CC BY
20
УДК 636.03+636.084/.087+ 579.8 +57.063.7
Ключевые слова: корова, пищеварение, микробиота, секвенирование, ДНК, метагеном
Key words: cow, digestion, microbiota, sequencing, DNA, metagenome
Крупин Е.О., Тагиров М.Ш.
МЕТАГЕНОМНАЯ ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП МИКРООРГАНИЗМОВ В РУБЦЕ КОРОВ
METAGENOMIC ASSESSMENT OF COWS RUMEN MICROORGANISM FUNCTIONAL GROUPS
Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства - обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук» Адрес: 420059, Россия, г. Казань, Оренбургский тракт, д. 48
Tatar Research Institute of Agriculture - Subdivision of the Federal Budgetary Research Center «Kazan Scientific Center of Russian Academy of Sciences» Address: 420059, Russia, Kazan, Orenburgskiy trakt, 48
Крупин Евгений Олегович, к. в. н., вед. науч. сотрудник, зав. отделом агробиологических исследований.
E-mail: tatniva@mail.ru. Тел. +7 843 277-81-17
Krupin Evgeniy O., PhD of Veterinary Science, Leading Researcher, Head of Agrobiological Research Dept.
E-mail: tatniva@mail.ru. Tel. +7 843 277-81-17 Тагиров Марсель Шарипзянович, д. с.-х. н., академик Академии наук Республики Татарстан, руководитель обособленного структурного подразделения. E-mail: tatniva@mail.ru. Тел. +7 843 277-81-17
Tagirov Marsel S., Doctor of Agricultural Sciences, Academician of the Academy of Sciences of the Tatarstan Republic, Director of Subdivision, Tatar Research Institute of Agriculture - Subdivision. E-mail: tatniva@mail.ru. Tel. +7 843 277-81-17
Аннотация. Приведены результаты сравнительного анализа микробиоты рубца четырех групп дойных коров холмогорской породы татарстанского типа с применением различных доз экспериментальной кормовой добавки в рационе их кормления и без таковой. Экспериментальная кормовая добавка в своем составе содержит взятые в определенном соотношении ферменты, пробиотические микроорганизмы, L-карнитин и сапропель. Состав экспериментальной кормовой добавки разработан, а ее необходимое количество произведено в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН. Анализ микрофлоры рубца осуществляли методом секвенирования по гену 16S рРНК на платформе IlluminaMiSec в Казанском (Приволжском) федеральном университете. Исследованиями установили, что применение коровам в составе рационов кормления экспериментальной кормовой добавки не оказывало видимого влияния на состав микрофлоры рубца в целом, но повлияло на содержание важных функциональных групп микроорганизмов родов Fibrobacter, Ruminococcus, Anaeroplasma иRuminobacter, обеспечивающих углеводный обмен, его интенсивность. Разница в индексе Шеннона дает основания предполагать наличие зависимости продуктивного действия испытуемой кормовой добавки от равномерности распределения бактерий в рубце самих животных. Статья подготовлена в рамках государственного задания АААА-А18-118031390148-1. Summary. The results rumen microbiota comparative analysis in four groups of Kholmogorskaya breed dairy cows of Tatarstan type are presented. The animals of the experimental groups were fed an experimental feed supplement in various doses as part of the feeding ration. The experimental feed additive in its composition contains enzymes, probiotic microorganisms, L-carnitine and sapropel taken in a certain ratio. The composition of the experimental feed additive is developed, and its required amount is produced in Tatar Research Institute of Agriculture of FRC Kazan Scientific Center of RAS. Analysis of the rumen microflora was performed by sequencing the 16S rRNA gene on the IlluminaMiSec platform in Kazan (Volga region) Federal University. Studies have established that experimental feed supplement in cows ration did not have a visible effect on the rumen microflora composition as a whole. However, the use of experimentalfeed additive affected the content of important microorganisms functional groups Fibrobacter, Ruminococcus, Anaeroplasma and Ruminobacter genus. These microorganisms provide carbohydrate metabolism, its intensity. The difference in the Shannon index gives grounds to believe that there is a possible dependence of the productive effect of the test feed additive on the animal rumen bacterial equitability. This research was supported by FASO Russia project АААА-А18-118031390148-1.
Введение
Повышение молочной продуктивности животных тесно связано с нормальным течением физиологических процессов в их организме, важнейшая роль среди которых принадлежит процессам пищеварения [1].
В связи с анатомоморфологическим строением пищеварительного аппарата жвачных животных, они имеют характерные, присущие только им особенности процессов пищеварения [4].
Рубец имеет большое значение в пищеварении жвачных. Расщепление клетчатки
и других питательных веществ корма осуществляется ферментами микроорганизмов, содержащихся в преджелудке. В нем протекают сложные микробиологические и биохимические процессы. Они и определяют молочную продуктивность животных, качество и технологические свойства получаемого от них молока-сырья, во многом влияют на го-меостаз организма в целом, биохимические показатели крови в частности, и др. [2, 3]
Многие бактерии рубца являются строгими анаэробами, и работа с ними невозможна в обычных лабораториях даже с целью фундаментальных исследований. Для их идентификации следует применять современные методы, с применением которых, во многом, и получен материал, анализ которого представлен в статье [8, 10].
В последние годы наблюдается значительное развитие подходов к секвенирова-нию, направленных на изучение микробного сообщества. Эти подходы играют важную роль в мониторинге и сравнении большого количества образцов. Применение методов секвенирования нового поколения в анализе микробиологических сообществ расширяет наши знания и понимание сложности и разнообразия целого ряда экосистем [7].
Материалы и методы
Исследования выполнены в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН, Казанском (Приволжском) федеральном университете, ООО «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан на дойных коровах холмогорской породы татарстанского типа. Исследование продолжалось с 27-го по 90-й день лактации до завершения периода раздоя. Животных разделили на четыре группы по 20 голов в каждой. Коровы содержались на привязи. Дойные коровы первой (контрольной) группы получали основной хозяйственный рацион (ОР). Животные второй, третьей, четвертой (опытных) групп дополнительно к ОР получали экспериментальный кормовой концентрат. Данный концентрат состоял из комплекса ферментов, пробиотических микроорганизмов, L-карнитина, сапропеля, взятых в определенном соотношении, в количестве 100, 150 и 200 г на одну голову в сутки со-
ответственно, который скармливали отдельно как самостоятельный компонент рациона в утреннее кормление. Состав экспериментального кормового концентрата разработан, а его необходимое количество произведено в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН.
Содержимое рубца у животных брали по общепринятой в ветеринарии методике [5] после завершения периода скармливания экспериментального кормового концентрата (на 91-й день лактации). Из полученного рубцового содержимого выделили ДНК содержащейся в ней микробиоты модифицированным фенольным методом, подготовили библиотеки и секвенировали по гену 16S pРНК на платформе IlluminaMiSec. Полученные метагеномные данные анализировали с помощью QIIME pipeline с использованием базы данных Greengenes v.13.8 и RDP Classifier. Указанные исследования проведены в Казанском (Приволжском) федеральном университете (А.М. Харченко, студент-магистрант; Т.В. Григорьева, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник).
Работа выполнена в рамках государственного задания: «Мобилизация генетических ресурсов растений и животных, создание инноваций, обеспечивающих производство биологически ценных продуктов питания с максимальной безопасностью для здоровья человека и окружающей среды». Номер регистрации: АААА-А18-118031390148-1.
Результаты исследований
Определение содержания в рубцовой жидкости животных доли в микробном сообществе микроорганизмов рода Ruminococcus показало ее увеличение у животных третьей и четвертой групп (доля в микробном сообществе 0,039 и 0,033 % соответственно, что выше, чем у животных контрольной группы, на 116,7 и 83,3 % соответственно) при дополнительном введении микроорганизмов данного рода с экспериментальным кормовым концентратом (рис. 1). У животных третьей группы был установлен более высокий индекс Шеннона (8,80 %, что на 7,2 и 7,6 % выше, чем у животных первой и четвертой групп соответственно, и на 17,3 % выше, чем у животных второй группы), характеризующий боль-
Рис. 1. Величина индекса Шеннона и доля видов рода Яиттососсш в микробном сообществе рубцовой жидкости.
Рис. 2. Количество видов рода Яиттососсж в микробном сообществе рубцовой жидкости.
гч
с.
§5,1 2
0.12 -•1-
0.08
0,06
0,04 0.02
-0,05
-0.02 -0.04 -0,06
-0,08
0,05
«
н
«
X
Ё с о 'X
--0*7
координата 1
1-я группа (контроль) 0.2
15
-0,1
0.15
-0,1-
0.05
05
-0,05
координата 1
3-я группа
-0,1
о,
[)5
«
0.07—1 0,06-
-0,050.04 0.03 -0,02-
0,01
-О
-0,074 -0,072 -0,07 -0,068 -0,066 -0,064 координата 1
2-я группа
-0,-15
ГЦ
н
<я
а
э о а
'—0,1-
0,05
05
•0.05
-0,1-
-0,15-
0,05
координата 1
4-я группа
Рис. 3. Кластеризация на основе родового разнообразия микробиоты рубца дойных коров методом многомерного шкалирования.
шее биоразнообразие рубцовой микробиоты и ее более равномерное распределение.
Оценка количества видов микроорганизмов рода Ruminococcus в микробном сообществе рубцовой жидкости показала значительное их разнообразие у животных третьей и четвертой группы (рис. 2). Так, у животных указанных групп количество видов микроорганизмов исследуемого рода превосходило таковое у животных первой группы на 12,5 и 7,0 % соответственно. В сравнении с животными второй группы установленное увеличение составило 29,1 и 22,8 % соответственно.
Анализ всей микробиоты рубцовой жидкости в целом показал, что у животных пер-
вой, третьей и четвертой групп отсутствуют какие-либо зависимости от нормы ввода испытуемого кормового концентрата, однако животные второй группы в этом отношении являются исключением (рис. 3), о чем свидетельствует установленное распределение по координатам.
Если же рассматривать влияние экспериментального кормового концентрата в целом на важные функциональные группы микроорганизмов в рубце, то можно заметить, что увеличение нормы его скармливания положительно влияет на группы бактерий, участвующие в углеводном обмене жвачных животных (рис. 4). Так, у животных всех групп при испытуемых дозах
0.020 ^ 0.013 0,016
о
££ 0.014 В 0.012 £ 0,010 § 0:00S
2 о.ооб
| 0,004 4 0.002 0.000
/vV
Ш Ш
✓
sC
у
yys ixS
WA Ч/Ч/Ч SAA
.VAVA
У
(А) Род Fibrobacter
0,06
^ 0.05 о
§ 0,04
» 0.03
о v
SS 0.02 g
| 0,01
✓
-O
vy
.O'
Ш
Saa SAA
XWi-
vvv
■wSA
■vSW lvAV>
s
V V
(Б) Род Ruminococcus
0,0i> - o,os
«Г 0,07
| 0,06 t>
= 0.05 о
§ 0.04
л 0,03
Ч 0.02 о
* 0.01
■Vv* VS/ Vs> VV
T
PVnAJ
NW VSiN
yv^ VNo
V**
vx»
yys vys yvs wXS
sgg
VNO
вив в
0,009 - 0,00S «r 0,007 1 0.006
= 0.005
0
p 0.004
* 0,003
1 0.002 о
4 0.001
v>
.o*
.о-
s<T
(В) Род Anaeroplasma
s-
Л*
(Г) Род Ruminobacter
Рис. 4. Доля родов, утилизирующих углеводы растений, в микробном сообществе рубцовой жидкости.
скармливания экспериментального кормового концентрата установлено повышение доли в сообществе родов Е1ЪтоЪас1ет (А), Яиттососсш (Б), Лпаегор^та (В) и ЯиттоЪаМег (Г).
Обсуждение результатов
Наиболее равномерная представленность рубцовой микрофлоры, подтвержденная значениями индекса Шеннона, помогла в большей степени кормовому концентрату повлиять на долю в микробном сообществе микроорганизмов рода Яиттососсш. Обозначенная проблема, связанная с перевариванием и усваиванием различных кормовых средств, содержащих в своем составе определенные штаммы микроорганизмов, чаще всего обусловлена индивидуальными различиями у животных в микрофлоре рубца [9]. В этой связи считаем целесообразным полученные данные обогатить новыми сведениями после проведения более масштабных исследований на большем поголовье животных различных популяций для установления достоверности полученных изменений. Кроме того, отметим, что в рубце животных и его содержимом присутствует большое количество различных видов микроорганизмов, из которых не все поддаются влиянию экспериментального кормового концентрата как фактора, но, действительно, микроорганизмы рода Е1ЪтоЪас1ет и Яиттососсш являются целлюлозолитическими бактериями, бактерии рода Лпаегор^та также обладают способностью ферментировать широкий спектр растительных углеводов, а бактерии рода ЯмттоЪаМег эффективно сбраживают мальтозу и крахмал. Поэтому возможно говорить о создании предпосылок наиболее интенсивного углеводного обмена у животных опытных групп [6].
Заключение
Применение коровам в составе рационов кормления испытуемого кормового концентрата не оказывало видимого влияния на весь состав микрофлоры рубца, но повлияло на содержание важных функциональных групп микроорганизмов, обе-
спечивающих углеводный обмен у коров. Разница в индексе Шеннона показала возможную зависимость переваривания и усваивания экспериментального кормового концентрата с находящимися в его составе микроорганизмами рода Ruminococcus от равномерности распределения бактерий в рубце животных. Для более детального изучения установленных тенденций считаем целесообразным проведение исследований на большем поголовье животных различных популяций.
Список литературы
1. Белехов Г.П., Чубинская А.А. Минеральное и витаминное питание сельскохозяйственных животных. Л. : Колос, 1965. 86 с.
2. Влияние экспериментальной кормовой добавки на активность ферментов сыворотки крови и показатели рубцовой жидкости коров / Е.О Крупин, Ш.К. Шакиров, Т.В. Жарехина, М.Ш. Тагиров // Вестник Казанского ГАУ. 2018. №2 (49). С. 39-42.
3. Григорьев В.С., Бакаева Л.Н. Ростовые и биологические особенности телят при разных методах кормления // Известия Самарской ГСХА. 2012. №1. С. 103-107.
4. Киселев С., Петухов М. Полноценное кормление коров // Животноводство России. 2005. № 6. С. 47-48.
5. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / И.П. Кондрахин, А.В. Архипов, В.И. Левченко [и др.]. М. : Колос. 2004.520 c.
6. Пристеночная микрофлора кишечника / И.Д. Лоранская, М.Н. Болдырева, О.А. Лаврентьева, Э.В. Мулухова. М. : Прима Принт, 2015. 100 с.
7. Evaluation of 16S rRNA Gene Primer Pairs for Monitoring Microbial Community Structures Showed High Reproducibility within and Low Comparability between Datasets Generated with Multiple Archaeal and Bacterial Primer Pairs / M.A. Fischer, S. Gullert, S.C. Neulinger, W.R. Streit, R.A. Schmitz // Frontiers in Microbiology. 2016. V. 7. 1297 p.
8. Hungate R.E. A roll tube method for cultivation of strict anaerobes. In: Norris J.R., Ribbons D.W. (eds). Methods in microbiology, vol. 3B. London, New York: Academic Press, 1969. Р. 117-132.
9. Uyeno Y.T., Shigemori S., Shimosato T. Effect of Probiotics/Prebiotics on Cattle Health and Productivity // Microbes and Environments. 2015. V. 30. № 2. P. 126-132.
10. Web based phylogenetic assignment tool for analysis of terminal restriction fragment length polymorphism profiles of microbial communities / A.D. Kent, D.J. Smith, B.J. Benson, E.W. Triplett // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. P. 6768-6776.
