CC BY
55
128 Теория и практика кормления
УДК 576.8.06:636.083.37
Содержание микроорганизмов в рубце телят разного возраста
Л.А. Ильина
ООО «БИОТРОФ»
Аннотация. Результаты T-RFLP-анализа рубцовой жидкости более 180 телят разного возраста позволили установить нормальное содержание различных групп микробной экосистемы рубца - нормальной, условно-патогенной, патогенной и транзиторной микрофлоры. Результаты показали, что в рубце телят месячного возраста уже наблюдается значительное количество бактерий, которые участвуют в процессах ферментации целлюлозы до летучих жирных кислот, руминококков - до 17 %, лахноспир - 5 %, эубактерий - 1 %, клостридий - 3,5 %, термоанаэробактерий - 0,7 %. В возрасте 2-3 месяца общая доля бактерий, расщепляющих целлюлозу, обычно достигает 20-55 %, а начиная с 4 месяцев, она поднимется до отметки 25-50 %. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что целлюлозолитическая микрофлора, формирующаяся в преджелудках телят, уже на 2-3 месяце жизни обладает такой же потенциальной способностью к перевариванию сложных углеводов, как и у взрослых животных. Это подтверждается последующими наблюдениями, которые показали, что, начиная с 4-6-месячного возраста, уровень микроорганизмов, расщепляющих целлюлозу в рубце, практически не претерпевает изменений. Содержание бактерий, расщепляющих крахмал, - бактероидов и сукцинивибрио постоянно возрастает по мере взросления животного. Помимо этого, в рубце телят содержатся кислот-утилизирующие бактерии, которые ферментируют летучие жирные кислоты от 0,5 до 4 % в зависимости от возраста. При этом лактобактерии в рубце телят практически не выявляются. Анализ показал, что в рубце практически всех телят, даже здоровых, присутствовали патогенные микроорганизмы - фузобактерии - возбудители некробак-териоза, пептококки, стафилококки и кампилобактерии - возбудители маститов, микоплазмы -возбудители микоплазмоза. Таким образом, данные патогены являются постоянными обитателями рубца телят. Кроме того, анализ бактериального сообщества выявил значительное содержание бактерий, не поддающихся культивированию, в рубце всех телят.
Ключевые слова: телята, молекулярно-генетические исследования, фингерпринт, рубец, микрофлора.
Введение.
От момента рождения до конца второй недели жизни телёнок фактически является животным с однокамерным желудком. Сычуг остаётся единственным отделом желудка, активно задействованным в пищеварительном процессе.
Данные о становлении микробного сообщества рубца жвачных животных долгое время были ограничены единичными исследованиями на основе классических высевов на питательные среды в чашки Петри [1-5]. Основная цель таких исследований состояла в определении момента появления некоторых представителей анаэробной микрофлоры, связанных с ферментацией компонентов растительных кормов. По результатам данных исследований установлено, что телята рождаются со стерильным желудочно-кишечным трактом, однако колонизация его бактериями происходит достаточно быстро.
С развитием молекулярно-биологических методов исследования микробиоценоза рубца [6-9] появилась возможность более детального анализа состава микроорганизмов на разных стадиях этапах развития животных.
Теория и практика кормления 129
Цель исследования.
Изучение «отпечатка» бактериального сообщества рубца телят с использованием метода фингерптринт T-RFLP.
Материалы и методы исследования.
Объект исследования. Рубцовая жидкость телят чёрно-пёстрой породы возрастом от 1 месяца до 1 года, разного пола для определения нормального содержания различных групп микробной экосистемы рубца - нормальной, условно-патогенной, патогенной и транзиторной микрофлоры.
Обслуживание животных и экспериментальные исследования были выполнены в соответствии с инструкциями Russian Regulations, 1987 (Order No.755 on 12.08.1977 the USSR Ministry of Health) and «The Guide for Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press Waschington, D.C. 1966)». При выполнении исследований были приняты усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных и уменьшения количества используемых образцов.
Схема эксперимента. Для проведения исследований в разное время года было отобрано 180 телят из 42 животноводческих предприятий различных регионов Российской Федерации. Рационы кормления, схемы вакцинации, технологии выращивания, условия содержания - стандартные, с учётом нормативов для коров чёрно-пёстрой породы.
Амплификацию ДНК проводили с использованием праймеров: 63F (CAGGCTTAACACATGCCAGTC) -с меткой на 5'-конце и 1492R (TACCGHTACATTGTTCCGACTT), которые позволяют амплифици-ровать фрагмент гена 16S рРНК.
Рестрикцию 50 нг ампликонов 16S рРНК проводили с использованием эндонуклеаз ре-стриктии Hae-III, Hha-I и Msp-I, («Fermentas», Литва). Продукты рестрикции осаждали этиловым спиртом, смешивали с 0,6 мкл маркера молекулярного веса SizeStandart-600 («Beckman Coulter», США) и 15 мкл формамида.
Оборудование и технические средства. Образцы рубцового содержимого были отобраны с помощью зонда с соблюдением условий асептики и выделяли суммарную ДНК для проведения T-RFLP-анализа выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas», Литва).
Амплификацию ДНК для проведения T-RFLP-анализа проводили с применением прибора Verity («Life Technologies, Inc.», США). T-RFLP-анализ проводили с помощью прибора Beckman Coulter CEQ-8000 Analyzer (США). Обработку пиков проводили в программе Фрагмент Энелайзиз («Beckman Coulter», США). Таксономическую принадлежность бактерий определяли с использованием ресурса Фрагмент Сортер.
Статистическая обработка. Проведена стандартными методами дисперсионного анализа [10] с помощью офисного программного комплекса «Microsoft Office» с применением программы «Excel» («Microsoft», США).
Результаты исследования.
Результаты T-RFLP-анализа сообщества бактерий продемонстрировали, что в рубце телят 30-дневного возраста преобладали бифидобактерии, количество которых составляет не менее 35 %. Содержание данных микроорганизмов значительно снижается в рубце телят 2-месячного возраста по сравнению с 30-дневными (табл. 1).
130 Теория и практика кормления
Таблица 1. Нормальное содержание микрофлоры в рубце телят
Микроорганизм Роль микроорганизма Норма для телят, %
1 мес. 2-3 мес. с 4 мес.
«Нормофлора»
Филум Bacteroidetes Сем. Succinivibrionaceae Расщепляют крахмал комбикорма 1-4 0-2 4-8 0-2 4-15 0-2
Целлюлозолитики, в т. ч. не < 15 не < 20 не < 25
Сем. Lachnospiraceae Сем. Ruminococcaceae Сем. Eubacteriaceae Сем. Clostridiaceae Сем. Thermoanaerobacteraceae «Полезные» микроорганизмы, расщепляющие полисахариды не < 1 не < 3 не < 1 не < 4 не < 0,5 не < 2 не < 5 не < 2 не < 5 не < 1 не < 5 не < 5 не < 2 не < 5 не < 1
Сем. Veillonellaceae Обладают способностью разлагать органические кислоты (в том числе лактат) не < 1 не < 0,5 не < 0,5
Сем. Bacillaceae «Полезные» микроорганизмы, обладают антимикробной активностью в отношении патогенов не < 10 не < 5 не < 3
Bifidobacterium sp. «Полезные» микроорганизмы, с антимикробной активностью против патогенов не < 35 не < 1 не < 0,5
«Условно-патогенная» микрофлора
Сем. Lactobacillaceae Сем. Enterobacteriaceae Филум Actinobacteria Ферментируют углеводы до лактата Ассоциированы с гастроэнтеритами Ассоциированы с актиномикозами не > 1 не > 2 не > 10 не > 1 не > 3 не > 8 не > 2 не > 4 не > 8
Патогенные микроорганизмы
Staphylococcus sp. Сем. Сampylobacteraceae Рeptococcus sp. Возбудитель маститов и др. не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5
Mycoplasma sp. Fusobacterium sp. Возбудитель микоплазмоза Возбудитель некробактериоза не > 0,5 не > 0,5 не > 0,5 не > 1 не > 0,5 не > 3
Некультивируемые бактерии
Некультивируемые Роль не ясна 10-20 15-45 15-55
Транзитная микрофлора
Сем. Рseudomonadaceae Микроорганизмы, поступающие с кормом не > 5 не > 4 не > 3,5
Обсуждение полученных результатов.
Одним из признаков, описывающих у жвачных животных микробиоценоз «взрослого типа», является его способность к расщеплению целлюлозы [11]. Однако данные исследователей по этому вопросу противоречивы. Одни авторы указывают, что телята способны переваривать значительные количества клетчатки в 4-6-месячном возрасте, а другие считают, что в преджелудках молодняка крупного рогатого скота сравнимый с взрослыми животными объём переваривания этого полисахарида достигается только к 9-месячному возрасту.
Результаты анализа, проведённого нами, показали, что в рубце телят месячного возраста уже наблюдается значительное количество бактерий, которые участвуют в процессах ферментации целлюлозы до летучих жирных кислот: представителей семейств Ruminococcaceae - до 17 % (до-
Теория и практика кормления 131
стоверно при p<0,05), Lachnospiraceae - 5 % (достоверно при P<0,05), Eubacteriaceae - 1 % (достоверно при P<0,05), Clostridiaceae - 3,5 % (достоверно при P<0,05), Thermoanaerobacteraceae - 0,7 % (достоверно при P<0,05).
В возрасте 2-3 месяца общая доля бактерий, расщепляющих целлюлозу, обычно достигает 20-55 %, а начиная с 4 месяцев, она поднимется до отметки 25-50 %.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что целлюлозолитическая микрофлора, формирующаяся в преджелудках телят, уже на 2-3 месяце жизни обладает такой же потенциальной способностью к перевариванию сложных углеводов, как и у взрослых животных. Это подтверждается последующими наблюдениями, которые показали, что, начиная с 4-6-месячного возраста, уровень бактерий, расщепляющих целлюлозу, в рубце практически не претерпевает изменений.
Результаты, полученные молекулярно-генетическим методом, совпадают с данными, полученными ранее рядом исследователей [11, 12].
Содержание бактерий, расщепляющих крахмал, - представителей филума Bacteroidetes и семейства Succinivibrionaceae постоянно возрастает по мере взросления животного.
Помимо этого в рубце телят содержатся кислот-утилизирующие бактерии семейства Veillonellaceae, которые разлагают летучие жирные кислоты от 0,5 до 4 % в зависимости от возраста.
Взаимодействие бактерий, расщепляющих крахмал, и кислот-утилизирующих бактерий в рубце телят оказывает существенное влияние на направленность углеводного обмена, т. к. бактерии, расщепляющие крахмал, продуцируют значительное количество ЛЖК, тогда как кислот-утилизирующие бактерии преобразуют данные кислоты в метилуксусную кислоту (предшественник глюкозы). Вследствие этого увеличение энергии в рационах телят за счёт повышения количества крахмалистых кормов (концентратов) благоприятствует развитию бактерий, расщепляющих крахмал, и кислот-утилизирующих бактерий, что обычно положительно отражается на продуктивности откормочного молодняка крупного рогатого скота.
Кроме того, среди представителей «нормофлоры» в рубце телят содержатся «полезные» представители семейства Bacillaceae, обладающие высокой антимикробной активностью в отношении патогенных микроорганизмов и другими полезными свойствами (например, расщепление углеводов кормов и др.). Доля бацилл снижается по мере формирования рубцовой микрофлоры: в возрасте 1 месяц их количество составляет 10-15 %, в 2-3 месяца - 5-15 %, с 4 месяцев - 3-15 %.
При этом молочнокислые бактерии в рубце телят практически не выявляются.
Помимо этого в рубце всех телят присутствует значительное количество «нежелательных» условно-патогенных бактерий - актиномицетов филума Actinobacteria (норма до 8-10 %) и энте-робактерий семейства Enterobacteriaceae (норма до 2-4 %).
Анализ показал, что в рубце практически всех клинически здоровых телят были следующие патогенные микроорганизмы - представители рода Fusobacterium - возбудители некробактериоза, Рeptococcus sp., Staphylococcus sp. бактерии семейства Сampylobacteraceae - возбудители маститов Mycoplasma sp.- возбудители микоплазмоза. Таким образом, данные патогены являются постоянными обитателями рубца крупного рогатого скота.
Также были выявлены транзитные микроорганизмы, попадающие в рубец телят с кормом и не играющие особой роли в переваривании кормов [11, 13].
Помимо этого анализ бактериального сообщества выявил значительное содержание бактерий, не поддающихся культивированию, в рубце всех телят. Наибольшее их количество присутствовало в рубце 5-месячных телят.
Необходимо подчеркнуть, что нарушения условий содержания и кормления могут вызывать изменения нормального микробного сообщества в рубце, увеличение в нем количества данных патогенных и транзитных бактерий и развитие заболевания. Так, наибольшее количество патогенных бактерий наблюдается в рубце больных и выбракованных телят.
132 Теория и практика кормления
Выводы.
Обширные исследования микрофлоры рубца телят c привлечением современного молеку-лярно-биологического метода - T-RFLP позволили определить видовой состав нормальной, условно-патогенной, патогенной и транзиторной микрофлоры и её допустимое содержание.
Литература
1. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. М.: Науч. мир, 2006. 188 с.
2. Hungate R.E. Studies on cellulose fermentation. I. The culture and physiology of an anaerobic cellulose-digesting bacterium // Journal of Bacteriology. 1944. V. 48. P. 499-512.
3. Hungate R.E. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria // Bacterid Rev. 1950. V. 14. P. 149.
4. Microbial activity in the bovine rumen: Its measurement and relation to bloat // R.E. Hungate, D.W. Fletcher, R.W. Dougherty, B.F. Barrentine // Journal of Applied Microbiology. 1955. V. 3. P. 161173.
5. Hungate R.E. The Rumen and its Microbes. New York: Academic Press, 1966. 533 p.
6. Ильина Л.А. Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молеку-лярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов её оптимизации: дис. ... канд. биол. наук. СПб., 2012. 197 с.
7. The genome sequence of the rumen methanogen Methanobrevibacter ruminantium reveals new possibilities for controlling ruminant methane emissions // S.C. Leahy, W.J. Kelly, E. Altermann, R.S. Ronimus, C.J. Yeoman, D.M. Pacheco, D. Li, Z. Kong, S. McTavish, C. Sang, S.C. Lambie // PLoS ONE. 2010. V. 5. P. 8926-8943.
8. Wright A.D.G., Klieve A.V. Does the complexity of the rumen microbial ecology preclude methane mitigation? // Animal Feed Science and Technology. 2011. V. 166. P. 248-253.
9. Ruminant nutrition symposium: Use of genomics and transcriptomics to identify strategies to lower ruminal methanogenesis / T.A. McAllister, S.J. Meale, E. Valle, L.L. Guan, M. Zhou, W.J. Kelly, G. Henderson, G.T. Attwood, P.H. Janssen // Journal of Animal Science. 2015. V. 93(4). P. 1431-1449.
10. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высш. шк. 1990. 352 с.
11. Тараканов Б.В., Николичева Т.А. Целлюлозолитическая микрофлора и метаболические функции в рубце молодняка крупного рогатого скота при раннем включении в рацион растительных кормов // Сельскохозяйственная биология. 1986. № 4. C. 89-94.
12. Севастьянова Н.А. Развитие рубцового пищеварения у молодняка жвачных животных // Материалы третьей Всесоюзной конференции по физиологическим и биохимическим основам повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1965. С. 222.
13. База данных молекулярно-генетических исследований, Mg-rast. doi: http://www.mcs.anl.gov/ project/mg-rast-metagenomics-rast-server
Ильина Лариса Александровна, кандидат биологических наук, начальник молекулярно-генетической лаборатории ООО «БИОТРОФ», 196650, Санкт-Петербург, г. Колпино, Ижорский Завод, д. 45, литера ДВ, тел.: 8-906-268-92-19, e-mail: ilina@biotrof.ru
Поступила в редакцию 23 июня 2017 года
UDC 576.8.06:636.083.37 Il'ina Larisa Aleksandrovna
LLC «BIOTROF», e-mail: ilina@biotrof.ru
The content of microorganisms in rumen of calves of different ages
Summary. Results of T-RFLP-analysis of ruminal fluid of more than 180 calves of different ages allowed to establish the normal content of various groups of microbial ecosystems of rumen - normal, conditionally pathogenic, pathogenic and transient microflora. The results demonstarted that a considerable number
Теория и практика кормления 133
of bacteria are already present in rumen of calves of the monthly age that participate in the fermentation of cellulose to volatile fatty acids, ruminococcus up to 17 %, lachnopyr - 5 %, eubacteria - 1 %, Clostridia -3,5 %, thermoanabacteria - 0,7 %. At the age of 2-3 months, the total share of bacteria that break down cellulose usually reaches 20-55 %, and starting from 4 months, it will rise to 25-50 %. Thus, the obtained data indicate that the cellulosolytic microflora, which forms in forestomach of 2-3-month calves, has the same potential ability for digesting complex carbohydrates as in adult animals.This is confirmed by subsequent observations, which showed that, starting from the age of 4-6 months, the level of microorganisms that break down cellulose in rumen is practically unchanged. The content of bacteria that break down starch - bacteroids and succinivibrio - constantly increases as the animal grows. In addition, rumen of calf contains acid-utilizing bacteria, which ferment volatile fatty acids from 0,5 to 4 %, depending on the age. In this case, lactobacilli in rumen of calves practically are not detected. The analysis showed that practically all calves, even healthy ones, had pathogenic microorganisms in rumen - fusobacteria - causative agents of necrobacteriosis, peptococci, staphylococci and campylobacteria - causative agents of mastitis, mycoplasmas - pathogens of mycoplasmosis. Thus, these pathogens are permanent inhabitants of calf rumen. In addition, the analysis of the bacterial community revealed a significant content of bacteria that can not be cultivated in the rumen of all calves.
Key words: calves, molecular genetic studies, fingerprint, rumen, microflora.
