Метод создания никель-активированной поверхности на полистирольных планшетах для иммобилизации гистидинсодержащих рекомбинантных пептидов

Ткачев Сергей Викторович; Фомина Е.Г.; Владыко А.С.

оригинальные статьи

12. Shatokhin M.N., Konoplya A.I., Teodorovich O.v., Gavrilyuk v.P. Immu-nometabolic status and the red blood cells in the pathology of the prostate gland; correction disorders. Moscow: Publishing House of KSMU; 2012. (in Russian)

13. Kurts c., Panzer U., Anders H.J., Rees A.J. The immune system and kidney disease: basic concepts and clinical implications. Nat. Rev. Immunol. 2013; 13(10): 738—53. doi: 10.1038/nri3523.

14. Drannik G.N., Driyanskaya v.E., Gaysenyuk F.Z., Rudenko M.Yu., Stepanova n.M., Bagdasarova I.v. et al. Factors intercellular cooperation in immunogenesis pyelonephritis. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya. 2013: 13(1): 13—9. (in Russian)

15. Konoplya A.I., Teodorovich O.v., Shatokhin M.N., Gavrilyuk v.P., Ma-vrin M.Yu. chronic prostatitis, prostate adenoma and immunity: disoders and correction. Urologiya. 2013; (4): 99—103. (in Russian)

16. Konoplya A.I., Shatokhin M.N., Gavrilyuk v.P., Karaulov A.v. Immunological problems of chronic prostatitis. Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya. 2015; (2): 29—34. (in Russian)

17. Abidov M.T., Bashtanenko A.F., Nelyubov M.v., Shkalev M.v., Kova-levskaya E.O., Kalyuzhin O.v. Regulation of immune reactions in the treatment of chronic and acute inflammatory diseases. Yakutskiy med-itsinskiy zhurnal. 2004; 3(7): 58—60. (in Russian)

18. Bel'chusova L.N., Gur'yanova, E.A., Belova A.N. The dynamics of immunological long-exponent of blood during therapy in patients with chronic pyelonephritis. Vestnik Chuvashskogo Universiteta. 2012; (3): 304—9. (in Russian)

19. Popkov v.M., Dolgov A.B., Zakharova N.B., Ponukalin A.N., varaksin N.A. Urinary biomarkers for acute pyelonephritis. Saratovskiy nauchni-meditsinskiy. zhurnal. 2013; 9(1): 110—5. (in Russian)

20. Nikulicheva v.I., Safuanova G. Sh., Karpina N.S., Lekhmus T.Yu., vagapova D.R., Alonova S.v. Immunological markers of chronic

pyelonephritis. Byulleten' VSNTS SO RAMN. 2014; 95(1): 45—9. (in Russian)

21. Spencer J.D., Schwaderer A.L., Becknell B., watson J., Hains D.S. The innate immune response during urinary tract infection and pyelonephritis. Pediatr. Nephrol. 2014; 29(7): 1139—49. doi:10.1007/s00467-013-2513-9.

22. Anis S. Immunologists perspective of nephropathology. J. Nephropathol. 2016; 5(2): 62—4. doi: 10.15171/jnp.2016.11

23. Zemskov A.M., Zemskov v.M., Zoloedov v.I., Zemskova v.A., Kuznets-ov A.N. Unorthodox Immunology. [Neortodoksal'naya immunologiya]. Moscow: Triada-x; 2013. (in Russian)

24. Loktionov A.L., Konoplya A.I., Evsegneeva I.v. Acute pancreatitis as a clinical and immunological problems. Fiziologiya i patologiya immunnoy sistemy. Immunofarmakogenetika. 2013; 17(11): 3—17. (in Russian)

25. Spits H., Artis D., colonna M., Diefenbach A., DiSanto J.P., Eberl G. et al. Innate lymphoid cells — aproposal for a uniform nomenclature. Nat. Rev. Immunol. 2013; 13: 145—9.

26. Mundi H., Björksten B., Svanborg C., Ohman L., Dahlgren C. Extracellular release of reactive oxygen species from human neutrophils upon interaction with Escherichia coli strains causing renal scarring. Infect. and Immun. 1991; 59(11): 4168—72.

27. Olson P.D., Hunstad D.A. Subversion of host innate immunity by uro-pathogenic escherichia coli. Pathogens. 2016; 5(1): 2. doi:10.3390/ pathogens5010002.

28. Karaulov A.v., Kalyuzhin O.v. Immunotherapy of infectious diseases: problems and perspectives. Ter. arkh. 2013; 85(11): 100—8. (in Russian)

Поступила 01.02.16 Принята в печать 07.06.16

МЕТОДЫ

Ткачев С.В., Фомина Е.Г., Владыко А.С.

МЕТОД СОЗДАНИЯ НИКЕЛЬ-АКТИВИРОВАННОЙ ПОВЕРХНОСТИ НА ПОЛИСТИРОЛЬНЫХ ПЛАНШЕТАХ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ГИСТИДИНСОДЕРЖАЩИХ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЕПТИДОВ

ГУ «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» Министерства здравоохранения Республики Беларусь, 220114, г Минск, Беларусь

Разработан метод химической модификации полистирольных планшетов, в основе которого лежит окисление полистирола персульфатом аммония и последующая обработка окисленной поверхности NaOH. Модификация приводит к появлению на поверхности полимера карбоксильных групп, которые могут быть использованы для проведения дальнейшей, более специфичной модификации твердой фазы. Для создания №2+-активированной поверхности с карбоксильными группами связывали тетраэтиленпентамин карбодиимидным методом, затем на аминированной поверхности связывали комплекс производного малеинового ангидрида с лигандом, хелатирующим ионы №2+, NN бис(карбоксиметил)лизином. Полученный таким образом активированный планшет после насыщения №2+ специфически связывал на своей поверхности рекомбинантный гистидинсодержащий IgG человека ^-фрагмент).

Ключевые слова: полистирольный планшет; персульфат аммония; N,N-бис(карбоксиметил)лизин; His-tags пептиды; ИФА.

Для цитирования: Ткачев С.В., Фомина Е.Г., Владыко А.С. Метод создания никель-активированной поверхности на полистирольных планшетах для иммобилизации гистидинсодержащихрекомбинантных пептидов. Иммунология. 2016; 37(5): 276-280. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-5-276-280

Для корреспонденции: Ткачев Сергей Викторович, канд. биол. наук, ведущий науч. сотр. лаборатории биотехнологии и диагностики особо опасных инфекций Республиканского научно-практического центра эпидемиологии и микробиологии, E-mail: pjc40@mail.ru.

original article

Tkachov S.V., Fomina E.H., Vladiko A.S.

METHOD creation OF NICKEL-ACTIVATED surface ON polystyrene PLATES for IMMOBILIZATION

OF recombinant peptides containing histidine

State department "The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology", Minsk, Belarus A chemical method for surface modification of polystyrene immunological plates has been developed. The two stages are performed separately; the first is oxidative by ammonium persulfate and the second is treatment a surface of sodium hydroxide. The treatment introduced of carboxyl groups onto the plate surface, carboxyl groups can be use as base for more special modification of the plate. To demonstrate possible applications of the modification plate we have carried out covalent immobilization of tetraethylene pentamine on the plate by carbodiimide method. On this amination surface we bind of N, N-bis[carboxymethyl]lysine coupled with maleic anhydride copolymer. The plate was then charged with Ni2+ for the capture of the recombinant polyhistidine-tag human IgG Fc fragment.

Keywords: polystyrene microtiter plate; ammonium persulfate; N,N-bis[carboxymethyl]lysine; His-tag peptides; ELISA.

For citation: Tkachov S.V., Fomina Е.H., Vladiko A.S. Method creation of nickel-activated surface on polystyrene plates for immobilization of recombinant peptides containing histidine. Immunologiya.2016; 37(5): 276-280. DOI: 10.18821/02064952-2016-37-5-276-280

For correspondence: Tkachov Sergey Victorovich, lead researcher of the laboratory of biotechnology and immunodiagnostic of very dangerous infections The Republican Research and Practical Center for Epidemiology and Microbiology, Email: pjc40@mail.ru.

conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Funding. The study had no sponsorship.

Received 24.05.16 Accepted 07.06.16

введение

Качество современных диагностических тест-систем, основанных на принципах твердофазного иммуноанализа, во многом определяется свойствами полимерного носителя, на поверхности которого происходит иммунологическая реакция. Полистирол — один из наиболее часто используемых полимеров в изготовлении твердой фазы для иммунофер-ментных диагностических тест-систем. Пассивная сорбция белковых иммунореагентов на гидрофобной поверхности полистирола сопровождается структурными изменениями молекулы белка и снижением доступности функциональных участков для взаимодействия с антителами или антигенами [1—3]. Решение этой проблемы возможно путем химической модификации полистирола, в результате которой поверхность полимера обогащается функциональными группами (гидроксильными, карбоксильными, альдегидными, аминогруппами и т.д.). При проведении химической модификации для введения в молекулу полистирола функциональных групп, как правило, используют агрессивные среды (смесь концентрированных НЫОэ и Н^04, хлорсульфоновая кислота, раствор КМп04 в Н^04) [4—6]. В результате возможно снижение прозрачности полистирола и его деформация. В то же время известно, что полистирол может эффективно окисляться водными растворами солей пероксодисерной кислоты (персульфатами аммония, натрия и калия) без повреждения поверхности и снижения прозрачности [7, 8].

Химически модифицированный полистирол может стать удобной инженерной платформой для создания на его основе диагностических ИФА тест-систем, в которых биологический компонент (антиген или антитело) будет специфически связан с полимером-носителем. Это позволит снизить степень трансформации белка, увеличить силу его связывания с поверхностью, сориентировать активные центры молекулы в направлении возможного протекания реакции, увеличить соотношение сигнал/шум при проведении анализа, что в итоге позволит увеличить специфичность и чувствительность разрабатываемых диагностических тест-систем. Если в роли такого биологического компонента выступает рекомбинантный гистидинсодер-жащий полипептид (His-tags полипептид), его специфическое связывание на поверхности можно осуществить благодаря способности гистидина образовывать координационные связи с ионами металлов, в свою очередь связанных с металл-аффинным сорбентом, иммобилизованным на поверхности. Подобный

подход реализован в металл-хелатной хроматографии, применяемой для очистки His-tags полипептидов, а также в средствах лабораторной диагностики, использующих в качестве антигена рекомбинантные His-tags полипептиды [9]. В литературе описаны методы получения металл-аффинного слоя на различных твердых поверхностях и с использованием различных стратегий [10—14]. Часто для создания металл-аффинного слоя, способного хелатировать металлы (Zn2+, Cu2+, Ni2+ и Co2+), используют ПШ-бис(карбоксиметил)лизин (БКМЛ), представляющий собой бифункциональное производное нитрилотриуксусной кислоты и лизина, способное образовывать координационный комплекс с ионами металла. Комплекс БКМЛ-№+ обладает высоким аффинитетом в отношении His-tags полипептидов (Kd ~10-13) [15] и обеспечивает их высокоспецифичное и высокоселективное связывание на подложке.

Цель данного исследования — разработать поэтапный метод химической модификации 96-луночного полистироль-ного планшета, в результате которой на поверхности планшета образуется слой химически связанного никеля, а также продемонстрировать возможность специфической сорбции на поверхности №2+-активированного планшета рекомби-нантного гистидинсодержащего Fc-фрагмента IgG человека (His-tags Fc IgG).

Материал и методы

В работе использовали следующие материалы и реактивы: персульфат аммония ((NH4)S208), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (ЭДК), полиметил-виниловый эфир малеинового ангидрида (пМВМА), l-ß-D-изопропилтиогалактопиранозид (ИПТГ), N-гидрокси-сукцинимид (ГС), П,№бис(карбоксиметил)лизин (БКМЛ), бычий сывороточный альбумин (БСА), Твин 20, 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМБ), поликлональные кроличьи антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена, имидазол производства Sigma-Aldrich (США); неорганические соли, тетраэтиленпентамин (ТЭПА), гидроксид натрия (NaOH), уксусную кислоту, диметилсульфоксид (ДМСО), гуанидин тиоцианат, толуидиновый синий (ТС) и кислый оранжевый II (КО II) производства Karl Roth (Германия). Для приготовления растворов использовали деионизированную воду (Milli-Q, 18 МОмсм).

Модификации подвергали 96-луночные полистирольные планшеты для ИФА производства Greiner (Германия). В каче-

оригинальные статьи

стве контроля связывания His-tags полипептида использовали 96-луночные никель-активированные полистирольные планшеты Pierce Nickel Coated Plates (Nickel Plate) производства Thermo Fisher Scientific (США). Оптическую плотность растворов измеряли на планшетном фотометре производства DAS (Италия).

Окислительная модификация полистирольного планшета. В лунки планшета вносили по 200 мкл 10 или 30% водного раствора (NH4)2S208. Окисление планшета проводили при температуре 80 °C в течение 2; 4 и 6 ч. После окисления планшет многократно промывали H2O.

Степень модификации планшета оценивали по количеству карбоксильных групп, образовавшихся на поверхности полистирола в результате воздействия (NH4)2S208. Карбоксильные группы определяли по реакции с ТС. Для этого в лунки планшета вносили по 200 мкл 0,5 мМ раствора ТС, приготовленного на 10 мМ NaOH (pH 10). Реакцию проводили в течение 5 ч при 20 °C. Не связавшийся с поверхностью краситель удаляли, промывая планшет 10 мМ NaOH и затем H2O. Десорбцию связавшегося ТС проводили в 50% растворе уксусной кислоты в течение 30 мин, затем пробы переносили в лунки чистого планшета и измеряли оптическую плотность при 630 нм [16].

Активирование карбоксильных групп и аминирование планшета. Карбоксильные группы поверхности активировали смесью ЭДК/ГС (по 100 мМ каждого реагента). Реакцию проводили в H2O при 20 °C в течение 60 мин. После промывки планшета в лунки вносили по 100 мкл 100 мМ ТЭПА (pH 7,2), инкубировали в течение ночи при 20 °C. Далее планшет последовательно промывали 0,25% додецилсульфатом натрия, 1 М NaCl и фосфатно-солевым буфером (ФСБ; 10 мМ, pH 7,4, 0,15 М NaCl). Содержание свободных аминогрупп на поверхности планшета определяли по реакции с красителем КО II. Для этого в лунки планшета вносили по 200 мкл 0,5 мМ водного раствора КО II (pH 3,0). Реакцию проводили в течение 5 ч при 20 °C. Не связавшийся с поверхностью краситель удаляли, промывая планшет H2O (pH 3,0). Десорбцию связавшегося красителя проводили при pH 12 в течение 30 мин, оптическую плотность проб измеряли при 485 нм [17]. Концентрацию карбоксильных и аминогрупп определяли по калибровочному графику, принимая при этом, что 1 моль -COOH или -NH2 связывается с 1 молем соответствующего красителя.

Связывание комплекса полиметилвинилового эфира малеинового ангидрида/П,П-бис(карбоксиметил)лизина (пМВМА/БКМЛ) с аминированным планшетом, насыщение никелем. Комплекс пМВМА/БКМЛ синтезировали следующим образом. В 3 мл 0,5% раствора пМВМА, приготовленного на ДМСО, вносили 0,25 мл 200 мМ БКМЛ, растворенного в 0,2 М Na2CO3, инкубировали 3 ч при 37 °C. В лунки планшета, аминированного ТЭПА, вносили по 100 мкл комплекса пМВМА/БКМЛ. Связывание пМВМА/БКМЛ с поверхностью лунок проводили в течение ночи при 20 °C, после чего планшет промывали 0,05% Твин 20. Далее в лунки вносили по 200 мкл 2% раствора БСА в Трис-буфере (50 мМ Трис-HCl; 0,15 М NaCl; pH 7,4), инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч, промывали Трис-буфером (50 мМ Трис-HCl; 1,0 М NaCl; pH 7,4) и 0,05% Твин 20. После промывок в лунки вносили по 200 мкл 50 мМ раствора сульфата никеля. Насыщение планшета никелем проводили при 20 °C в течение 30 мин, затем планшет промывали 0,05% Твин 20 и Трис-буфером (50 мМ Трис-HCl; 0,5 М NaCl; pH 7,4).

Получение His-tags IgG человека (Fc-фрагмент). В качестве исходного вектора для клонирования и получения His-tags Fc IgG человека использована плазмида pJC40. Особенностью данной плазмиды служит наличие дополнительного фрагмента, кодирующего 10 остатков гистидина, которые при трансляции пептида локализуются в его N-концевой части. В качестве матрицы выбран фрагмент ДНК, кодирующий 190 а.о. Fc-фрагмента IgG человека (CH2 и CH3 домены). Для экспрессии His-tags Fc IgG плазмида pJC40 трансформирована

в компетентные клетки E. rnli, штамм BL21(DE3). Для индукции синтеза в среду вносили ИПТГ в конечной концентрации 0,4 мМ в момент достижения клеточной культурой OD600 = 0,3. Клеточную массу объемом 50 мл, содержащую His-tags Fc IgG, осаждали центрифугированием (10 000 об/мин, 10 мин). Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора, содержащего 50 мМ Tris-HCl и 0,5 мМ NaCl. Клетки разрушали ультразвуком (20 кГц, 20 с х 2 раза). В лизат добавляли гуанидин тиоцианат до конечной концентрации 2,2 М. Крупные клеточные обломки и нерастворимые агрегаты белков осаждали центрифугированием. Электрофоретический анализ осветленного лизата выявил наличие мажорной фракции в области 32—33 кДа, которая отсутствовала в контрольном образце и свидетельствовала о присутствии в лизате His-tags Fc IgG.

Проведение ИФА. Полученную суспензию, содержащую His-tags Fc IgG в концентрации ~0,2 мкг/мкл (по данным электрофореза), разводили в 40 раз 10 мМ фосфатно-солевым буфером (ФСБ; 0,15 М NaCl; pH 7,4), вносили в лунки Ni-активированных планшетов в объеме 100 мкл и инкубировали в течение ночи при 4 °C. После инкубации планшеты промывали ФСБ (1 М NaCl; pH 7,4). Далее в лунки вносили по-ликлональные кроличьи антитела к IgG человека, меченные пероксидазой хрена, инкубировали 1 ч при комнатной температуре, промывали ФСБ и добавляли цитратно-фосфатный буфер, содержащий H202 и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Через 15 мин реакцию останавливали добавлением 2 М H2SO4. Оптическую плотность проб измеряли при 450 нм.

Полученные данные статистически обрабатывались с помощью пакета Statistica 6.0 (StatSoft, США). Данные в таблицах представлены в виде средних значений и их стандартных ошибок.

результаты и обсуждение

По данным литературы, термическая диссоциация (NH4)2S20„ сопровождается образованием высокореакционного сульфат анион радикала (SO_J-), который инициирует свободно радикальные реакции, приводящие к окислению полистирола и появлению на его поверхности кислородсодержащих групп (гидроксильных, пероксидных, карбоксильных, сложноэфирных и т.д.) [7, 18]. В настоящей работе основное внимание направлено на оценку возможности образования карбоксильных групп на поверхности полисти-рольного планшета в процессе окисления его (NH4)2S208.

Содержание карбоксильных групп на поверхности планшета после его окисления 30% водным раствором (NH4)2S208 возрастало в 3,6 раза по сравнению с контролем. Последующая обработка окисленного планшета NaOH приводила к значительному увеличению содержания карбоксильных групп на поверхности, причем их количество увеличивалось пропорционально концентрации NaOH. Уменьшение концентрации раствора персульфата до 10%, а также изменение времени окисления до 2 ч сопровождалось снижением количества карбоксильных групп. Максимального увеличения

Таблица 1

содержание карбоксильных групп на поверхности модифицированного планшета (по результатам реакции с Тс)

Условия модификации

[COOH], нмоль/см2

Немодифицированный планшет 30% (NH4)2S208, 6 ч, H20 10% (NH4)2S208, 6 ч, 1 M NaOH 30% (NH4)2S208, 6 ч, 0,01 M NaOH 30% (NH4)2S208, 6 ч, 0,1 M NaOH 30% (NH4)2S208, 2 ч, 1 M NaOH 30% (NH4)2S208, 4 ч, 1 M NaOH 30% (NH4)2S,Q8, 6 ч, 1 M NaOH

0,12 ± 0,01 0,42 ± 0,03 0,36 ± 0,10 4,38 ± 0,10 5,04 ± 0,14 0,55 ± 0,11 5,24 ± 0,11 6,13 ± 0,07

Таблица 2

Содержание аминогрупп, локализованных на поверхности планшетов после сорбции ТЭПА (по результатам реакции с КО II)

Хин нланшета Tm сорбции TЭПA [NHJ,

нмоль/см2

Немодифицированный Физическая сорбция 0,04 ± 0,000

Mодифицированный (-COOH) T же 0,88 ± 0,040

Mодифицированный (-COOH) Хемосорбция 2,94 ± 0,020

концентрации карбоксилов (в ~51 раз по сравнению с контролем) добивались при окислении полистирольного планшета 30% водным раствором (NH4)2S208 в течение 6 ч при 80 °С с последующей обработкой поверхности 1 М NaOH (табл. 1).

Проверяли функциональную активность модифицированного карбоксильными группами планшета путем сорбции на его поверхности ТЭПА, содержащего две первичные аминогруппы. Сорбцию ТЭПА проводили двумя способами. В первом случае карбоксильные группы планшета были предварительно активированы ЭДК/ГС (хемосорбция), во втором случае активацию карбоксильных групп не проводили (физическая сорбция). В качестве контроля использовали немодифицированный планшет Greiner, при этом сорбцию ТЭПА проводили физическим способом. Результат оценивали по содержанию свободных аминогрупп, локализованных на подложке. Из табл. 2 видно, что на немодифицированном планшете сорбция ТЭПА практически отсутствовала. Количество аминогрупп на модифицированной поверхности после хемосорбции ТЭПА было в 3,3 раза выше по сравнению с количеством аминогрупп, доступных для оценки после физической сорбции аминосоединения.

На аминированном планшете проводили связывание комплекса пМВМА-БКМЛ за счет образования амидной связи между свободными ангидридными группами пМВМА и аминогруппами ТЭПА, локализованными на твердой фазе. Далее планшет насыщали Ni2+ и проводили сорбцию His-tags Fc IgG.

Для сравнительной оценки степени сорбции His-tags Fc IgG использовали немодифицированный планшет Greiner и коммерческий №+-активированный планшет Nickel Plate. Известно, что имидазол способен вытеснять His-tags пептиды из комплекса с никелем [9, 19]. Следовательно, обработка лунок

original article

Таблица 3

Оценка специфичность связывания рекомбинантного His-tags Fc IgG на поверхности полистирольных планшетов

Типы планшетов Оптическая плотность, отн. ед.

трис-буфер имидазол

Greiner 0,99 ± 0,08 0,85 ± 0,05

Greiner-Ni 0,98 ± 0,10 0,11 ± 0,02

Nickel Plate 0,95 ± 0,04 0,09 ± 0,01

имидазолом после иммобилизации His-tags Fc IgG позволит установить специфичность связывания рекомбинантного белка с поверхностью исследуемых планшетов. В табл. 3 показано, что до обработки имидазолом уровень сорбции His-tags Fc IgG был примерно одинаковым на всех типах исследуемых планшетов. Однако после обработки 1 М имидазолом количество связанного His-tags Fc IgG на Greiner снижалось на 14%, в то время как на Nickel Plate и модифицированном планшете наблюдали снижение на 90 и 89% соответственно. Следовательно, сорбция His-tags Fc IgG на Nickel Plate и модифицированном планшете в значительной степени обусловлена специфическим взаимодействием гистидиновых остатков ре-комбинантного белка и Ni-активированной твердой фазы.

Greiner — планшет производства Greiner, немодифицированный; Greiner-Ni — планшет производства Greiner, модифицированный, как описано в тексте; Nickel Plate — никель-активированный планшет производства Thermo Fisher Scientific. Инкубацию с трис-буфером (50 мМ, pH 7,8) или имидазолом (1 М, pH 7,8) проводили после связывания His-tags Fc IgG в течение 1 ч при 20 °c.

Заключение

Таким образом, нами был разработан простой метод создания №2+-активированной поверхности на полистирольных планшетах для ИФА. В основе метода лежит окисление полистирола (NH4)2S2o8 и последующая обработка окисленной поверхности NaOH. Как правило, водные растворы персульфатов используют для гидроксилирования полимеров [7, 20], однако в работе [21] показано, что при окислении полистирола в условиях совместного воздействия (NH4)2S208 и УФ-излучения его поверхность обогащается карбоксильными группами. Нами было установлено, что окисление полистирола (NH4)2S208, индуцированное температурой, также сопровождается карбок-силированием поверхности полимера. В ходе работы нами не были проведены исследования по выяснению причин резкого увеличения количества карбоксилов после обработки окисленной поверхности NaOH. Можно предположить, что их количество возрастает в процессе щелочного гидролиза сложных эфиров и амидов, образовавшихся при окислении полистирола (NH4)2S208 [22]. Карбоксильные группы могут быть использованы для проведения дальнейшей, более специфичной модификации твердой фазы. В частности, широко распространенной лабораторной практикой стала активация карбоксилов смесью ЭДК и ГС для последующего связывания первичного амина с образованием амидной связи [23]. На карбок-силированной поверхности, активированной ЭДК/ГС, мы проводили связывание ТЭПА, в результате чего на твердой фазе образовывался слой аминогрупп.

На аминированном планшете нами проведено последовательное связывание комплекса пМВМА-БКМЛ и ионов Ni2+. Полученный таким образом №2+-активированный планшет

Схема №2+-активированного слоя на поверхности полистирольного планшета и взаимодействие His-tags Fc IgG с иммобилизованным ионом №2+.

оригинальные статьи

специфически сорбировал на своей поверхности His-tags Fc IgG. Структура №+-активированного слоя и механизм взаимодействия His-tag Fc IgG с иммобилизованным ионом Ni2+ представлены на рисунке. Такой лиганд, как БКМЛ, способен удерживать ион Ni2+ за счет образования четырех координационных связей. После образования комплекса с БКМЛ у иона Ni2+ остается возможность взаимодействовать с имидазольны-ми кольцами гистидиновых остатков белков за счет оставшихся двух координационных связей [9, 19]. Реакция образования комплекса Ni2+ и гистидиновых остатков обратима, как показано выше, His-tags Fc IgG можно элюировать с №2+-активированной поверхности, используя имидазол в качестве конкурирующего лиганда.

Приведенный в качестве примера способ создания Ni2+-активированного планшета может быть использован для разработки высокочувствительных и специфичных диагностических тест-систем, основанных на рекомбинантных пептидах, содержащих гистидиновые «хвосты». Дополнительным преимуществом использования Ni-активированных панелей при проведении ИФА оказывается то, что сорбция рекомбинантных гистидинсодержащих пептидов может осуществляться при использовании неочищенных лизатов. Исследование не имело спонсорской поддержки. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Gray J. The interaction of proteins with solid surfaces. Curr. Opin. Struct. Biol. 2004; 14(1): 110—5.

2. Butler J. Solid supports in enzyme-linked immunosorbent assay and other solid-phase immunoassays. Methods. 2000; 22(1): 4—23.

3. Butler J., Ni Li, Brown W. et al. The immunochemistry of sandwich ELISAs—VI. Greater than 90% of monoclonal and 75% of polyclonal anti-fluorescyl capture antibodies (cabs) are denatured by passive adsorption. Mol. Immunol. 1993; 30(13): 1165—75.

4. Kaur J., Singh K., Raje M. Strategies for direct attachment of hapten to a polystyrene support for applications in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Analyt. Chim. Acta. 2004; 506(2): 133—5.

5. Zammatteo N., Girardeaux C., Delforge D. et al. Amination of polystyrene microwells: application to the covalent grafting of DNA probes for hybridization assays. Analyt. Biochem. 1996; 236(1): 85—94.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

6. Del Prado A., Briz N., Navarro R. et al. Transparent polystyrene substrates with controllable surface chlorosulfonation: stable, versatile, and water-compatible precursors for functionalization. Macromolecules. 2012; 45(6): 2648—53.

7. Bamfordt C.H., AI-Lamee K.G. Polymer surface functionalisation and grafting by a simple and inexpensive method. Macromol. Rapid Commun. 1994; 15(4): 379—84.

8. Bamfordt C.H., AI-Lamee K.G. Studies in polymer surface functionalization and grafting for biomedical and other applications. Polymer. 1994; 35(13): 2844—52.

9. Кельциева О.А., Гладилович В.Д., Подольская Е.П. Металл-аффинная хроматография. Основы и применение. Научное приборостроение. 2013; 23(1): 74—85.

10. Liu Y.C., Reiben N., Iversen L. et al. Specific and reversible immobilization of histidine-tagged proteins on functionalized silicon nanowires. Nanotechnology. 2010; 21(24): 245105.

11. Oshige M., Yumoto K., Miyata H. et al. Immobilization of His-tagged proteins on various solid surfaces using NTA-modified chitosan. Open J. Polymer Chem. 2013; 3: 6—10.

12. Zhang S., Bogdanov Jr. A. Plate capture assay of fluorescent oligonucleotide duplex reporter-transcription factor complexes. Bioconjug. Chem. 2009; 20(8): 1444—8.

13. Paborsky L., Dunn K., Gibbs C, Dougherty J. A nickel chelate microtiter plate assay for six histidine-containing proteins. Analyt. Biochem. 1996; 234: 60—5.

14. Ataka K., Giess F., Knoll W. et al. Oriented attachment and membrane reconstitution of His-tagged cytochromec oxidase to a gold electrode: in situ monitoring by surface-enhanced infrared absorption spectroscopy J. Am. Chem. Soc. 2004; 126: 16199—206.

15. Schmitt J., Hess H., Stunnenberg H. Affinity purification of histidine-tagged proteins. Mol. Biol. Rep. 1993; 18: 223—30.

16. Tiraferri A., Elimelech M. Direct quantification of negatively charged functional groups on membrane surfaces. J. Membr. Sci. 2012; 89: 499—508.

17. Noel S., Liberelle B., Robitaille L., De Crescenzo G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjug. Chem. 2011; 22: 1690—9.

18. Киреев В.В. Высокомолекулярные соединения. М.: Высшая школа; 1992.

19. Block H., Maertens B., Spriestersbach A. et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Meth. Enzymol. 2009; 463: 439—73.

20. Yang P., Yang W. Hydroxylation of organic polymer surface: method and application. Appl. Mater. Interfaces. 2014; 6: 3759—70.

21. Han X., Qi G., Xu X., Wang L. Formation of lipid bilayer microarrays on photo-oxidized polystyrene surfaces. Chem. Eur. J. 2011; 17: 14741—4.

22. Murakami T., Fukushima Y., Hirano Y. Modification of PS films by combined treatment of ozone aeration and UV irradiation in aqueous ammonia solution for the introduction of amine and amide groups on their surface. Appl. Surf. Sci. 2005; 249 (1-4): 425—32.

23. Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques. 2nd Ed. San Diego: Elsevier Academic Press; 2008.

REFERENCES