CC BY
35
10.Lapshin S.A. Novoe v mineral'nom pitanii sel'skohozyajstvennyh zhivotnyh. - M.:
Rosagropromizdat, 1988. - 207s. ll.Samohin V.T. Profilaktika narushenij obmena mikroelementov u zhivotnyh. - Voronezh: Voronezhskij gos. un-t, 2003. - 136 s.
УДК 576.64 DOI 10.24411/2078-1318-2019-12080
Аспирант Т.П. ДУНЯШЕВ (ФГБОУ ВО СПбГАУ, ООО «БИОТРОФ+», timur@biotrof.ru) Канд. биол. наук Д.В. СОБОЛЕВ (ООО «БИОТРОФ+», sdv@biotrof.ru Доктор биол. наук Г.Ю. ЛАПТЕВ (ФГБОУ ВО СПбГАУ, ООО «БИОТРОФ+», georg-laptev@rambler.ru)
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА РУБЦА У МОЛОДЫХ И ВЗРОСЛЫХ ОСОБЕЙ RANGIFER TARANDUS ИЗ АРКТИЧЕСКИХ РЕГИОНОВ РОССИИ В ОСЕННЕ-ЗИМНИЙ ПЕРИОД*
С северным оленеводством в Российской Федерации прямо или косвенно связаны представители 18 коренных малочисленных народов, которые включают свыше 130 тысяч человек, преимущественно сельских жителей. Статистические и исторические данные показывают, что за годы неоднократных экономических и идеологических реформ в сельском хозяйстве, интенсивного промышленного освоения территории Крайнего Севера только ненцы смогли сохранить оленеводство в полном объеме [1].
Известно, что рубец северных оленей населен симбиотическими микроорганизмами: бактериями, грибами, археями, простейшими. Микрофлора рубца северного оленя играет важную роль в ферментации растительных кормов [2-3]. В летний период олени находятся на пастбищном содержании, их рацион состоит из смеси многолетних трав и кустарников. Зимой рацион северного оленя на 70% состоит из лишайников, которые очень токсичны для многих животных, например, для овец, коров из-за содержания в них усниновой кислоты -метаболита лишайников. К немаловажным функциям анаэробной микрофлоры рубца северных оленей относят ее способность к детоксификации вторичных фенольных метаболитов лишайников: усниновой кислоты и др. [3-4]. Современные знания о микробной экосистеме рубца жвачных в значительной степени основана на результатах исследования КРС, овец [5].
Микробиом рубца у северного оленя меньше изучен по сравнению с другими животными, хотя его анализ представляет значительный интерес в связи с оценкой адаптационно-физиологических и анатомических особенностей организма, позволяющих использовать низкий по питательности рацион тундры и лесотундры. В настоящей работе выполнены молекулярно-генетические исследования микробиоценоза рубца северных оленей ненецкой породы, обитающих на территории Ненецкого автономного округа России [2].
Цель исследования заключалась в сравнительной оценке таксономического состава бактериального сообщества рубца молодых и взрослых особей Rangifer tarandus. Состав бактериального сообщества рубца анализировали методом NGS (Next Generation Sequencing). Установлено, что до 50,30% филотипов относилось к филуму Bacteroidetes. В филуме Firmicutes отмечено 40,82% микроорганизмов от всего бактериального сообщества рубцовой жидкости. Менее представленными оказались Proteobacteria, Spirochaetes, Euryarchaeota, Verrucomicrobia и Cyanobacteria. Процентное соотношение представителей остальных филумов составляет менее 1% от всего бактериального сообщества. В течение онтогенеза у северных оленей наблюдались изменения в соотношении количества филотипов
и таксономических групп микробиоты рубца. Наибольшие возрастные изменения были выявлены в составе филума Firmicutes. В рубце у телят общее содержание целлюлозолитических бактерий родов Ruminococcus, Selenomonas, обладающих потенциальной способностью к гидролизу углеводов растительных кормов с образованием летучих жирных кислот, было выше по сравнению со взрослыми особями, однако представителей рода Streptococcus было значительно меньше в рубцовом содержимом телят, чем у более взрослых животных. Выявлено незначительное количество условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Был выявлен высокий процент рода Treponema филума Spirochaetes у обоих возрастных групп.
Материалы, методы и объекты исследования. Объектом исследования были телята в возрасте полгода и взрослые особи (2-5 лет) северных оленей Rangifer tarandus Ненецкой породы. Образцы содержимого рубца отбирали в осенне-зимний период в 2018 году. Образцы содержимого рубца отбирали от 3-х телят и от 5-ти взрослых животных.
Молекулярно-генетические исследования микробиоты рубца проводили в лаборатории компании ООО «БИОТРОФ+» (Санкт-Петербург) с применением NGS-анализа (Next Generation Sequencing) для определения структуры (процентного содержания) компонентов бактериального сообщества. Они позволяют детектировать и определять содержание низко представленных микроорганизмов в сообществе рубца.
В данной работе мы впервые выполнили молекулярно-генетические исследования методом NGS - секвенирования рубцовой жидкости северных оленей в осенне-зимний период, обитающих на территории Ненецкого-автономного округа. Выделение тотальной ДНК для проведения молекулярно-биологических анализов осуществляли согласно методике, описанной в Маниатиса с соавторами (Маниатис и др., 1984), Ильиной (Ильина, 2013) и Ушаковой с соавторами (Ушакова и др., 2013), в собственной модификации. Тотальную ДНК из исследуемых образцов выделяли с использованием набора «Genomic DNA Purification Kit» («Fermentas, Inc.», Литва), следуя рекомендациям производителя. Концентрацию полученной ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit («Invitrogen, Inc.», США) с использованием наборов «Quant-iT dsDNA Broad-Assay Kit» («Invitrogen, Inc.», США), согласно рекомендациям производителя. Амплификацию для последующего проведения NGS-секвенирования проводили с использованием ДНК-амплификатора Verity («Life Technologies, Inc.», США) с помощью эубактериальных праймеров (IDT), 343F CTCCTACGGRRSGCAGCAG-3') и 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3'), фланкирующих участок V1V3 гена 16S рРНК. Метагеномное секвенирование осуществляли на геномном секвенаторе MiSeq («Illumina, Inc.», США) с набором MiSeq Reagent Kit v3 («Illumina, Inc.», США). Максимальная длина полученных последовательностей составила 2 х 300 нт. Химерные последовательности были исключены из анализа с помощью программы [7]. Обработка полученных ридов 2 х 300 нт происходила с помощью биоинформатической платформы «CLC Bio GW 7.0» («Qiagen», Нидерланды) и включала в себя перекрывание, фильтрацию по качеству (QV>15), триммирование праймеров. Определение таксономической принадлежности микроорганизмов до рода проводили с применением программы [8].
Результаты исследования. В результате исследований установлено (табл.), что в микробиоте рубца исследованных нами особей Rangifer tarandus было выявлено 25 филумов, значительное содержание представителей было отнесено к филумам Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria и Spirochaetes. В меньшей степени в сообществе рубца оказались представлены бактерии филумов Proteobacteria, Spirochaetes, Euryarchaeota, Verrucomicrobia и Cyanobacteria. Остальные филумы составляют менее 1% от всего бактериального сообщества. Полученные результаты в целом соответствуют современным представлениям о микробиоте рубца как жвачных в целом, так и северных оленей в частности.
Таблица. Интегральные показатели содержания бактерий в рубце северных оленей
(NGS-секвенирование), %
Встречаемость таксона, % Телята (6 месяцев) Взрослые особи (3-5 лет)
Филум Bacteroidetes, в т.ч. 47,37 50,30
Род Dysgonomonas 6,37 6,20
Род Paraprevotella 3,90 4,06
Род Sphingobacterium 5,52 4,55
Род Prevotella 22,25 24,74
Род Sphingobacterium 5,52 4,55
Филум Firmicutes, в т.ч. 40,82 37,62
Род Blautia 5,35 4,20
Род Clostridium 2,45 2,36
Род Lachnospira 1,33 1,20
Род Succiniclasticum 6,96 6,55
Род Ruminococcus 5,22 3,83
Род Selenomonas 1,06 0,50
Род Streptococcus 0,52 2,22
Филум Proteobacteria, в т.ч. 1,84 2,05
Семейство Enterobacteriaceae 0,02 0,02
Семейство Enterococcaceae 0,08 0,06
Семейство Campylobacteraceae 0,11 0,12
Филум Spirochaetes, в т.ч. 2,25 2,15
Род Treponema 2,18 2,06
Филум Actinobacteria 0,64 0,75
Филум Verrucomicrobia 1,47 2,14
Филум Tenericutes 0,27 0,32
Филум Cyanobacteria 1,42 0,97
Филум Euryarchaeota 2,61 1,41
Филум Planctomycetes 0,17 0,13
Филум Nitrospirae 0,60 0,55
Филум Chloroflexi 0,53 0,56
Филум Synergistetes 0,26 0,51
Известно, что ряд представителей таксонов Bacteroidetes и Firmicutes проявляют способность к детоксикации усниновой кислоты и других вторичных метаболитов, продуцируемых лишайниками. Кроме того, они синтезируют целлюлозолитические ферменты, способные расщеплять клетчатку, которая содержится в значительных количествах в растениях, входящих в состав кормовой базы северного оленя.
В зависимости от возраста животных в структуре микробиома рубцового содержимого северных оленей мы выявили ряд сходств и различий. Наибольшие возрастные изменения были выявлены в составе филума Firmicutes. В рубце у телят общее содержание целлюлозолитических бактерий родов Ruminococcus, Selenomonas, обладающих потенциальной способностью к гидролизу углеводов растительных кормов с образованием летучих жирных кислот, было достоверно выше по сравнению со взрослыми особями, однако представителей рода Streptococcus было значительно меньше в рубцовом содержимом телят, чем у более взрослых животных.
Выявлено незначительное количество условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Количество данных бактерий с возрастом незначительно изменялось. Был выявлен высокий процент рода Treponema филума Spirochaetes в обоих возрастных группах. Трепонемы являются возбудителями спирохетозов.
Выводы. Следует отметить, что по сообщению авторов Л.А. Ильиной и Т.П. Дуняшева, при сравнении бактериального сообщества рубца северных оленей из разных регионов наблюдались заметные различия в их составе [6]. В данном исследовании животные обитали в одном ареале (с одинаковыми погодными условиями и одинаковым пастбищным рационом), поэтому различия в составе микроорганизмов, населяющих рубец, в процессе онтогенеза были выявлены в незначительном количестве.
*Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда для реализации научного проекта №17-76-20026 «Микробиоценоз рубца Rangifer tarandus Арктических регионов России как фундаментальная основа получения перспективных биотехнологий для сельскохозяйственных животных».
Литература
1. Мухачев А.Д., Лайшев К.А. Мир северного оленя. - Норильск, 2007. - 14 с.
2. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. - М.: Научный мир, 2006. - 188 с.
3. Orpin C.G., Mathiesen S.D., Greenwood Y., Blix A.S. Seasonal changes in the ruminal microflora of the high-arctic Svalbard reindeer (Rangifer tarandus platyrhynchus) // Applied and Environmental Microbiology. - 1985 - V. 50(1). - P.144-151.
4. Sundset M.A., Kohn A., Mathiesen S.D., Praesteng K.E. Eubacterium rangiferina, a novel uscing aeid-resistant bacterium from the reindeer rumen // Natirwissenschaften. - 2008. - V. 95.
- P.721-749.
5. Jami E., Mizrahi I. Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals // PLoS ONE. - 2012. - V. 7(3): e33306.
6. Ильина Л.А., Лайшев К.А., Иылдырым Е.А. и др. Сравнительный анализ бактериального сообщества рубца у молодых и взрослых особей Rangifer tarandus из арктических регионов России в летне-осенний период // Сельскохозяйственная биология. -2018. - Т.53. - №2. - С.355-363.
7. USEARCH [Электронный ресурс].- URL: http://drive5.com/usearch. (дата обращения: 20.02.2019).
8. RDP Classifier [Электронный ресурс].- URL: https://rdp.cme.msu.edu/classifier/ classifier.jsp. (дата обращения: 20.02.2019).
Literatura
1. Muhachev A.D., Lajshev K.A. Mir severnogo olenya. - Noril'sk, 2007. - 14 s.
2. Tarakanov B.V. Metody issledovaniya mikroflory pishchevaritel'nogo trakta sel'skohozyajstvennyh zhivotnyh i pticy. - M.: Nauchnyj mir, 2006. - 188 s.
3. Orpin C.G., Mathiesen S.D., Greenwood Y., Blix A.S. Seasonal changes in the ruminal microflora of the high-arctic Svalbard reindeer (Rangifer tarandus platyrhynchus) // Applied and Environmental Microbiology. - 1985 - V. 50(1). - P.144-151.
4. Sundset M.A., Kohn A., Mathiesen S.D., Praesteng K.E. Eubacterium rangiferina, a novel uscing aeid-resistant bacterium from the reindeer rumen // Natirwissenschaften. - 2008. - V. 95.
- P.721-749.
5. Jami E., Mizrahi I. Composition and similarity of bovine rumen microbiota across individual animals // PLoS ONE. - 2012. - V. 7(3): e33306.
6. Il'ina L.A., Lajshev K.A., Jyldyrym E.A. i dr. Sravnitel'nyj analiz bakterial'nogo soobshchestva rubca u molodyh i vzroslyh osobej Rangifer tarandus iz arkticheskih regionov Rossii v letne-osennij period // Sel'skohozyajstvennaya biologiya. - 2018. - T.53. - №2. - S.355-363.
7. USEARCH [Elektronnyj resurs].- URL: http://drive5.com/usearch. (data obrashcheniya: 20.02.2019).
8. RDP Classifier [Elektronnyj resurs].- URL: https://rdp.cme.msu.edu/classifier/ classifier.jsp. (data obrashcheniya: 20.02.2019).
