CC BY
218ISSN 0868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2013, том 23, № 1, c. 74-85
= ХРОМАТОГРАФИЯ, ПЦР-, ДНК-АНАЛИЗ
УДК 543.544.414
© О. А. Кельциева, В. Д. Гладилович, Е. П. Подольская
МЕТАЛЛ-АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ. ОСНОВЫ И ПРИМЕНЕНИЕ
В обзоре рассмотрен принцип действия и основные возможности применения металл-аффинной хроматографии, которые включают в себя очистку гистидин-меченных белков, металл-связывающих белков, нук-леотидов и антител. Описаны преимущества и недостатки как самого метода, так и различных сорбентов.
Кл. сл.: металл-аффинная хроматография, металл-аффинные сорбенты, очистка белков, фосфопротеомика
ВВЕДЕНИЕ
В последние годы активное развитие получают высокоспецифичные и высокоселективные методы выделения органических и биоорганических соединений из биологических образцов и объектов окружающей среды. В первую очередь к таким методам можно отнести металл-аффинную хроматографию (МАХ, IMAC — immobilized-metal affinity chromatography). В научной литературе на русском языке используют также названия: металлхе-латная, или лигандобменная хроматография. В основе этого хроматографического метода лежит различное сродство органических соединений к ионам некоторых металлов. Ионы, в большинстве случаев это — ионы металлов, хелатируют поли-дентантными лигандами, иммобилизованными на вспомогательной подложке (силикагель, агароза, сефароза, сшитый сополимер полистирола и диви-нилбензола).
Концепция металл-аффинной хроматографии была впервые сформулирована и представлена Поратом [1]. Она была основана на известном сродстве ионов переходных металлов, таких как Zn2+, Cu2+, Ni2+ и Co2+ к гистидину и цистеину в водных растворах. Впоследствии появилась идея использовать прочно зафиксированные ионы металлов для фракционирования белков. Реакция образования комплекса иона металла и некоторых функциональных групп (например, фосфатных групп) органических молекул, как правило, обратима. Следовательно, иммобилизованные ионы металлов можно использовать как сорбент. Взаимодействие между сорбентом и аналитом pH-зависимое, поэтому связанные вещества можно элюировать, изменяя рН, уменьшая ионную силу буфера или используя другие хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или имидазол.
Одним из самых известных приложений МАХ является очистка гистидин-меченных белков(His).
В последнее время наблюдается увеличение применения МАХ при проведении предварительной обработки образца для обнаружения наркотиков, таких как тетрациклины, фторхинолоны, макролиды, Р-лактамы, аминогликозиды [2]; при пробо-подготовке для выявления биомаркеров в сыворотке крови, моче и тканях для диагностики заболеваний с последующим применением методов масс-спектрометрии [3, 4].
ПРИНЦИП ДЕЙСТВИЯ МЕТОДА
МЕТАЛЛ-АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Ионы металлов чаще всего классифицируются согласно теории ЖКМО (Жестких кислот мягких оснований) Пирсона [5]. Жесткие кислоты (например, ионы Fe +, Са +, А1 +) легче всего координируют кислород и фтор функциональных групп, мягкие кислоты (ионы Си+, Ag+) — сер^.
Промежуточные по жесткости (Си , № , 2п , Со2+) — азот, кислород и серу. Селективность жестких и промежуточных ионов различна: при оптимальном для их связывания рН (кислом и нейтральном соответственно) они координируются с разными функциональными группами. Такие группы могут содержаться в белках и нуклеиновых кислотах. "Мишенями" жестких кислот могут являться аспарагиновая и глутаминовая кислоты, тирозин или фосфорилированные серин, треонин или тирозин.
Адсорбция белков и пептидов методом МАХ основана на обратимом взаимодействии между аминокислотами, выступающими в качестве доноров электронов, и ионами металла, хелатирован-ными лигандами, которые иммобилизованы на поверхности твердого носителя [5]. Несмотря на значительное количество аминокислот, которые могут участвовать в процессе связывания (в том числе глицин, аргинин, лизин, тирозин, гистидин,
цистеин, аспарагиновая кислота), фактически сорбция белка определяется наличием гистидина.
Наиболее часто используемыми при приготовлении металл-аффинных сорбентов являются ионы переходных металлов. Электрон-доноры S и O) в хелатирующих соединениях могут координировать ионы металлов с получением металл-хелатов в диапазоне от бидентатных до пентаден-татных соединений в зависимости от числа занятых координационных связей.
Были разработаны различные подложки для МАХ. Традиционно в качестве подложки использовался мягкий гель, такой как агароза. Полисаха-
риды, например целлюлоза, обладают преимуществом из-за хорошей биологической совместимости. Но они демонстрируют низкую механическую прочность и, следовательно, не могут быть использованы в системах высокого давления. Напротив, неорганическая матрица, такая как диоксид кремния, обладает превосходными механическими свойствами, но имеет недостаток в виде необратимой неспецифической сорбции белков [6].
Основной механизм взаимодействия His-меченных белков с иммобилизованным ионом металла представлен на рисунке.
@------........
V
Н-О
С1ЦЙ
NMDA
.........®
v ÇH,
-di,
о
Ni-NTA
Модель взаимодействия между остатками гистидина и ионами металлов в три-(IDA), тетра-(МТА) и пентадентатных IMAC лигандах (TED) [5]
Такой лиганд, как нитрилотриуксусная кислота (nitrilotriacetic acid, NTA), удерживает ион Ni2+ четырьмя валентностями (рис., В), и две валентности иона металла доступны для взаимодействия с кольцами имидазола гистидиновых остатков. Это соотношение оказалось наиболее эффективным для очистки гистидин-меченных белков. Другой тетрадентатный лиганд — карбоксиметиласпартат [7], имеющийся в продаже как кобальт-содержащая смола Talon [http://www.clontech. com/]. В отличие от тетрадентатных лигандов иминодиуксусная кислота (iminodiacetic acid, IDA) координирует двухвалентные ионы тремя валентностями (рис., A), оставляя третью валентность иона металла свободной для взаимодействия с кольцом имидазола, хотя неясно, будет ли имида-зол иметь пространственную возможность участвовать во взаимодействии.
По всей видимости, координационное число играет важную роль в отношении качества очищения белковых фракций. Степень очистки белка с применением IDA и NTA-матриц, как правило, дает различный результат, поскольку часто наблюдается сильное выщелачивание ионов металлов из IDA-лигандов по сравнению с NTA [5]. Самое низкое выщелачивание металлов показано при использовании пентадентатного лиганда, который координирует ионы особенно сильно (рис., С).
Как было указано выше, выбор металла для МАХ зависит от структуры анализируемых соединений. Наряду с тем что трехвалентные катионы, такие как Al3 , Ga3+ и Fe3+ [8, 9], или четырехвалентный Zr4+ предпочтительны для сорбции фосфорсодержащих белков и пептидов, двухвалентные ионы Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Co2+ используют для очистки гистидин-меченных белков. Комбинация тетрадентатного лиганда, который обеспечивает сильное связывание, и иона металла, который оставляет два координационных сайта свободными для взаимодействия с биополимерами (Ni2+, Co2), получила наиболее широкое признание и приводит к высокой степени извлечения и чистоте выделенного белка.
Металл-аффинные сорбенты могут быть как на основе хелатированных лигандами ионов металлов, так и нанесены на функциональные поверхности, например чипы, в методе SELDI (активированная поверхностью лазерная десорбция / ионизация). Методы на основе чипов (например, поверхностный плазмонный резонанс (SPR)) позволяют иммобилизовать His-меченные белки (белки, меченные гистидиновым остатком-тэгом) для количественных и кинетических исследований. Кроме того, МАХ была использована на этапе ингибитора истощения до ПЦР-амплификации нуклеиновых кислот из сложных образцов, таких как
кровь, в технологии, названной Chelex [1]. Были предложены и методы МАХ для профилирования протеома на основе чипов [10], и эти методы используют в качестве инструмента в клинической практике обследования на наличие фосфатных групп и гистидин-содержащих белков и пептидов (SELDI).
Наиболее важные из многочисленных приложений металл-аффинной хроматографии будут рассмотрены далее.
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТАЛЛ-АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ ОЧИСТКИ БЕЛКОВ
Изначально разработанная для очистки натив-ных белков [1] МАХ оказалась технологией с очень широким спектром применения, в том числе в случае хроматографического очищения: возможность метода позволяет очищать наиболее распространенные металлопротеины, антитела, фосфорилированные и рекомбинантные His-меченные белки. В попытке использовать специфичность и высокое сродство His-меченных белков к иммобилизованным ионам металлов металл-аффинные лиганды были применены для изучения белок-белковых взаимодействий, где белки должны быть стабильно иммобилизованы на поверхности. В качестве примера приведем ниже два приложения этого подхода: ELISA (иммунофермент-ный анализ) — в качестве диагностического инструмента, и технологии на основе чипов для функциональных исследований.
Одной из наиболее важных областей применения МАХ является очистка рекомбинантных белков вследствие относительно высокого сродства и специфичности некоторых металлов к эпитопу, содержащему шесть или более остатков гистиди-на. Даже один шаг очистки в большинстве случаев приводит к той степени чистоты препарата белка, которая достаточна для решения наиболее распространенных задач в биохимии. Структура меченного конца, т. е. его положение, последовательность и длина, может влиять на процесс производства белка на нескольких стадиях: скорость экспрессии, доступность для привязки к металл-аффиному сорбенту, образование трехмерной белковой структуры, формирование белковых кристаллов и в меньшей степени на растворимость и активность. Наиболее распространенная форма His-конца состоит из шести последовательных остатков гистидина (Н6), которые связываются с металлами достаточно хорошо, чтобы сместить равновесие ассоциации / диссоциации больше в сторону ассоциации, ведущей к стабильному связыванию в большинстве случаев [11].
Есть несколько преимуществ применения металл-аффинной хроматографии для очистки His-меченных белков по сравнению с другими видами аффинной хроматографии [12]. Кроме простоты и низкой стоимости использования наиболее поразительной особенностью является надежность МАХ:
• метод работает как в нативных, так и денатурирующих условиях, таких как 8 М мочевина или 6 М гуанидингидрохлорид [13], и позволяет осуществлять последовательный рефолдинг на колонке [14];
• метод работает в окислительно-восстановительных условиях;
• связанные с сорбентом белки способны выдерживать воздействие широкого спектра различных химических веществ;
• относительно высокое сродство и специфичность позволяют обеспечивать высокую эффективность сорбции даже при наличии высоких титров белка;
• процедуры очистки масштабируемы.
Несмотря на такие преимущества, МАХ имеет
свои ограничения. Очевидно, что использования хелатообразователей в анализируемом образце следует избегать, что может быть недостатком, поскольку, например, ЭДТА — мощный ингибитор металлопротеаз — может быть применена только в низких концентрациях. Следует также проявлять осторожность при использовании других потенциально хелатных групп, таких как Трис, соли аммония и некоторые аминокислоты.
До недавнего времени использование сильных восстановителей, таких как дитиотреитол (ДТТ), в металл-аффинном анализе считалось проблематичным из-за вымывания никеля из сорбента, и как следствие подозревалось увеличение концентрации никеля в белковых препаратах. Тем не менее было обнаружено, что умеренные концентрации ДТТ полностью совместимы с очисткой на №-NTA [5]. Даже если ДТТ может восстановить ионы никеля, это приведет к изменению цвета смолы, а не к вымыванию лигандов, и смолы, обрабатываемые в восстановительных условиях, могут быть регенерированы и повторно использованы. Эти результаты показывают, что, несмотря на изменение цвета вследствие восстановления никеля ДТТ, сорбент по-прежнему функционирует.
Для того чтобы МАХ приводила к высокой степени очистки за один этап, требуется высокая корреляция количества гистидин-меченного бел-ка-рекомбинанта в образце с количеством металл-аффинного сорбента [15]. Стоит отметить, что существуют белки, проявляющие поверхностные свойства, подходящие для взаимодействия с иммобилизованными ионами металлов, которые могут образовывать связи с сорбентом, хотя их
сродство к сорбенту ниже, чем у гистидин-меченных белков. Соответственно избыток сорбента может привести к тому, что препарат будет загрязнен такими белками. Более того, существуют некоторые белки, в которых локальная плотность хелатирующих аминокислот, таких как гис-тидин, настолько велика, что они практически неизбежно будут связываться с ионами иммобилизованных металлов. Для избавления от соэлюирую-щихся белков или предотвращения их адсорбции существуют несколько процедур:
• проводить дополнительные этапы очистки перед МАХ;
• подбирать соотношение гистидин-мечен-ного белка и сорбента;
• использовать альтернативную подложку;
• дополнительно очищать целевой белок после МАХ методом обращенно-фазовой хроматографии.
Дополнительная очистка перед стадией МАХ возможна методами ион-обменной (ИОХ) или эксклюзионной хроматографии (ЭХ). ИОХ имеет лучшие возможности разделения, но ЭХ не только способна разделять молекулы по их размерам и помогает отделить совокупность молекул с высокой молекулярной массой, но и может быть использована для обессоливания препарата [16]. Хотя ЭХ-МАХ (в отличие от ИОХ-МАХ) может быть представлена как стандартизованная процедура без учета биохимических свойств белка, таких как диапазон разделения и pI, для ее проведения необходим набор различных ЭХ-колонок. Кроме того, чтобы использовать все возможности этих технологий, требуется дорогостоящее оборудование, в частности автоматизированная хроматографиче-ская система, что часто существенно снижает скорость проведения большого количества параллельных измерений. Аффинную очистку методом МАХ обычно выполняют в режиме связывание— промывка—элюирование. Это позволяет легко ввести второй сорбент в процедуру двухэтапной очистки, приводящей к получению высокоочи-щенного белкового препарата [17].
Повысить чистоту белков при проведении МАХ возможно использованием в качестве матрицы для сорбента покрытых декстраном гранул агарозы, которые составляют материал большинства хроматографических носителей (Sepharoses, Superflow, Agaroses), что предотвращает соэлю-цию белков с выраженной аффинностью к перечисленным матрицам [18]. К недостаткам метода можно отнести коммерческую недоступность дек-стран-покрытых гранул и как следствие необходимость в приготовлении металл-аффинного сорбента в лабораторных условиях. Подложки на основе силикагеля также предотвращают адсорбцию белков с аффинностью к агарозе и, кроме того,
обладают хорошей устойчивостью к давлению, что делает их походящими для применения в ВЭЖХ, но силикагелевые смолы часто страдают от низкой связывающей способности и ограниченной устойчивости к высоким значениям рН, что критично при проведении МАХ.
Недавно был разработан новый подход, позволяющий избегать использования твердых хрома-тографических носителей, получивший название "аффинное осаждение", и было показано, что МАХ также может быть проведена этим методом [19]. Хелатирующий лиганд химически связывается с полимером, который после сорбции гисти-дин-меченного белка агрегирует при изменении внешних условий (рН, температура), после чего вместе с белком может быть осажден центрифугированием. Протокол его использования все еще относительно сложен, но со временем, возможно, данный метод будет широко использован при очищении белков методом МАХ.
МЕТАЛЛ-АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ В ИММУНОХИМИИ
Сорбент Ni(II)-NTA, лиганды которого иммобилизованы на поверхности луночных планшетов, используют для задерживания His-меченных антигенов в их растворяемой и структурно не поврежденной форме при серологических исследованиях. Иммобилизация с помощью гистидиновых остатков может быть выгодна и удобна для стандартной процедуры иммуноферментного анализа ELISA. В стандартной методике белки-антигены адсорбируются на пластиковых поверхностях планшета случайно, часть активных сайтов присоединения антител (эпитопов белка) маскируется. ELISA с применением металл-аффинного подхода позволяет отбирать конформационно-зависимые моно-клональные антитела [20] и проводить иммуно-сорбцию с повышенной чувствительностью [21].
Иммобилизация His-меченных белков на поверхности чипа для исследования взаимодействия с другими молекулами, например, в методе SPR является широко используемым методом характе-ризации белка или межбелковых взаимодействий. Фактор устойчивого заякоривания и стабильности на поверхности чипа для плазмонного резонанса может быть важен для снижения утечки молекул белка с поверхности [11, 22]. Существенные улучшения в стабильности функциональной иммобилизации His-меченных белков на стеклянных поверхностях даже при низкой концентрации были достигнуты в соответствии с концепцией муль-тивалентных хелатирующих головок, где одна молекула лиганда несет три фрагмента NTA (tris-NTA) [23, 24]. Эта разработка позволяет использовать His-меченные белки без маркировки биоти-ном после очистки.
Металл-аффинные лиганды также успешно используют в качестве детектирующего соединения в методе иммуноблоттинга, заменяя дорогостоящие антитела. His-меченные белки, перемещенные в нитроцеллюлозную мембрану, могут быть обнаружены с помощью №-КТА, сопряженной со щелочной фосфатазой или с особыми указывающими ферментами [25] по хромогенной или хемилюми-несцентной реакции или с квантовыми точками для флуоресцентной детекции [26]. Такой подход представляет собой быструю и экономически выгодную альтернативу реакции обнаружения на основе антител в случаях, когда высокая специфичность антител не требуется. Специфичность обнаружения при использовании сопряженной NTA была увеличена на порядок при использовании ^-ЭТА [27, 28].
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТАЛЛ-АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ
Как было описано выше, МАХ первоначально была разработана как метод разделения металл- и гистидин-содержащих белков [1], но сегодня эти возможности используют и в других протеомных исследованиях, в которых снижение сложности (компонентности) системы является необходимым условием при анализе и идентификации малораспространенных белков. МАХ прочно заняла свое место среди других методов предварительного разделения сложных смесей, таких как жидкостная обращенно-фазовая, ионообменная, аффинная хроматографии и гель-электрофорез [29, 30]. В зависимости от целей и задач в процессе пробо-подготовки МАХ комбинируют с двухмерным гель-электрофорезом при анализе белков или с обращенно-фазовой хроматографией для дополнительного разделения пептидов.
Таким образом, в протеомике металл-аффинную хроматографию используют в исследованиях, где фракции клеточного белкового пула обогащают для дальнейшего анализа. Так, например, белки со сродством к металлам могут быть обогащены либо с учетом их способности связываться с определенным иммобилизованным ионом металла (например, Ме2+-КТА), либо путем связывания иона металла с белком (Ме2 -белок) на незаряженном металл-аффинном лиганде (например, NTA) [31, 32]. В качестве ионов, пригодных для металл-аффинного анализа металло-протеома, чаще всего используют Си2+, №2+, 2п2+.
Также этот метод может быть использован для связывания и разделения моно- и динуклеотидов за счет сложного явления, объясняемого дифференциальным взаимодействием потенциальных сайтов связывания — кислорода в фосфатной
группе, азота и кислорода на азотистых основаниях, гидроксильных групп в рибозе с иммобилизованным металлом [33].
Совершенно иным представляется применение МАХ для очищения антител, основанное на сродстве последних к ионам металлов. Молекулярные основы такого взаимодействия металл-содер-жащих сайтов на тяжелой цепи были рассмотрены авторами [34]. Об адсорбции иммуноглобулинов из различных образцов на металл-аффинных сорбентах сообщалось многими авторами (humanized murine IgG [34], человеческий IgG [35], козий IgG [36]). Очистка антител успешно осуществляется с помощью различных форматов МАХ, включая гели [34, 37], полиметакрилат [38] и мембранные полые волокна (Cu2+, Ni2 , Zn2+, Co +) [39]. Мягкий способ элюирования белка солями, низкая стоимость и высокая надежность металл-аффинных сорбентов определенно способствовали увеличению популярности этого метода по сравнению с традиционными подходами [39].
Однако на сегодняшний день основным приложением МАХ является фосфопротеомика [31]. Обратимое фосфорилирование белков по остаткам серина, треонина и тирозина имеет важное биологическое значение. Как правило, ферментативное фосфорилирование /дефосфорилирование клеточных белков контролирует ключевые внутриклеточные процессы, связанные с делением, диффе-ренцировкой или гибелью клеток. Направление протеомики, которое занимается анализом таких посттрансляционных модификаций белков, как фосфорилирование, получило название "фосфопротеомика". Активно развиваемая отрасль подобных исследований — изучение пула модифицированных белков при различных клеточных состояниях и в различных субклеточных компарт-ментах позволяет вычленять ключевое событие в каскаде фосфорилирований /дефосфорилирований.
Металл-аффинная хроматография была предложена как простой, экономичный и универсальный метод выделения различных типов фосфори-лированных пептидов [23, 41, 42] и быстро нашла свое применение в исследованиях фосфопротеома [43, 44]. Как было указано выше, самыми распространенными хелатирующими лигандами в металл-аффинных сорбентах являются нитрилотри-уксусная (NTA) и иминодиуксусная (IDA) кислоты. Эти кислоты хелатируют ионы Ni , Zn , Fe , Ga3+ и др. [41, 45-47], при этом свободные орбита-ли атомов металлов способны участвовать в координационном взаимодействии с отрицательно заряженными пептидами, в частности с фосфорили-рованными пептидами. Было отмечено, что сорбент на основе Fe3+-NTA показывает более высокую селективность к фосфопептидам по сравнению с Fe3-IDA [42]. Однако серьезным недостат-
ком метода МАХ является неспецифичное связывание с сорбентом таких кислых аминокислот, как глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, гистидин и цистеин, и других отрицательно заряженных соединений. На протяжении последних десятилетий предпринимаются попытки уменьшить неспецифическую сорбцию различными способами [49]. Так, можно варьировать рН раствора, в котором происходит связывание (связывающий буфер) [41, 45], или рН промывочного раствора [46, 47]. Несмотря на успешное применение этого подхода на стандартных белках, при переходе на уровень протеома селективность метода снижается до 60-70 %, что приводит к недостаточно эффективной идентификации фосфорилиро-ванных белков. Альтернативно возможно использование реакции этерификации для получения метиловых эфиров пептидов, что позволяет определять большее число сайтов фосфорилирования в сложных биологических смесях [46, 48-50]. Однако введение дополнительной реакции может привести к большим потерям в образце [51, 52].
Недавно были разработаны методики предварительной очистки образцов катион- или анион-обменной хроматографией [53, 54]. Такой подход позволил увеличить селективность МАХ до 75 %. Однако к недостаткам такого метода можно отнести возможность слишком сильного удерживания неполностью ферментативно гидролизованных пептидов, а также значительное удерживание других модифицированных пептидов, например N ацетилированных пептидов и гликопептидов. Кроме того, было показано, что нормальнофазовая хроматография в качестве предварительного этапа пробоподготовки может быть эффективна при фосфопротеомной идентификации [55]. Поскольку фосфатная группа является сильно гидрофильной, фосфорилированные пептиды слабо удерживаются на нормальной фазе, что приводит после металл-аффинного обогащения к 99 % селективности.
На сегодняшний день наиболее успешной оказалась разработка так называемого метода метал-лооксидной аффинной хроматографии (МОАХ) на основе оксида титана ТЮ2 [56]. При использовании предколонки с ТЮ2, соединенной с обращен-нофазовой капиллярной колонкой, авторами [56] была показана возможность извлечения фосфори-лированных пептидов казеина из гидролизата суммарного белка молока коровы. Однако селективность этого метода была снижена из-за неспецифического связывания кислых нефосфорилиро-ванных пептидов. В работе [57] авторы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту (2,5-dihydroxybenzoicacid, DHB) для удаления неспецифично связавшихся пептидов, что повысило селективность и чувствительность метода. В работе [58] была впервые показана возможность приме-
нения оксида циркония при МОАХ, причем 2Ю2 имеет большую селективность к монофосфорили-рованным пептидам, тогда как ТЮ2 — к мульти-фосфорилированным. Был сделан вывод, что комбинация двух сорбентов имеет потенциал для исчерпывающего профилирования фосфопротеома [59]. При добавлении в связывающий и промывочный буферы молочной кислоты в элюате после МОАХ на ТЮ2 содержится, как правило, более 90 % фосфорилированных пептидов; для 2Ю2 это значение ниже [60].
Сорбенты на основе оксидов металлов могут быть использованы в различном аппаратурном исполнении. Наиболее распространен "офф-лайн" вариант, обеспечивающий гибкость в подборе растворителей и масштабируемости эксперимента. Частицы оксидов металлов могут быть упакованы в носики для автоматических пипеток (сорбция достигается путем многократного пропускания образца через сорбент) [61] либо помещены в спиновые колонки (образец пропускают через сорбент с помощью центрифуги). Альтернативно возможен Ьа1Л-вариант, в котором сорбент помещен в микропробирку, что позволяет веществу дольше взаимодействовать с ним. В "он-лайн"-режиме оксиды металлов помещают в предколонки для ВЭЖХ-систем [62].
Недавно появились разработки наночастиц на основе оксидов металлов, в которых на нанораз-мерные магнитные шарики или на полимерную подложку наносят тонкий слой оксида [63, 64]. Такая структура обладает большой удельной поверхностью и повышенной сорбционной емкостью по сравнению с традиционными металл-аффинными сорбентами, однако есть сомнения по поводу воспроизводимости таких структур. Также имеются сведения о создании модифицированных сорбентов мишеней для MALDI-масс-спектро-метрии [65, 66].
Сравнение методов МАХ и МОАХ вызывает все больший интерес. Так, было показано [60], что оксид титана более устойчив к влиянию солей, детергентов и малых молекул, чем классические металл-аффинные сорбенты. Добавление детергента в связывающий буфер может увеличить производительность МАХ из-за уменьшения адгезии на поверхности микропробирок и, более того, благоприятствовать обогащению мультифосфори-лированных пептидов по сравнению с ТЮ2. Авторы [67] показали новый подход — последовательное элюирование с сорбента для разделения моно-и мультифосфорилированных пептидов при варьировании элюентов. По сравнению с проточным вариантом МОАХ batch-анализ (в пробирке) продемонстрировал прекрасную степень извлечения и моно-, и мультифосфорилированных пептидов. Таким образом, экспериментальные условия силь-
но влияют на производительность и селективность МАХ. Масштабное сравнение МАХ и МОАХ ТЮ2 при профилировании фосфопротеома клеток Dro-sophila melanogaster Кс167 было проведено авторами [68]. МАХ с предварительным метилированием пептидной смеси продемонстрировала 80 % селективность, так же как и МОАХ. Особенно важно небольшое перекрывание результатов идентификации фосфорилированных белков (35 %), что говорит о возможности комбинирования двух методов для более полного профилирования. Авторы работы [69] использовали последовательное элюирование 5 % водным аммиаком, 5 % пиперидином и 5 % пирролидином, что существенно увеличило число идентифицированных фосфорили-рованных белков в клеточной линии HeLa.
К настоящему времени известно об использовании в качестве металл-аффинных сорбентов оксидов многих металлов. Самым распространенным является ТЮ2, которому посвящено большое число работ по оптимизации условий проведения анализа [70-73], также много внимания уделено 2г02 [74, 75]. Были предприняты успешные попытки использовать в качестве сорбента для обогащения фосфорилированных пептидов гидроксид алюминия А1(ОН)3 [76], оксид галлия Ga2O3 [77], оксид ниобия №205 [78], оксид олова SnO2, который показал более низкий уровень неспецифического связывания по сравнению с ТЮ2 [79], оксид тантала Та205 [80]. Также перспективным следует признать использование оксида железа как в варианте магнитных шариков Fe3O4 [81], так и микроразмерного Fe2O3 [82]. Метод МОАХ имеет большое значение в фосфопротеомных исследованиях для выделения фосфорсодержащих пептидов без дополнительных процедур пробоподготовки, таких как этерификация и ионообменная хроматография
[83].
Широкое развитие хромато-масс-спектрометри-ческих методов в фосфопротеомике привело к возможности изучения и решения таких фундаментальных задач в биологии, как передача сигналов в клетках и их механизм регулирования, а также исследование различных заболеваний, при которых меняется качественный и количественный состав фосфорилированных белков, и других биохимических задач. Обратимый процесс фосфо-рилирования / дефосфорилирования белков чрезвычайно важен для проведения межклеточных сигналов. Нарушение сигнальных систем приводит к таким тяжелым заболеваниям, как диабет [84, 85], рак [86], болезнь Альцгеймера [86, 87], сердечная недостаточность [87], и многим другим.
Поскольку клеточные сигнальные системы, в которых большую роль играют фосфобелки, существуют практически во всех живых системах, включая высокоразвитые организмы, фосфопроте-
омные исследования таких систем имеют огромное значение. Немаловажное место среди методов пробоподготовки занимает металл-аффинная хроматография. Например, применение МОАХ ТЮ2 для обогащения фосфопептидов позволило установить типы киназ, задействованных в развитии эмбрионов рыбы данио-рерио [88].
Фосфорилирование белков в тканях мышей (мозг, сердце, печень и пр.) было изучено с применением металл-аффинного сорбента, содержащего железо (идентифицировано 12 000 белков и 36 000 сайтов фосфорилирования), и позволило, во-первых, установить специфичность фосфори-лирования в различных тканях, во-вторых, определить активность нескольких киназ, что позволило авторам в конечном итоге создать атлас фосфо-белков мыши [89].
Важной областью биомедицины, в которой задействована фосфопротеомика, является изучение стволовых клеток, а именно понимание сигнальных механизмов в них. В работе [90] рассмотрены протеомный и фосфопротеомный (с использованием комбинации ион-обменной хроматографии и МОАХ ТЮ2) ответ стволовых клеток человеческих эмбрионов при дифференцировании. А в работе [91] приведены данные о 10 844 сайтах фос-форилирования белков стволовых клеток. Эти данные помогают установить природу уникальности стволовых клеток.
В последние годы активно развивается направление, связанное с анализом посттрансляционных модификаций белков различными токсикантами и ксенобиотиками, которое получило собственное название — "аддуктомика", в рамках которого методы МАХ и МОАХ также нашли свое применение.
Особое внимание уделяется аддуктам бутирил-холинэстеразы (БХЭ) с фофсфорсодержащими соединениями, в том числе и с ОВ, такими как зарин и зоман [92, 93]. Было показано, что специфичное выделение аддукта БХЭ с остатком 3-орто-крезил фосфата из образца плазмы или сыворотки крови на ТЮ2 возможно даже в случае ингибирования 0.05 % БХЭ [92].
Кроме БХЭ мишенью присоединения фосфор-органических соединений является сывороточный альбумин. Причем зачастую можно обнаружить несколько сайтов модификации альбумина фосфор-органическими соединениями. Возможность обогащения образцов аддуктами пептидов сывороточного альбумина методом МАХ на сорбенте с иммобилизироваными ионами железа (III) была показана на примере параоксона [93]. Авторы работы [94] успешно идентифицировали пептиды сывороточного альбумина человека, модифицированные зарином и зоманом, после их выделения из образца с помощью ТЮ2.
Кроме того, авторами [95] была показана принципиальная возможность применения металл-аффинной хроматографии для специфичной сорбции алкилированных аддуктов сернистого иприта с глобином на сорбенте, содержащем ионы Cu +.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, металл-аффинная хроматография является специфичным, надежным и воспроизводимым методом. Несмотря на относительно недолгую историю существования, метод получил быстрое развитие во многих направлениях биоорганического анализа, и последние годы круг задач, решаемых с помощью МАХ и МОАХ, стремительно расширяется. В ближайших перспективах можно ожидать, что метод будет широко использоваться в ретроспективном токсикологическом анализе, для разработки новых методов диагностики различных заболеваний, производстве новых лекарственных препаратов. В то же время появление современных высокотехнологичных материалов и нанотехнологий позволяет надеяться, что будут разрабатываться и производиться новые эффективные металл-аффинные сорбенты.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal-chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation // Nature. 1975. V. 258. P. 598599.
2. Takeda N., Matsuoka T., Gotoh M. Potentiality of IMAC as sample pretreatment tool in food analysis for veterinary drugs // Chromatographia. 2010. V. 72. P. 127-131.
3. Felix K., Fakelman F., Hartmann D. et al. Identification of serum proteins involved in pancreatic cancer cachexia // Life Sci. 2001. V. 88. P. 218-225.
4. Wu C., Wang Z.F., Liu L.J. et al. Surface enhanced laser desorption/ionization profiling: new diagnostic method of HBV-related hepatocellular carcinoma // J. Gastroenterol. Hepatol. 2009. V. 24. P. 55-62.
5. Block H., Maertens B., Spriestersbach A. et al. Immo-bilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review // Methods Enzymol. 2009. V. 463. P. 439-473.
6. Cheung R.Ch.F., Wong J.H., Ng T.B. Immobilized metal ion affinity chromatography: a review on its applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 96, N 6. P. 1411-1420.
7. Chaga G., Hopp J., Nelson P. Immobilized metal ion affinity chromatography on Co2^-carboxymethyl-aspartate-agarose. Superflow, as demonstrated by one-step purification of lactate dehydrogenase from chicken breast muscle // Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. V. 29. P. 19-24.
8. Andersson L., Porath J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+) affinity-chromatography // Anal. Biochem. 1986. V. 154. P. 250-254.
9. Muszynska G., Andersson L., Porath ./.Selective adsorption of phosphoproteins on gel-immobilized ferric chelate // Biochemistry. 1986. V. 25. P. 6850-6853.
10. Slentz B.E., Penner N.A., Regnier F.E. Protein proteolysis and themulti-dimensional electrochromatographic separation of histidine-containing peptide fragments // J. Chromatogr. A. 2003. V. 984. P. 97-103.
11. Knecht S., Ricklin D., Eberle A.N., Ernst B. Oligohis-tags: Mechanisms of binding to Ni2+ -NTA surfaces // J. Mol. Recognit. 2009. V. 22. P. 270-279.
12. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // BioTechniques. 1991. V. 10. P. 506-513.
13. Hochuli E., Bannwarth W., Dobeli H., Gentz R., Stuber D. Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent // Biotechnology. 1988. V. 6. P. 1321-1325.
14. /ungbauer A., Kaar W., Schlegl R. Folding and refolding of proteins inchromatographic beds // Curr. Opin. Biotechnol. 2004. V. 15. P. 487-494.
15. Bornhorst /.A., Falke /./. Purification of protein using polyhistidine affinitytags // Methods Enzymol. 2000. V. 326. P. 245-254.
16. Graslund S., Nordlund P., Weigelt /. et al. Proteinpro-duction and purification // Nat. Methods. 2008. V. 5. P. 135-146.
17. Cass B., Pham O.L., Kamen A., Durocher Y. Purification of recombinant proteins from mammalian cell culture using a generic double-affinity chromatographys-cheme // Protein Expr. Purif. 2005. V. 40. P. 77-85.
18. Derewenda Z.S. The use of recombinant methods and molecular engineering in protein crystallization // Methods. 2004. V. 34. P. 354-363.
19. Matiasson B., Kumar A., Ivanov A.E., Galaev I.Y. Met-al-chelate affinity precipitation of proteins using responsive polymers // Nat. Protocols. 2007. V. 2. P. 213220.
20. Padan E., Venturi M., Michel H., Hunte C. Production and characterization of monoclonal antibodies directed against native epitopes of NhaH, the Na+/H+ antiporter of E. coli // FEBS Lett. 1998. V. 441. P. 53-58.
21. Mateo C., Fernandez-Lorente G., Pessela B.C.C. et al. Affinity chromatography of polyhistidine tagged enzymes: New dextran-coated immobilized metal ion affinity chromatography matrices for prevention of unde-sired multipoint adsorptions // J. Chromatogr. A. 2001. V. 915. P. 97-106.
22. Nieba L., Nieba-Axamann S.E., Persson A. et al. Bi-acore analysis of histidine-tagged proteins using a chelating NTA sensor chip // Anal. Biochem. 1997. V. 252. P. 217-228.
23. Lata S., Piehler /. Stable and functional immobilization of histidine-tagged proteins via multivalent chela-tor headgroups on a molecular poly(ethylene glycol) brush // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 1096-1105.
24. Zhaohua H., Park /.I., Watson D.S. et al. Facile synthesis of multivalent nitrilotriacetic acid (NTA) and NTA conjugates for analytical and drugdelivery applications // Bioconjug. Chem. 2006. V. 17. P. 15921600.
25. /in S., Issel C./., Montelaro R.C. Serological method using recombinant S2 protein to differentiate equine in-
fectious anemia virus (EIAV)-infected and EIAV-vaccinated horses // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2004. V. 11. P. 1120-1129.
26. Kim M./., Park H.-Y., Kim /. et al. Western blot analysis using metal-nitrilotriacetate conjugated CdSe/ZnS quantum dots // Anal. Biochem. 2008. V. 379. P. 124-126.
27. Lata S., Gavutis M., Tampe R., Piehler /. Specific and stable fluorescence labeling of histidine-tagged proteins for dissecting multi-protein complex formation // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 2365-2372.
28. Reichel A., Schaible D., Al Furoukh N., Cohen M., Schreiber G., Piehler /. Noncovalent, site-specific bio-tinylation of histidine-tagged proteins // Anal. Chem. 2007. V. 79. P. 8590-8600.
29. Lv G.S., Hua G.C., FuX.Y. Expression of milk-derived antihypertensive peptide in Escherichia coli // J. Dairy Sci. 2003. V. 86. P. 1927-1931.
30. Stasyk T., Huber L.A. Zooming in: Fractionation strategies in proteomics // Proteomics. 2004. V. 4. P. 37043716.
31. Sun X., Chiu /.-F., He Q.-Y. Application of immobilized metal affinitychromatography in proteomics // Expert Rev. Proteomics. 2005. V. 2. P. 649-657.
32. Shi W., Chance M.R. Metallomics and metalloproteo-mics // Cell. Mol. Life Sci. 2008. V. 65. P. 3040-3048.
33. Loo /.A. The tools of proteomics // Adv. Protein Chem. 2003. V. 65. P. 353-369.
34. Hale /.E., Beidler D.E. Purification of humanized mu-rine and murine monoclonal antibodies using immobilized metal-affinity chromatography // Anal. Biochem. 1994. V. 222. P. 29-33.
35. Porath /., Olin B. Immobilized metal ion affinity adsorption and immobilized metal ion affinity chromato-graphy of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized iron and nickel ions // Biochemistry. 1983. V. 29. P. 1621-1630.
36. Hubert P., Porath /. Metal chelate affinity chromatography. II. Groupseparation of mono- and dinucleo-tides // J. Chromatogr. 1981. V. 206. P. 164-168.
37. Vancan S., Miranda E.A., Bueno, S.M.A. IMAC of human IgG: Studies with IDA-immobilized copper, nickel, zinc, and cobalt ions and different buffer systems // Process Biochem. 2002. V. 37. P. 573-579.
38. Boden V., Winzerling /./., Vijayalakshmi M., Porath /. Rapid one-step purification of goat immunoglobulins by immobilized metal ion affinity chromatography // J. Immunol. Methods. 1995. V. 181. P. 225-232.
39. Serpa G., Augusto E.F.P., Tamashiro W.M.S.C. et al. Evaluation of immobilized metal membrane affinity chromatography for purification of an immunoglobulin G1 monoclonal antibody // J. Chromatogr. B. 2005. V. 816. P. 259-268.
40. Meszarosova K., Tishchenko G., Bouchal K., Bleha M. Immobilized-metal affinity sorbents based on hydro-philic methacrylate polymers and their interaction with immunoglobulins // React. Funct. Polym. 2003. V. 56. P. 27-35.
41. Posewitz M.C., Tempst P. Immobilized gallium(III) affinity chromatography of phosphopeptides // Anal. Chem. 1999. V. 71, N 14. P. 2883-2892.
42. Neville D.C.A., Rozanas C.R., Price E.M. et al. Evidence for phosphorylation of serine 753 in CFTR using
a novel metal-ion affinity resin and matrix-assisted laser desorption mass spectrometry // Protein Sci. 1997. V. 6, N 11. P. 2436-2445.
43. Gruhler A., Olsen J.V., Mohammed S. et al. Quantitative phosphoproteomics applied to the yeast phero-mone signaling pathway // Mol. Cell. Proteomics. 2005. V. 4, N 3. P. 310-327.
44. Andersson L., Porath J. Isolation of phosphoproteins by immobilized metal (Fe3+) affinity chromatography // Anal. Biochem. 1986. V. 154, N 1 P. 250-254.
45. Corthals G.L., Aebersold R., Goodlett D.R., Burlin-game A.L. Identification of phosphorylation sites using microimmobilized metal affinity chromatography // Methods in Enzymology. N.Y.: Academic Press, 2005. V. 405. P. 66-81.
46. Ndassa Y.M., Orsi C., Marto J.A., Chen S., Ross M.M. Improved immobilized metal affinity chromatography for large-scale phosphoproteomics // Applications J. Proteome Res. 2006. V. 5, N 10. P. 2789-2799.
47. Kokubu M., Ishihama Y., Sato T., Nagasu T., Oda Y. Specificity of immobilized metal affinity-based IM-AC/C18 tip enrichment of phosphopeptides for protein phosphorylation analysis // Anal. Chem. 2005. V. 77, N 16. P. 5144-5154.
48. Ficarro S.B., McCleland M.L., Stukenberg P.T. et al. Phosphoproteome analysis by mass spectrometry and its application to Saccharomyces cerevisiae // Nat. Bio-technol. 2002. V. 20, N 3. P. 301-305.
49. Lee J., Xu Y., Chen Y. et al. Mitochondrial phospho-proteome revealed by an improved IMAC method and MS/MS/MS // Mol. Cell. Proteomics. 2007. V. 6, N 4. P. 669-676.
50. Kim J.E., Tannenbaum S.R., White F.M. Global Phos-phoproteome of HT-29 human colon adenocarcinoma cells // J. Proteome Res. 2005. V. 4, N 4. P. 13391346.
51. Stewart I. I., Figeys T. T. D. 18O Labeling: a tool for proteomics // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2001. V. 15, № 24. P. 2456-2465.
52. Speicher K.D., Kolbas O., Harper S., Speicher D.W. Systematic analysis of peptide recoveries from in-gel digestions for protein identifications in proteome studies // J. Biomol. Tech. 2000. V. 11, N 2. P. 74-86.
53. Villen J., Beausoleil S.A., Gerber S.A., Gygi S.P. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2007. V. 104, N 5. P. 1488-1493.
54. Tsai C.F., Wang Y.T., Chen Y.R. et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics // J. Proteome Res. 2008. V. 7. P. 4058-4069.
55. McNulty D.E., Annan R.S. Hydrophilic interaction chromatography reduces the complexity of the phos-phoproteome and improves global phosphopeptide isolation and detection // Mol. Cell. Proteomics. 2008. V. 7, N 5. P. 971-980.
56. Pinkse M.W.H., Uitto P.M., Hilhorst M.J., Ooms B., Heck A.J.R. Selective isolation at the femtomole level of phosphopeptides from proteolytic digests using 2D-nanoLC-ESI-MS/MS and titanium oxide precolumns // Anal. Chem. 2004. V. 76, N 14. P. 3935-3943.
57. Larsen M.R., Thingholm T.E., Jensen O.N., Roeps-torffP., Jorgensen T.J.D. Highly Selective enrichment
of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns // Mol. Cell. Proteomics. 2005. V. 4, N 7. P. 873-886.
58. Kweon H.K., Hakansson K. Selective zirconium dioxide-based enrichment of phosphorylated peptides for mass spectrometric analysis // Anal. Chem. 2006. V. 78, N 6. P. 1743-1749.
59. Sugiyama N., Masuda T., Shinoda K., Nakamura A., Tomita M., Ishihama Y. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications // Mol. Cell. Proteomics. 2007. V. 6, N 6. P. 1103-1109.
60. Sugiyama N., Nakagami H., Mochida K., Daudi A., Tomita M., Shirasu K., Ishihama Y. Large-scale phos-phorylation mapping reveals the extent of tyrosine phosphorylation in Arabidopsis // Mol. Sys. Biol. 2008. V. 4. P. 193.
61. Miyazaki S., Morisato K., Ishizuka N., Minakuchi H., Shintani Y., Furuno M., Nakanishi K. Development of a monolithic silica extraction tip for the analysis of proteins // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1043. P. 19-25.
62. Pinkse M.W.H., Mohammed S., Gouw L.W. et al. Highly robust, automated, and sensitive online TiO 2-based phosphoproteomics applied to study endogenous phosphorylation in Drosophila melanogaster // J. Proteome Res. 2008. V. 7. P. 687-697.
63. Hsieh H.-C., Sheu C., Shi F.-K., Li D.-T. Development of a titanium dioxide nanoparticle pipette-tip for the selective enrichment of phosphorylated peptides // J. Chromatogr. A. 2007. V. 1165. P. 128-135.
64. Rainer M., Sonderegger H., Bakry R. et al. .Analysis of protein phosphorylation by monolithic extraction columns based on poly(divinylbenzene) containing embedded titanium dioxide and zirconium dioxide na-no-powders // Proteomics. 2008. V. 8. P. 4593-4602.
65. Blacken G.R., Volny M., Diener M. et al. Reactive landing of gas-phase ions as a tool for the fabrication of metal oxide surfaces for in situ phosphopeptide enrichment // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2009. V. 20. P. 915-926.
66. Torta F., Fusi M., Casari C.S., Bottani C.E., Bachi A. Titanium dioxide coated MALDI plate for on target analysis of phosphopeptides // J. Proteome Res. 2009. V. 8. P. 1932-1942.
67. Thingholm T.E., Jensen O.N., Robinson P.J., Larsen M.R. SIMAC (sequential elution from IMAC), a phosphoproteomics strategy for the rapid separation of monophosphorylated from multiply phosphorylated peptides // Mol. Cell. Proteomics. 2008. V. 7, N 4. P. 661-671.
68. Bodenmiller B., Mueller L.N., Mueller M., Domon B., Aebersold R. Reproducible isolation of distinct, overlapping segments of the phosphoproteome // Nat. Methods. 2007. V. 4, N 3. P. 231-237.
69. Kyono Y., Sugiyama N., Imami K., Tomita M., Ishiha-ma Y. Successive and selective release of phosphory-lated peptides captured by hydroxy acid-modified metal oxide chromatography // J. Proteome Res. 2008. V. 7. P. 4585-4593.
70. Chen C.-T., Chen Y.-C. Fe3O4/TiO2 Core/Shell Na-noparticles as Affinity Probes for the Analysis of Phosphopeptides Using TiO2 Surface-Assisted Laser
Desorption/Ionization Mass Spectrometry // Anal. Chem. 2005. V. 77. P. 5912-5919.
71. Liang S.-S., Makamba H., Huang S.-Y., Chen S.-H. Nano-titanium dioxide composites for the enrichment of phosphopeptides // J. Chromatogr. A. 2006. V. 1116. P. 38-45.
72. Qiao L., Roussel C., Wan J., Yang P., Girault H.H., Liu B. Specific on-plate enrichment of phosphorylated peptides for direct MALDI-TOF MS Analysis // J. Proteome Res. 2007. V. 6. P. 4763-4769.
73. Lin B., Li T., Zhao Y., Huang F.-K., Guo L., Feng Y.-Q. Preparation of a TiO2 nanoparticle-deposited capillary column by liquid phase deposition and its application in phosphopeptide analysis // J. Chromatogr. A. 2008. V. 1192. P. 95-102.
74. Lo C.-Y., Chen W.-Y., Chen C.-T., Chen Y.-C. Rapid enrichment of phosphopeptides from tryptic digests of proteins using iron oxide nanocomposites of magnetic particles coated with zirconia as the concentrating probes // J. Proteome Res. 2007. V. 6. P. 887-893.
75. Li Y., Leng T, Lin H., Deng C., Xu X., Yao N., Yang P., Zhang X. Preparation of Fe3O4@ZrO2 core-shell microspheres as affinity probes for selective enrichment and direct determination of phosphopeptides using matrix-assisted laser desorption ionization mass spectro-metry // J. Proteome Res. 2007. V. 6. P. 4498-4510.
76. Rohrig H., Colby T., Schmidt J., Harzen A., Facchinel-li F., Bartels D. Analysis of desiccation-induced candidate phosphoproteins from Craterostigma plantagi-neum isolated with a modified metal oxide affinity chromatography procedure // Proteomics. 2008. V. 8. P. 3548-3560.
77. Li Y., Lin H., Deng C., Yang P., ZhangX. Highly selective and rapid enrichment of phosphorylated peptides using gallium oxide-coated magnetic microspheres for MALDI-TOF-MS and nano-LC-ESI-MS/MS/MS analysis // Proteomics. 2008. V. 8. P. 238-249.
78. Lin H.-Y., Chen W.-Y., Chen Y.-C. Iron oxide/niobium oxide core-shell magnetic nanoparticle-based phospho-peptide enrichment from biological samples for MAL-DI MS Analysis // J. Biomed. Nanotechnol. 2009. V. 5. P. 215-223.
79. Sturm M., Leitner A., Smatt J.-H., Linden M., Lindner W. Tin Dioxide Microspheres as a Promising Material for Phosphopeptide Enrichment Prior to Liquid Chromatography-(Tandem) Mass Spectrometry Analysis // Adv. Funct. Mater. 2008. V. 18. P. 2381-2389.
80. Qi D., Lu J., Deng C., Zhang X. Development of core-shell structure Fe3O4@Ta2O5 microspheres for selective enrichment of phosphopeptides for mass spectro-metry analysis // J. Chromatogr. A. 2009. V. 1216. P. 5533-5539.
81. Lee A., Yang H.-J., Lim E.-S., Kim J., Kim Y. Enrichment of phosphopeptides using bare magnetic particles // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2008. V. 22. P. 2561-2564.
82. Han L., Shan Z., Chen D., Yu X., Yang P., Tu B., Zhao D. Mesoporous Fe2O3 microspheres: Rapid and effective enrichment of phosphopeptides for MALDI-TOF MS analysis // J. Colloid Interface Sci. 2008. V. 318. P. 315-321.
83. Leitner A. Phosphopeptide enrichment using metal oxide affinity chromatography // TrAC Trends in Ana-
lytical Chemistry. 2010. V. 29. P. 177-185.
84. Iwai L.K., Benoist C., Mathis D., White F.M. Quantitative phosphoproteomic analysis of T cell receptor signaling in diabetes prone and resistant mice // J. Proteome Res. 2010. V. 9, N 6. P. 3135-3145.
85. Fedjaev M., Parmar A., Xu Y. et al. Global analysis of protein phosphorylation networks in insulin signaling by sequential enrichment of phosphoproteins and phosphopeptides // Mol. Biosyst. 2012. V. 8, N 5. P. 1461-1471.
86. Yalak G., Vogel V. Extracellular phosphorylation and phosphorylated proteins: not just curiosities but physiologically important // Sci. Signal. 2012. V. 5. P. 255.
87. Hong-Qi Y., Zhi-Kun S., Sheng-Di C. Current advances in the treatment of Alzheimer's disease: focused on considerations targeting Ap and tau // Transl. Neurode-gener. 2012. V. 1, N 1. P. 21.
88. Lemeer S., Pinkse M.W.H., Mohammed S. et al. Online Automated in vivo zebrafish phosphoproteomics: from large-scale analysis down to a single embryo // J. Proteome Res. 2008. V. 7. P. 1555-1564.
89. Huttlin E.L., Jedrychowski M.P., Elias J.E. et al. A tissue-specific atlas of mouse protein phosphorylation and expression // Cell. 2010. V. 143. P. 1174-1189.
90. Rigbolt K.T.G., Prokhorova T.A., Akimov V. et al. System-wide temporal characterization of the proteome and phosphoproteome of human embryonic stem cell differentiation // Sci. Signal. 2011. V. 4, N 164. P. rs3.
91. Swaney D.L., Wenger C.D., Thomson J.A., Coon J.J. Human embryonic stem cell phosphoproteome revealed by electron transfer dissociation tandem mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 995-1000.
92. Liyasova M., Li B., Schopfer L.M. et al. Exposure to tri-o-cresyl phosphate detected in jet airplane passengers // J. Toxicology and Applied Pharmacology. 2011. V. 256. P. 337-347.
93. Гладилович В.Д., Краснов И.А., Подольская Е.П. и др. Идентификация пептидов сывороточного альбумина, модифицированных фосфорорганическими соединениями, с применением методов хроматографии и масс-спектрометрии // Научное приборостроение. 2010. Т. 20, № 4. С. 84-92.
94. Мурашко Е.А., Дубровский Я.А., Подольская Е.П., Бабаков В.Н. Идентификация аддуктов фосфорор-ганических отравляющих веществ с белками крови методами фосфопротеомики // Медицинский академический журнал. 2012. Т. 12, № 3. С. 77-79.
95. Дубровский Я.А., Гладилович В.Д., Краснов И.А. и др. Металл-аффинная хроматография для выделения ал-килированных аддуктов гемоглобина крысы // Биоорганическая химия. 2012. Т. 38, № 1. С. 52-57.
Институт аналитического приборостроения РАН, г. Санкт-Петербург (Кельциева О.А., Гладилович В.Д., Подольская Е.П.)
Институт токсикологии ФМБА России, Санкт-Петербург (Гладилович В.Д., Подольская Е.П.)
Контакты: Кельциева Ольга Александровна, Материал поступил в редакцию 8.01.2013
keltcieva@gmail. com
IMMOBILIZED METAL ION AFFINITY CHROMATOGRAPHY (IMAC).
PRINCIPLE AND APPLICATIONS
O. A. Keltsieva1, V. D. Gladilovich1,2 ,E. P. Podolskaya1,2
1 Institute for Analytical Instrumentation of RAS, Saint-Petersburg
2Institute of Toxicology Federal Medico-Biological Agency of Russia, Saint-Petersburg
This article reviews the basic principle of operation and the possibility of using immobilized metal affinity chromatography which include cleaning of histidine-tagged proteins, metal-binding proteins and antibodies. The advantages and disadvantages of this method and various sorbents are described.
Keywords: immobilized metal affinity chromatography (IMAC), sorbents, protein purification, phosphoproteomics
