CC BY
73
УДК : 615.28.45:618.11
© И.Р. Рахматуллина, Г.В. Хамитова, В.А. Лиходед, 2008
И.Р. Рахматуллина, Г.В. Хамитова, В. А. Лиходед МЕТОД ИЗОЛИРОВАНИЯ 5-ФТОРУРАЦИЛА ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
ГОУВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Уфа Казанский государственный медицинский университет, г. Казань
Дополнение системной химиотерапии локальными методами длительного направленного воздействия депонированных химиопрепаратов с использованием новых лекарственных форм является перспективным направлением в комплексном лечении больных раком яичников. Одним из лекарственных препаратов, используемых во второй и последующих линиях химиотерапии рака яичников, является 5-фторурацил, который может быть применен в составе пролонгированной лекарственной формы. Разработаны способы экстракции 5-фторурацила из крови экспериментальных животных, которые являются воспроизводимыми, доступными и эффективными. Эти способы могут служить основой для контроля высвобождения лекарственного вещества из матрицы модельной системы пролонгированной лекарственной формы, для определения уровня 5-фторурацила в крови лабораторных животных в динамике эксперимента.
Ключевые слова: рак яичников, локальная химиотерапия, пролонгированная лекарственная форма.
I.R. Rahmatullina, G.V. Hamitova, V.A. Lihoded METHOD OF 5-FTORURACYL EXTRACTION FROM A BIOLOGICAL OBJECTS
Addition of a systemic chemotherapy with local methods of the long referred influence deposited medicines with use of new medicinal forms is a perspective direction in complex treatment of ovarian cancer. One of the medicinal preparations used in second and the subsequent lines of a chemotherapy of a cancer ovaries, is 5-FU which can be used in structure of the prolonged medicinal form. Ways of an extraction 5-FU from a blood of experimental animals which are reproduced, accessible and effective are developed. These ways can form a basis for the control of liberation of medicinal substance over a matrix of modelling system of the prolonged medicinal form, for definition of a level 5-FU in a blood of laboratory animals in dynamics of experiment.
Key words: ovarian cancer, local chemotherapy, prolonged medicinal form
Одной из актуальных проблем современного здравоохранения и общества в целом является экономический ущерб от злокачественных новообразований, обусловленный высокими показателями ин-валидизации и смертности от них [1]. К злокачественным опухолям с крайне сложным прогнозом относится рак яичников, при котором общая пятилетняя выживаемость в развитых странах не превышает 45%. Это обусловлено биологическими особенностями опухоли, длительным бессимптомным течением, которые приводят более чем у 70% больных к выявлению заболевания в запущенных стадиях [2]. Несмотря на адекватный объем проведенных лечебных мероприятий, заболевание рецидивирует у большинства пациентов. Повторные хирургические вмешательства, химиотерапия второй и последующих линий мало эффективны [4]. В связи с этим закономерен интерес исследователей к разработке новых лечебных подходов при раке яичников. Применение новых лекарственных форм и
новых способов доставки действующего вещества непосредственно к опухоли может повысить эффективность лечения. Дополнение системной химиотерапии локальными методами длительного направленного воздействия депонированных химиопрепаратов с использованием новых лекарственных форм является перспективным направлением в комплексном лечении больных раком яичников [3]. Одним из лекарственных препаратов, используемых во второй и последующих линиях химиотерапии рака яичников, является 5-фторурацил, который может быть применен в составе пролонгированной лекарственной формы.
Материалы и методы
Существующие методики определения 5-фторурацила в живых организмах технически сложны и затратны. Поэтому нами разработана методика определения 5-фторурацила в биологических объектах. 5-фторурацил является производным пиримидинового основания (урацила). Необходимо тщательно отделять его от при-
сутствующих в крови пиримидинов. С этой целью использовали хроматографическую колонку с окисью алюминия. Высота колонки рассчитывалась экспериментально по следующей методике: использовали полые стеклянные трубки диаметром 0,7 см и заполняли их окисью алюминия на высоту 5 см, элюировали водой очищенной до получения прозрачного элюата по сравнению с эталоном.
Подготовленные таким образом
хроматографические колонки с окисью алюминия заполняли водным раствором
5-фторурацила стандартного образца
(РСО). В полученном элюате спектрофотометрически определяли содержание 5-фторурацила.
Приготовление водного раствора
(РСО 5-фторурацила): 0,1 мл 5% раствора 5-фторурацила помещали в мерную колбу на 100 мл и доводили очищенной водой до метки. Раствор тщательно перемешивали. Потери 5-фторурацила, полученные в ходе хроматографического разделения, представлены в таблице.
Следующий этап исследования включал в себя определение оптимального режима экстракции фторурацила из крови. Способ определения фторурацила из крови опытных животных осуществлялся следующим образом. Исследования проводили на белых крысах массой 270±10 г, брали 1 мл крови из хвостовой вены крысы, которой был введен 5-фторурацил в виде пролонгированной формы в дозе 0,96 мг/270 г, помещали в сухую химическую круглодонную колбу объемом 25 мл и прибавляли воду очищенную, перемешивали стеклянной палочкой, закрывали обратным холодильником и проводили экстракцию на водяной бане при температуре 800 С в течение 60 минут. Экстракт охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в сухую мерную пробирку, устанавливали объем, который должен быть не менее 4,5 мл. Фильтрат пропускали через подготовленные хроматографические колонки диаметром 0,7 см, высотой 5 см, заполненные окисью алюминия, и элюировали.
Ультрафиолетовый спектр полученного элюата в области от 200 до 350 нм имел максимум поглощения при длине волны 266 нм, что соответствует раствору стандартного образца 5-фторурацила.
Контролем служил элюат плацебо. Время экстракции 5-фторурацила из крови определяли по максимальному значению оптической плотности.
УФ-спектрофотометрию водного
раствора 5-фторурацила, а также водных растворов крови животных, содержащих 5-фторурацил, проводили на спектрофотометре СФ-46 или HEWLETT PACKARD 8452A при длине волны 264 ± 2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Результаты и обсуждение
Первым этапом в непосредственной разработке пролонгированной лекарственной формы являлся выбор основы. Работа проводилась над созданием матричной системы, в которую вводили модельное вещество. В исследуемых композициях в качестве модельного вещества использовали метиленовую синь.
На основании проведенного исследования матриц с лутролом и маслом оливковым in vitro наиболее приемлемыми являлись составы: 1)НМПЭ-4,0; эмульгатор Т2 -1,0; лутрол-127 - 0,1; масло оливковое - 0,45; 2)НМПЭ-4,0; эмульгатор Т2-1,0; лутрол -0,1; масло оливковое 0,75, которые без усилия проходят через иглу диаметром 2 мм и могут быть использованы в качестве матрицы инъекционной пролонгированной лекарственной формы для локальной химиотерапии.
Применение модельных веществ в экспериментах in vitro позволило доказать, что разработанные матрицы способны обеспечить пролонгированное высвобождение и хорошую динамику процесса. На следующем этапе, в эксперименте in vivo, мы использовали вместо модельного вещества препарат 5-фторурацил, который входит в схемы второй линии химиотерапии рака яичников. Для использования 5-фторурацила в эксперименте in vivo необходимы методы определения его в крови.
В эксперименте нами использовалась готовая лекарственная форма - 5%
бо
водный раствор 5-фторурацила, в качестве эталона сравнения использовали УФ-спектр водного раствора 5-фторурацила.
Спектр водного раствора 5-фторурацила представлен на рисунке.
В мерную колбу объемом 100 мл помещали 0,1 мл лекарственного препарата и доводили водой до метки. Спектр 5-фторурацила снимали на приборе HEWLETT PACKARD 8452A. В качестве раствора сравнения использовали воду очищенную. Максимум поглощения на-
длина волны
блюдался при длине волны 266 нм, что соответствует фармакопейной статье предприятия.
Таблица
Потери 5-фторурацила в процессе ^хромэтографическогорзделения^^^^^^^^^
Высота хромато- графиче- ской колонки, см Концентрация раствора стандартного образца 5-фторурацила, %, (мг) Концентрация 5-фторурацила после прохождения через хроматографическую колонку, %, (мг) Потери 5-фторурацила в процессе хроматографического разделения, %, (мг)
5 100 (50) 71,4 (35,7) 28,6 (14,3)
Рис. Спектр водного раствора 5-фторурацила
Целью эксперимента являлось выяснение особенностей взаимодействия 5-фторурацила с кровью.
1) С этой целью нами проведены следующие опыты. В мерную колбу на 100мл помещали 1 мл крови крысы, содержащей 0,1 мл гепарина, и добавляли
0,1 мл 5% раствора 5-фторурацила. Смесь доводили до метки водой очищенной и тщательно перемешивали. Раствор фильтровали через беззольный фильтр и затем пропускали через колонку диаметром 7 мм и высотой 50 мм, заполненную окисью алюминия. Колонку перед испытанием промывали водой очищенной до получения прозрачной водной фракции. Подготовленную колонку заполняли полученным водным раствором крови, содержащей 5-фторурацил. Первую порцию элюа-та в объеме 5-8 мл отбрасывали. В остальном растворе спектрофотометрически оп-
ределяли препарат при длине волны 266нм.
Расчет проводили по формуле:
C = x D E * b
С =------------------х 2,1098 = 35,57 х 10-4гр \100мл ,
618,46*1
где
С - концентрация 5-фторурацила
Е - удельная плотность поглощения
Ь- разведение
Э - оптическая плотность раствора
2) Установлено, что колонка удерживает 14,3±10-4г лекарственного препарата. 1 мл крови крысы с 0,1мл гепарина крысы помещали в круглодонную колбу объемом 200 мл, приливали 100 мл очищенной воды, закрывали обратным холодильником и нагревали на кипящей водя-
ной бане в течение 60 мин. Раствор охлаждали, фильтровали через беззольный фильтр и пропускали через подготовленные колонки с окисью алюминия (получали раствор сравнения А).
3) Исследуемый раствор В готовили аналогично раствору А. В полученный раствор вводили дополнительно лекарственный препарат в объеме 0,11 мл, содержащий 50 мг/мл 5-фторурацила.
Полученный элюат анализировали спектрофотометрически при длине волны 266 нм. Установлено, что при нагревании на кипящей водяной бане форменные элементы крови коагулируются, а в водный раствор 5-фторурацил переходит. Со-
держание его в растворе составляло 40,6х10-4 мг/100мл. Следовательно, кровь удерживала 14,3х10-4 мг/100мл лекарственного препарата.
Вывод
Таким образом, разработанные способы экстракции 5-фторурацила из крови экспериментальных животных являются воспроизводимыми, доступными и эффективными и могут служить основой для контроля высвобождения лекарственного вещества из матрицы модельной системы пролонгированной лекарственной формы для определения уровня 5-фторурацила в крови лабораторных животных в динамике эксперимента.
ЛИТЕРАТУРА
1. Злокачественные новообразования в России в 2005 году (заболеваемость и смертность)/ Под ред. В. И. Чиссова, В. В. Старинского, Г. В. Петровой - М.: МНИОИ им. П. А. Герцена, 2007.
2. Гинекология по Эмилю Новаку/ Под ред. Дж. Берека, И.Адаши и П.Хиллард. Пер. с англ. - М.: Практика, 2002. - 896 с.
3. Fung-Kee-Fung M, Oliver T, Elit L, Oza A, Hirte HW, Bryson P. Optimal chemotherapy treatment for women with recurrent ovarian cancer /Curr Oncol. 2007 0ct;14(5):195-208.
4. Hogberg T, Glimelius B, Nygren P. A systematic overview of chemotherapy effects in ovarian cancer /Acta Oncol. 2001;40(2-3):340-60.
