CC BY
158
УДК 541.64:546-022.53
Н.Ю. Анисимова1, Ю.И. Должикова1, В.А. Даванков2, А.В. Пастухов2, С.И. Миляева3, Ф.С. Сенатов , М.В. Киселевский1 ГЕМОСОВМЕСТИМОСТЬ НАНОСОРБЕНТОВ
НА ОСНОВЕ СВЕРХСШИТЫХ ПОЛИМЕРОВ СТИРОЛА СЕРИИ СТИРОСОРБ
'ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
2Институт элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова РАН, Москва 3Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», Москва
Контактная информация:
Анисимова Наталья Юрьевна, старший научный сотрудник лаборатории клеточного иммунитета НИИ Экспериментальной диагностики и терапии опухолей адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел.+7(495)324-27-94 e-mail: n anisimova@list.ru
Статья поступила 04.08.2011; подписана в печать 18.01.2012.
Резюме
Целью настоящего исследования являлась оценка гемосовместимости двух представителей полимерных сорбентов из серии Стиросорб (сверхсшитый полистирол Стиросорб 514 и магнитный сорбент MMN200 на основе аналогичного материала) в сравнении с гранулированным активированным углем (ГАУ), используемым в гемосорбции (Adsorba 300). Кроме того, охарактеризована структура сорбентов серии Стиросорб, подготовленных для гемосорбции (промывка этанолом, стерильной водой и физиологическим раствором хлорида натрия). Сканирующая электронная микроскопия показывает, что гранулы тестируемых полимерных сорбентов имеют гладкую поверхность с размером открытых пор не более 100 нм, а удельная площадь поверхности гранул Сти-росорб 514 и MMN200 согласно результатам расчетов, выполненных по уравнению БЭТ, составила 806 м2/г и 580 м2/г соответственно.
Сорбентами набивали миниатюрные макеты колонок для гемоперфузии, через которые фильтровали кровь здоровых собак (всего 50 циклов фильтрации). Установлено, что интенсивность гемолиза эритроцитов при контакте с сорбентами серии Стиросорб на 74-80 % ниже в сравнении таковой под воздействием ГАУ. При этом оба испытуемых полимерных сорбента, Стиросорб 514 и MMN200, в сравнении с активированным углем вызывают меньшую агрегацию тромбоцитов крови собаки: MMN200 - в 1,6 раза, Стиросорб 514 - в 3,1 раза.
Количество неповрежденных лейкоцитов в крови здоровой собаки в результате многоэтапной гемопер-фузии через макеты колонок с ГАУ и ММЫ200 достоверно снижалось в 4,6 раза и в 1,4 раза соответственно и не снижалось после контакта с Стиросорб 514. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что протестированные сверхсшитые полистирольные сорбенты Стиросорб 514 и MMN200 при гемоперфузии оказывают на клетки крови млекопитающих менее повреждающее действие, чем гранулированный активированный уголь, широко применяемый для гемосорбции.
Ключевые слова: сверхсшитые полистиролы, Стиросорб, гемосовместимость, сорбент
N.Yu. Anisimova1, Yu.I. Dolzhikova1, V.A. Davankov2, A.V. Pastukhov2, S.I. Miljaeva3, F.S. Senatov3, M.V. Kiselevsky1
HEMOCOMPATIBILITY OF NANOSTRUCTURED SORBENTS BASED ON HYPERCROSSLINKED STYRENE POLYMERS OF THE STYROSORB SERIES
1FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
2A.N. Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds, Russian Academy of Sciences, Moscow
3State Technology University «MISIS», Moscow
Abstract
The purpose of this study was to evaluate the hemocompatibility of two representatives of the polymer sorbents of Styrosorb series (hypercrosslinked polystyrene Styrosorb 514 and magnetic material MMN200) in comparison with the granular activated carbon used in hemoperfusion (Adsorba 300). In addition, the Styrosorb sorbents structure was characterized after preparing them for hemosorption (washing with ethanol, sterile water and 0.9% NaCl). The scanning electron microscopy shows that the sorbents granules have a smooth surface with the size of the open pores less than 100 nm, while the BET specific surface area of Styrosorb 514 and MMN200 was 806 m2/g and 580 m2/g respectively.
The sorbents have been packed in miniature models of columns for hemoperfusion through which we filtered the blood of healthy dog (a total of 50 filtering cycles). It was found that the haemolysis rate of red blood cells in contact with Styrosorb series sorbents was 74-80% lower compared to that in contact with the carbon. MMN200 and Styrosorb 514, compared with the activated carbon, caused smaller aggregation of blood platelets (by a factor of 1.6 and 3.1 respectively).
As a result of a multi-stage hemoperfusion through columns with the carbon and MMN200, the number of intact leukocytes in the blood of healthy dogs dropped by a factor of 4.6 and 1.4 respectively. No decrease in leukocytes was observed after exposure to Styrosorb 514. Thus the results indicate that the tested hypercrosslinked polystyrene sorbents Styrosorb 514 and Styrosorb MMN200 exert less damaging effects on the blood cells of mammals than the granular activated carbon used for hemosorption.
Key words: hypercrosslinked polystyrene, Styrosorb, hemocompatibility, sorbent.
24 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ГЕМОСОВМЕСТИМОСТЬ НАНОСОРБЕНТОВ...
Введение Пробы для исследования динамики агрегации тромбоцитов и гемолиза отбирали через каж-Длительное время в медицинской практике в дые 5 циклов фильтрации, осуществив, таким обра-качестве основы неселективных гемосорбентов ши- зом, 10 этапов рециркуляции. Измерение всех па-роко применяется активированный уголь. Однако, раметров проводили в трех параллельных пробах. несмотря на химическую модификацию поверхно- Интенсивность гемолиза (ИГ) эритроцитов сти, показатели биосовместимости этого вида мате- рассчитывали по формуле: риалов не являются оптимальными: при контакте гранул активированных углей с клетками крови от- ОПГС мечают гемолиз эритроцитов и активную агрегацию ИГ(%) = (-) х 100 тромбоцитов [7]. Современные достижения в облас- ОПинтакт. -1 ти разработки новых материалов с использованием нанотехнологий расширили спектр потенциально Для этого определяли оптическую плотность перспективных гемосорбентов. В частности сорбен- плазмы крови после гемосорбции (ОПГС) и ин-ты на основе сверхсшитых полимеров стирола серии тактной крови (ОПинтакт) при Х=540нм на спек-Стиросорб [5], благодаря пористой структуре мат- трофотометре MS Multiscan, Р1ёп1аМ рицы и поверхности гранул, способны элиминиро- Агрегация тромбоцитов. Этот показатель вать широкий спектр биологически активных моле- оценивали по результатам световой микроскопии, кул (бактериальный эндотоксин, цитокины, гормо- определяя процент тромбоцитов крови, включен-ны) [8; 9]. Эти сорбенты могут быть также использо- ных в агрегаты после каждого этапа рециркуляции ваны в качестве полимерной матрицы для получения [3]. Интенсивность агрегации тромбоцитов рассчи-наногибридных композиционных материалов, обла- тывали как разницу количества тромбоцитов в аг-дающих особым комплексом свойств. В частности регатах в крови после перфузии через колонки и значительный интерес представляют новые поли- базового уровня тромбоцитов в интактной пробе. мернеорганические нанокомпозиты - магнитные Оценка цитопатогенного воздействия на лей-сорбенты, полученные методом химического осаж- коциты крови. Рассчитывали количество живых кле-дения оксидов железа в порах сверхсшитых поли- ток в крови после завершения всех 50 циклов гемо-стирольных сорбентов [4]. Вообще нанодисперсный сорбции в камере Горяева по исключению красителя магнетит (Fe3Ü4) сам находит применение в медици- трипанового синего (ПанЭко, РФ). Для этого эритро-не. Суммарная площадь сорбционной поверхности циты лизировали с помощью OptiLyse (Immunotech, магнетита составляет от 800 до 1200 м /г, а напря- France) при соотношении крови и реактива 1 : 5. женность магнитного поля, которое индуцируется Статистический анализ. Осуществляли с ис-каждой частицей, достигает 300-400 кА/м [2]. Одна- пользованием непараметрических критериев, опре-ко низкая гемосовместимость этого материала лими- деляя медиану и размах данных. Сравнение показа-тирует его внедрение в клиническую медицинскую телей групп проводили, используя U-критерий Ман-практику, предполагающую контакт с клетками [12]. на-Уитни. Достоверными считали различия показа-Эти проблемы в значительной степени можно раз- телей при р<0,05 решить созданием нанокомпозитных материалов, Характеристика пористой структуры сор-где полимерная гемосовместимая матрица экраниру- бентов. Исследование поверхности и сколов гранул ет поверхность неорганического компонента. проводили на сканирующем электронном микроЦелью настоящего исследования являлась скопе Hitachi TM-1000 (ускоряющее напряжение 15 оценка гемосовместимости и характеристика по- кВ, увеличение х10 000). Измерение удельной ристой структуры двух представителей полимер- площади поверхности проводили методом низко-ных сорбентов из серии Стиросорб (сверхсшитый температурной адсорбции азота БЭТ на установке полистирол Стиросорб 514 и магнитный материал Quantachrome NÜVA 1200e. на его основе MMN200) в сравнении с углеродным гемосорбентом. Результаты и обсуждение Материалы и методы Гемолиз эритроцитов в фильтруемой через гемосорбенты крови нарастает прямо пропорцио-Тестируемые сорбенты. Образцы сверхсши- нально числу этапов рециркуляции крови, т.е. дли-того полистирола Стиросорб 514, имеющего фор- тельности контактов с сорбентами (рис.1). Однако мальную степень сшивки порядка 200 % и не со- полученные данные свидетельствуют о том, что держащего функциональных групп, и магнитного интенсивность гемолиза эритроцитов при контакте сорбента MMN200 были получены в лаборатории с сорбентами серии Стиросорб на 74-80 % ниже в стереохимии сорбционных процессов ИНЭОС им. сравнении с воздействием ГАУ. При этом оба ис-А.Н. Несмеянова РАН. Оба сорбента представляли пытуемых полимерных сорбента, Стиросорб 514 и собой сферические гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с MMN200 оказывали схожий по величине эффект. развитой внутренней структурой. Сорбенты про- На рис. 2 приведены результаты оценки агрега-мывали этанолом, стерильной водой и физиологи- ции тромбоцитов при перфузии крови через сорбенты ческим раствором хлорида натрия. В качестве кон- ряда Стиросорб и активированный уголь. Эти данные троля использовали ГАУ, являющийся основой свидетельствуют о том, что вследствие контакта с ГАУ гемосорбционной колонки Adsorba 300 (Gambro агрегация тромбоцитов крови значительно возрастает. Co., Sweden). Уже по окончании первого этапа рециркуляции агрега-Дизайн исследования. Подготовленными сор- тообразование было на 18 % выше (р=0,025), чем в бентами (m=1,3±0,1 г) набивали миниатюрные ма- интактной крови, а после четвертого этапа агрегатооб-кеты колонок для гемоперфузии, через которые разование достигло 31 % (р=0,004). Падение концен-фильтровали кровь здоровой собаки объемом 10 мл трации тромбоцитов при фильтрации крови через косо скоростью порядка 1,3 мл/мин. Фильтрацию лонки на основе сорбентов ряда Стиросорб было менее этой порции крови повторяли многократно, всего существенным, а после 2 этапов рециркуляции даль-было сделано 50 циклов фильтрации. нейшая агрегация практически не отмечалась.
№ 1/том 11/2012 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Рис. 1. Интенсивность гемолиза эритроцитов при перфузии через колонки с Стиросорб 514, ММЫ200 и ГАУ.
45
40
S
к 35
0 12 3 4
Этапы рециркуляции
Рис. 2. Интенсивность агрегации тромбоцитов при перфузии через колонки с Стиросорб 514, ММШ00 и ГАУ; (*р>0,05).
Рис. 3. Концентрация лейкоцитов крови собаки в результате перфузии через колонки с ГАУ, Стиросорб 514 и MMN200 в сравнении с исходной концентрацией в интактной пробе (*р<0,05).
Рис. 4. Внешний вид исследуемых сорбентов. Оптическая микроскопия, х40.
Рис. 5. Поверхность гранул сорбента Стиросорб MMN200. Сканирующая электронная микроскопия.
В итоге 4-кратной рециркуляции крови через эти колонки наблюдалась умеренная агрегация тромбоцитов в сравнении с исходным уровнем: 18 % после контакта с MMN200 (р=0,022) и всего 10 % после контакта с Стиросорб 514 (р=0,094). Таким образом, тестируемые полимерные сорбенты в сравнении с активированным углем вызывают меньшую активацию тромбоцитов крови собаки: MMN200 - в 1,6 раза, Стиросорб 514 - в 3,1 раза.
Проведенные нами исследования позволили установить, что в результате многоэтапной гемо-перфузии через макеты колонок с ГАУ и MMN200 количество живых лейкоцитов в крови здоровой собаки достоверно снижалось в 4,6 раза и в 1,4 раза соответственно. В то же время, многоэтапная перфузия крови через колонку с Стиросорб 514 не приводила к однозначно детектируемому повреждению лейкоцитов (рис. 3).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что протестированные сверхсшитые полистирольные сорбенты Стиросорб 514 и Стиросорб MMN200 при гемоперфузии оказывают на эритроциты и лейкоциты млекопитающих менее повреждающее действие, чем гранулированный активированный уголь, широко применяемый для гемосорбции. Как известно, гемо-совместимость определяется не только материалом, из которого состоит сорбент, но и размером его гранул, а также структурой его поверхности. При этом мелкие гранулы с большей площадью поверхности способны более эффективно элиминировать биологически активные вещества, чем более крупные частицы. Однако из-за малых размеров каналов между мелкими частицами форменные элементы крови подвергаются в потоке гораздо более высоким напряжениям сдвига, что приводит, в частности, к гемолизу эритроцитов [6]. По этой причине в большинстве гемосорбционных устройств применяют гранулы диаметром более 100 мкм или фильтр для предварительного отделения плазмы от форменных элементов [10]. Это предопределило выбор для гемосорбции гранул размером 0,3-1,0 мм (рис. 4), причем сферическая форма полимерных частиц более предпочтительна. Оптическая микроскопия выявляет также еще одно важное преимущество полимерных гранул, очевидно связанное с их высокой механической прочностью: материал не содержит пылевидных фракций, тогда как активированный уголь не свободен от мелких крошек, способных вызывать эмболию капилляров. Как отмечалось выше, особенности поверхности сорбентов также значительно влияют на состояние клеток фильтруемой крови.
Сканирующая электронная микроскопия показывает, что гранулы тестируемых полимерных сорбентов имеют гладкую поверхность с размером открытых пор не более 100 нм (рис. 5).
Согласно полученным ранее данным [4] Стиро-сорб 514 является бипористым полимером с большим числом микропор диаметром 1,5-3 нм и макропорами вплоть до 100 нм, что дает средний (по объему пор) радиус пор 36±7 нм. В сорбенте MMN200 имеются наночастицы магнетита со средним радиусом 6,7±3,8 нм [4]. Можно предположить, что наличие в структуре полимерной матрицы этих наночастиц магнетита (Fe, мас. % -8,7-8,9% [4]) в сочетании с их намагниченностью обусловило некоторое ухудшение его биосовместимости, что проявилось в усилении агрегации тромбоцитов и снижении количества живых лейкоцитов в крови после гемоперфузии. Наличие большого числа открытых пор во всех сорбентах ряда Стиросорб подтверждается измерениями внутренней удельной поверхности гранул методом низкотемпературной сорбции азота. Согласно результатам расчетов, выполненных по уравнению БЭТ, удельная площадь поверхности гранул Стиросорб 514 и MMN200 составляет 806 м2/г и 580 м2/г соответственно. Эти данные несколько отличаются от приведенных в литературе характеристик этих сорбентов (Стиросорб 514-1100 м2/г; MMN200 - 1200 м/г [4]), вероятно, вследствие того, что часть объема гранул оказалась заполненной кристаллами хлорида натрия, т.к. промывание физиологическим раствором являлось этапом подготовки сорбентов для гемоперфузии.
Заключение
Сверхсшитые полистиролы Стиросорб 514 и Стиросорб MMN200 являются сорбентами с большой сорбционной емкостью, имеющими сильно развитую внутреннюю поверхность и открытую пористость с размером пор менее 100 нм. Эти материалы значительно превосходят гранулированный активированный уголь по таким показателям гемосовме-стимости как интенсивность лизиса эритроцитов, агрегации тромбоцитов и уменьшение концентрации живых лейкоцитов. Этот факт наряду с установленной ранее способностью эффективно элиминировать из кровотока различные токсины [8] - как бактериальные, так и широкий спектр про- и противовоспалительных факторов [1; 11], позволяет рассматривать эти материалы как перспективные для применения в качестве гемосорбентов в медицинской и ветеринарной практике.
Литература
1. Анисимова Н. Ю., Даванков В. А., Корнюшенков Е. А. и др. Эффективность применения сверхсшитых полистиролов для экст-
ракорпоральной детоксикации при сепсисе // Рос. Вет. Ж. Мелкие домашние и дикие животные. - 2011. - №2. - С. 23-5.
2. Белоусов А.Н. Научно-практический опыт применения наночастиц магнетита в медицине // Вестник Национального технического университета «ХПИ». - 2010. - Т. 47. - С. 9-16.
3. Медицинские лабораторные технологии. Справочник под ред. А.И. Карпищенко. - Т. 1. - СПб.: Интермедика, 2002. - 408 с.
4. Пастухов А.В., Даванков В А., Волков В.В. и др. Магнитные нанокомпозиты на основе сверхсшитых полистиролов // Известия РАН. Серия физическая - 2009. - Т. 73, № 4. - С. 496-8.
5. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Меркулова Ю.Д. и др. Образование супрамолекулярных комплексов в процессах сорб-ционного выделения аминазина из биологических жидкостей // Мат. Всерос. конф. с элементами научной школы для молодежи, Белгород, 14-17 сент. 2010 г. -Белгород, 2010 . - С. 159-62.
6. BrandlM., Hartmann J. et al. Detection of fluorescently labeled microparticles in blood//Blood Purif. - 2005. - 23(3). - P. 181-9.
7. MikhalovskyS.V. Emerging technologies in extracorporeal treatment: focus on adsorption // Perfusion. - 2003. - 18(1). - P. 47-54.
8. Murphy M.C., Patel S., Phillips G.J. et al. Adsorption of inflammatory cytokines and endotoxin by mesoporous polymers and activated carbons // Studies in Surface Science and Catalysis. - 2002. - 144. - P. 515-20.
9. Saha B., Karounou E., Strea M. Removal of 17P-oestradiol and 17a-ethinyl oestradiol from water by activated carbons and hypercrosslinked polymeric phases // Reactive and Functional Polymers. - 2010. - 70(8). - P. 531-44.
10. Valenti I.E. Characterization of a novel sorbent polymer for the treatment of sepsis. B.S. in Bioengineering - The Pennsylvania State University, 2010. - 117 р.
11. Winchester J.F., Ronco C., Salsberg J. et al. Sorbent augmented.. .//Contributions to nephrology. - 2002. - 137. - P. 170-80.
12. Zhao H., Saatchi K., Hafel U.O. Preparation of biodegradable magnetic microspheres with poly(lactic acid)-coated magnetite // J Magnetism Magnetic Materials. - 2009. - 321(10). - P. 1356-63.
