НИГТЦ ДВО РАН при выполнении работ по созданию коллекции аборигенных видов и штаммов хемолитотрофных бактерий различных руд сульфидных медно-никелевых месторождений, основаны на модификации методики ПЦР, реализованной на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции. Данный метод превосходит классические культуральные и молекулярные методы. Он прост в применении и обладает рядом преимуществ, определяющих его максимальную приспособленность для нужд микробиологического мониторинга в культуральной среде бактериальных сообществ ацидофильных хемолитотрофов: это возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие, максимальная диагностическая мощность; чувствительность и специфичность, достигающие 100 %; высокая воспроизводимость; сжатые сроки исследования; умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость. Аналоги данной методики реализованы при идентификации ацидофильных хе-молитотрофов в процессах биовыщелачивания за рубежом, в частности в КНР [7].
- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Трухин Ю.П. Камчатская никеленосная провинция / Ю. П. Трухин, В.А. Степанов, М.Д. Сидоров // Доклады Академии наук. - 2008. - Т. 418. -№ 6. - С. 802-805.
2. Rawlings D.E. Characteristics and adaptability of iron- and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates / D. E. Rawlings // Microbial cell factories. - 2005. - Vol. 4. - No. 13. - P. 1-15.
3. Каравайко Г.И. Ёитотрофные микроорганизмы окислительных циклов серы и железа / Г.И. Каравайко, Г.А. Дубинина, Т.Ф. Кондратьева // Микробиология. - 2006. - Т. 75. - № 5. - С. 593-629.
4. Вайнштейн М.Б. Состав бактериальных сообществ в отвалах сульфидных никелевых руд / М. Б. Вайнштейн, А. В. Вацурина, С. Ё. Соколов,
А. Е. Филонов, Э. В. Адамов, Ё. Н. Крылова // Микробиология. - 2011. - Т. 80. - № 4. - C. 560-567.
5. Рогатых С.В. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур ацидофильных хемолитотрофнык микроорганизмов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, Т. С. Хайнасова, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади // Прикладная биохимия и микробиология. - 2011. - Том 47. - № 2. - С. 226-230.
6. Рогатых С.В. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, О. О. Ёеве-нец, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади // Микробиология. - 2013. - Том 82. -№ 2. - С. 212-217.
7. Bowei C. Application of clone library analysis and real-time PCR for comparison of microbial communities in a low-grade copper sulfide ore bioheap leachate / C. Bowei, L. Xingyu, L. Wenyan, W. Jiankang // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2009. - Vol. 36. - P. 1409-1416.
8. Хайнасова Т.С. Влияние температурного режима на биовыщелачивание никеля, меди и кобальта из сульфидной кобальт-медно-никелевой руды / Т.С. Хайнасова, С.В. Рогатых, А.А. Балыков, О.А. Яковишина // Горный информационно-аналитический бюллетень. 2013. № 10. С. 135-138. i«srj=j
КОРОТКО ОБ АВТОРАХ
1Рогатых Станислав Валентинович - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, [email protected], 1Позолотина Лилия Андреевна - младший научный сотрудник, 2Косицина Анна Игоревна - научный сотрудник,
Научно-исследовательский геотехнологический центр Дальневосточного отделения Российской академии наук,
2Камчатский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии.
UDC 550.72
IDENTIFICATION OF THE OPTIMAL TEMPERATURE ANNEALING OF PRIMERS PCR TEST SYSTEMS CHEMOLITHOTROPHIC IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS COPPER-NICKEL DEPOSITS
Rogatykh S.V., Ph.D, Senior Research Associate, Research Geotechnological center of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Russia, Pozolotina L.A., Junior Researcher, Research Geotechnological center of the Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences, Russia,
Kositsina A.I., Researcher, Kamchatka Research Institute of Fisheries and Oceanography, Russia.
This article presents experimental data for the gradient PCR to identify optimal annealing temperature of the primers. PCR test system of the oligonucleotides used in the work realized during the work on the creation of collections of aboriginal associations Chemolith-otrophic microorganisms of various types of copper-nickel sulfide deposits. The influence of annealing temperature on the selected sample of DNA bioleaching main representatives of the community.
Key words: deposit Shanuch, polymerase chain reaction, system test oligonucleotides, chemolithotrophic microorganisms. REFERENCES
1. Truhin Ju.P. Kamchatskaja nikelenosnaja provincija (Kamchatka Nickel province) / Ju. P. Truhin, V. A. Stepanov, M. D. Sidorov // Doklady Akademii nauk. 2008. Vol. 418. No 6. pp. 802-805.
2. Rawlings D.E. Characteristics and adaptability of iron- and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates (Characteristics and adaptability of iron - and sulfuroxidizing microorganisms used for the recovery of metals from minerals and their concentrates) / D. E. Rawlings // Microbial cell factories. 2005. Vol. 4. No. 13. pp. 1-15.
3. Karavajko, G. I. Litotrofnye mikroorganizmy okislitel'nyh ciklov sery i zheleza (Autotrophic microorganisms of the oxidative cycles of sulfur and iron) / G.I. Karavajko, G.A. Dubinina, T.F. Kondrat'eva // Mikrobiologija. 2006. Vol. 75. No 5. pp. 593-629.
4. Vajnshtejn, M. B. Sostav bakterial'nyh soobshhestv v otvalah sul'fidnyh nikelevyh rud (Composition of bacterial communities in sulfide Nickel ore waste dumps) / M.B. Vajnshtejn, A.V. Vacurina, S.L. Sokolov, A.E. Filonov, Je.V. Adamov, L.N. Krylova // Mikrobiologija. 2011. Vol. 80. No 4. pp. 560-567.
5. Rogatyh S.V. Ispol'zovanie tehnologii PCR v real'nom vremeni dlja ocenki jeffektivnosti metodov vydelenija DNK iz kul'tur acidofil'nyh hemolitotrofnyh mikroorganizmov (Use of technology real-time PCR to assess the effectiveness of the methods of DNA extraction from cultures of acidophilic microorganisms chemolitotrophic) / S.V. Rogatyh, A.A. Dokshukina, T.S. Hajnasova, S.V. Muradov, I.A. Kofiadi // Prikladnaja biohimija i mikrobiologija. 2011. Vol. 47. No 2. pp. 226-230.
6. Rogatyh S.V. Ocenka kachestvennogo i kolichestvennogo sostava soobshhestv kul'tiviruemyh acidofil'nyh mikroorganizmov metodami PCR-RV i analiza biblioteki klonov (Evaluation of qualitative and quantitative community composition of cultivated acidophilic microorganisms by methods of real-time PCR and analysis of library clones) / S.V. Rogatyh, A.A. Dokshukina, O.O. Levenec, S.V. Muradov, I.A. Kofiadi // Mikrobiologija. 2013. Vol. 82. No 2. pp. 212-217.
7. Bowei C. Application of clone library analysis and real-time PCR for comparison of microbial communities in a low-grade copper sulfide ore bioheap leachate (Application of clone library analysis and real-time PCR for comparison of microbial communities in a low-grade copper sulfide ore bioheap leachate) / C. Bowei, L. Xingyu, L. Wenyan, W. Jiankang // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2009. Vol. 36. pp. 1409-1416.
8. Hajnasova, T. S. Vlijanie temperaturnogo rezhima na biovyshhelachivanie nikelja, medi i kobal'ta iz sul'fidnoj kobal't-medno-nikelevoj rudy (Effect of temperature conditions on bioleaching of Nickel, copper and cobalt from sulphidic cobalt-coppernickel ore) / T.S. Hajnasova, S.V. Rogatyh, A.A. Balykov, O.A. Jakovishina // Gornyj informacionno-analiticheskij bjulleten'. 2013. No 10. pp. 135-138.
