CC BY
61
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11018 УДК 636.03+636.084/.087+ 579.8 +57.063.7
Метагеномный анализ изменения микробиоты рубца коров при использовании экспериментального кормового концентрата*
Е. О. КРУПИН1, кандидат ветеринарных наук, зав. отделом (e-mail: evgeny.krupin@gmail.com) А. М. ХАРЧЕНКО2, магистрант (e-mail: public.mail@kpfu.ru)
Ш. К. ШАКИРОВ1, доктор сельскохозяйственных
наук, главный научный сотрудник
Т. В. ГРИГОРЬЕВА2, кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
М. Ш. ТАГИРОВ1, доктор сельскохозяйственных
наук, руководитель обособленного структурного
подразделения
Татарский научно-исследовательский институт сельского хозяйства - обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской академии наук», ул. Оренбургский тракт, 48, Казань, 420059, Российская Федерация 2Казанский (Приволжский) федеральный университет, ул. Кремлевская, 18, Казань, 420000, Российская Федерация
Резюме. Цель исследований - сравнительный анализ изменения микробиоты рубца дойных коров при использовании в составе рационов кормления экспериментального кормового концентрата. Исследования выполнены в Республике Татарстан в2017-2018гг. на 80 дойных короваххолмогорской породы татарстанского типа. Животных разделили на четыре группы по 20 голов в каждой. Коровы I контрольной группы получали основной рацион (ОР). Особям II, III, ^опытныхгрупп дополнительно кОРдавали отдельно экспериментальный кормовой концентрат в количестве 100, 150 и 200 г/гол. Добавка включала комплекс ферментов и пробио-тических микроорганизмов (5 %), L-карнитин (5 %) и сапропель (90 %). Анализ микрофлоры рубца проводили с использованием секвенирования по гену 16S рРНК на платформе IlluminaMiSec. Полученные метагеномные данные анализировали с помощью QIIME pipeline с использованием базы данных Greengenes v.13.8 и RDP Classifier. У животных III и IV групп выявлено наибольшее содержание микроорганизмов родов Fibrobacter - 0,0110...0,0162% и 0,0070.0,0160 и Ruminococcus - 0,0275.0,0493 и 0,0250... 0,0437 %; Anaeroplasma - 0,0330. 0,0580 и 0,0220. 0,0610 %; Ruminobacter - 0,0003.0,0036 и 0,0022.0,0064 % соответственно. У особей I группы доля этих микроорганизмов составила соответственно 0,0035. 0,0122; 0,0150.0,020; 0,0080. 0,0430; 0,0002.0,0064 %. Индекс Шеннона у животных контрольной группы был равен 8,21, II - 7,50, III - 8,80, IV- 8,18. Возможно, наиболее выровненной представленности рубцовой микробиоты у коров III группы способствовала оптимально подобранная доза скармливания экспериментального кормового концентрата. Ключевые слова: пищеварение, микробиота, корова, корм, секвенирование, ДНК, метагеном.
Для цитирования: Метагеномный анализ изменения микробиоты рубца коров при использовании экспериментального кормового концентрата / Е. О. Крупин, А. М. Харченко, Ш. К. Шакиров и др. // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 10. С. 79-81. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11018.
Благодаря микроорганизмам, населяющим рубец и толстый отдел кишечника, жвачные животные спо-
собны переваривать большие количества объемистых кормов. В 1 мл рубцовой жидкости содержится 10... 50 млрд бактерий, 1 млн простейших, а также некоторое количество дрожжей и грибов. Основная особенность пищеварения, присущая жвачным животным, связана с наличием у них сложного четырехкамерного желудка (точнее, трехкамерного преджелудка). Чтобы накормить корову, нужно обеспечить питанием многочисленные микроорганизмы (бактерии, грибки, инфузории), населяющие рубец и другие отделы желудочно-кишечного тракта, так как благодаря этой микрофлоре происходит переваривание белков, углеводов, жиров и синтез витаминов группы «В». Поскольку растительные корма содержат большое количество углеводов, им принадлежит большая роль в организации сбалансированного кормления коров [1, 2, 3]. Для этих целей также используют различные кормовые балансирующие средства [4].
Многие бактерии рубца - строгие анаэробы, что затрудняет работу с ними. Кроме того, как недавно было показано зарубежными специалистами, значительная часть микроорганизмов рубца представлена видами, нежизнеспособными при культивировании на искусственных питательных средах, однако активными в процессах рубцовой ферментации. Для их идентификации следует применять современные методы. Так, использование методов секвенирования в анализе микробиологических сообществ расширяет наши знания и понимание сложности и разнообразия экосистем [5, 6].
Цель исследований - проанализировать изменения микробного сообщества рубца коров при использовании в рационе кормления экспериментального кормового концентрата.
Условия, материалы и методы. Работу проводили в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН, Казанском (Приволжском) федеральном университете, ООО «Агрофирма Рассвет» Кукморского района Республики Татарстан на дойных коровах холмогорской породы татарстанского типа в 20172018 гг. Исследования выполняли с 27 по 90 день лактации до завершения периода раздоя. Животных разделили на четыре группы по 20 голов в каждой. Коров содержали на привязи. Дойные коровы I контрольной группы получали основной рацион (ОР), состоящий из сена люцернового (2,0 кг), сенажа люцернового (7,0 кг), сенажа из кормос-меси (13,0 кг), силоса кукурузного (13,0 кг), картофеля вареного (2,0 кг), зерна овса (0,7 кг), дробины пивной свежей (3,0 кг), свекловичной патоки (0,8 кг), соли поваренной (0,1 кг), комбикорма-концентрата КК-60 (11,5 кг). Животным II, III, IV опытных групп дополнительно к ОР давали экспериментальный кормовой концентрат, разработанный и произведенный в ТатНИИСХ ФИЦ КазНЦ РАН, в количестве 100, 150 и 200 г/гол. в сутки соответственно. Он включал комплекс ферментов и пробиотических микроорганизмов (5 %), L-карнитин (5 %) и сапропель (90 %).
* Работа выполнена в рамках государственного задания «Мобилизация генетических ресурсов растений и животных, создание новаций, обеспечивающих производство биологически ценных продуктов питания с максимальной безопасностью для здоровья человека и окружающей среды». Номер регистрации: АААА-А18-118031390148-1.
0,020 в 0,018 ^ 0,016 | 0,014 | 0,012 ю 0,010
S 0,008 £ 0,006 | 0,004 в 0,002 0,000
а)
h i
0,06
0,05
g 0>04 <и
«I 0,03 е
и 0,02 я
I 0,01
б)
❖
/ г у*
V
0,009 ^ 0,008 0,007 | 0,006 | 0,005 § 0,004 s 0,003
I 0,002 в
я 0,001 о
г)
V
Рис. 1. Доля родов микроорганизмов, утилизирующих углеводы растений, в микробном сообществе рубцовой жидкости: а) ЯЬгоЬаМег; б) Яит1пососсив; в) Апаегор1авта; г) Яит1поЬас1ег.
Добавку скармливали отдельно как самостоятельный компонент рациона в утреннее кормление.
I группа II ^^ia III группа IV группа (контроль)
Рис. 2. Величина индекса Шеннона и доля видов рода Ruminococcus в микробном сообществе рубцовой жидкости: I I - индекс Шеннона; - доля в сообществе, %.
Содержимое рубца у животных отбирали по общепринятой в ветеринарии методике [7] после завершения периода скармливания экспериментального кормового концентрата (на 91 день лактации). Из него выделяли ДНК содержащейся микробиоты модифицированным феноль-ным методом, готовили библиотеки и секвенировали по гену 16S рРНК на платформе IlluminaMiSec. Полученные метагеномные данные анализировали с помощью QIIME pipeline с использованием базы данных Greengenes v.13.8 и RDP Classifier. Указанные исследования проводили в Казанском (Приволжском) федеральном университете.
О репрезентативности полученных результатов судили по значениям индекса Шеннона, а также кластеризации микробиоты рубца дойных коров методом многомерного шкалирования.
Результаты и обсуждение. Скармливание кормового концентрата положительно влияло на бактерии,
участвующие в углеводном обмене [8, 9, 10] (рис. 1). У животных III и IV групп выявлено наибольшее содержание доли целлюлозоли-тических микроорганизмов родов Fibrobacter - 0,0110... 0,0162 и 0,0070.0,0160 % и Ruminococcus - 0,0275. 0,0493 и 0,0250.0,0437 % соответственно; способных ферментировать растительные углеводы Anaeroplasma -0,0330.0,0580 и 0,0220. 0,0610 % соответственно; сбраживающих мальтозу и крахмал Ruminobacter -0,0003.0,0036 и 0,0022. 0,0064 % соответственно. В контроле содержание этих микроорганизмов составило соответственно 0,0035. 0,0122; 0,0150.0,020; 0,0080.0,0430; 0,0002. 0,0064 %.
Доля микроорганизмов рода Ruminococcus в сообществе рубцовой жидкости у животных III и IV групп при введении их c концентратом увеличивалась, по сравнению с контролем, на 116,7 и 83,3 % и составляла в среднем 0,039±0,013 и 0,033±0,012 % соответственно (рис. 2).
У особей III группы был установлен самый высокий индекс Шеннона - 8,80, что на 7,2 и 7,6 % выше, чем у животных I и IV групп соответственно, и на 17,3 % выше, чем у животных II группы. Он отражает большее биоразнообразие рубцовой микробиоты и ее более выровненное распределение в III группе. Таким образом, на наш взгляд, оптимально подобранная доза скармливания экспериментального кормового концентрата коровам III группы обеспечивала наиболее выровненную представленность рубцовой микробиоты. Кроме того, на переваривание кормовых средств, содержащих микроорганизмы, влияют индивидуальные особенности микрофлоры рубца животных [11].
Наибольшее разнообразие видов рода Ruminococcus отмечено в микробном сообществе рубцовой жидкости III и IV групп - соответственно на 12,5 и 7,0 % больше, чем в контоле, и на 29,1 и 22,8 %, чем в I группе (рис. 3).
I группа (контроль)
II группа Ш группа
IV группа
Рис. 3. Количество видов рода Йит!пососсив в микробном сообществе рубцовой жидкости.
"."2
*
-".12
"4
Рис. 4. Кластеризация микробиоты рубца дойных коров методом многомерного шкалирования на основе родового разнообразия в метрическом пространстве координат родового разнообразия: # - группа I; ■ - группа II; Л - группа III; - группа IV.
наименее отдалены один от другого в метрическом пространстве координат родового разнообразия и формируют более устойчивую зависимость. Для установления достоверности полученных изменений необходимо провести исследования на большем поголовье животных различных популяций.
Необходимо отметить, что в рубце присутствует большое количество видов микроорганизмов, на которые кормовой концентрат не влиял.
Выводы. Использование в составе рационов экспериментального кормового концентрата сопровождалось увеличением в микробном сообществе доли микроорганизмов, обеспечивающих углеводный обмен, рода Fibrobacter до ","162 %, Ruminococcus - до ","493 %, Anaeroplasma - до ","61" % и Ruminobacter - до ",""65 %.
У особей III группы, получавших кормовой концентрат в дозе 15" г/гол. в сутки, установлен наибольший индекс Шеннона - 8,8", что на 7,2...17,3 % выше, чем у коров других групп. Самую выровненную представленность рубцовой микробиоты в этой группе, на наш взгляд, обеспечивала оптимально подобранная доза экспериментального кормового концентрата.
В целом у животных III и IV групп не выявили существенной зависимости количества и видового разнообразия микробиоты от нормы ввода кормового концентрата, в отличие от особей II группы (рис. 4), показатели которых
Литература.
1. Харитонов Е. Л., Агафонов В. И., Харитонов Л. В. Организация научно-обоснованного кормления высокопродуктивного молочного скота: практические рекомендации. Боровск: ВНИИФБиП с.-х. жив., 2008. 105 с.
2. Душкин Е. В., Матющенко П. В., Еременко В. И. Динамика ЛЖК в крови по фазам репродуктивного цикла // Вестник Сумского НАУ. Серия «Ветеринарная медицина». 2006. № 7 (17). С. 33 - 36.
3. Niwinska, B. Digestion in Ruminants // Carbohydrates - Comprehensive Studies on Glycobiology and Glycotechnology. 2012. Рр. 245-258.
4. Филиппова О. Б., Фролов А. И., Зазуля А. Н. Метаболический статус нетелей и первотелок при кормлении концентратами с использованием БВМК//Ветеринария. 2016. № 11. С. 49-55.
5. Evaluation of 16S rRNA Gene Primer Pairs for Monitoring Microbial Community Structures Showed High Reproducibility within and Low Comparability between Datasets Generated with Multiple Archaeal and Bacterial Primer Pairs / M. A. Fischer, S. Gullert, S. C. Neulinger, etc. // Frontiers in Microbiology. 2016. Vol. 7. 1297 p.
6. Comparison of rumen bacteria distribution in original rumen digesta, rumen liquid and solid fractions in lactating Holstein cows / Sh. Ji, H. Zhang, H. Yan, etc. // Journal of Animal Science and Biotechnology. 2017. Vol. 8. 16 p.
7. Методы ветеринарной клинической лабораторной диатоники: Справочник/И. П. Кондрахин, А. В. Архипов, В. И. Левченко и др. М.: Колос, 2004. 520 c.
8. Bera-Maillet C., Ribot Y., Forano E. Fiber-Degrading Systems of Different Strains of the Genus Fibrobacter // Applied and Environmental Microbiology. 2004. Vol. 70. Pp. 2172-2179. PMCID: PMC383150.
9. Zhao L. Effects of Nitrate Addition on Rumen Fermentation, Bacterial Biodiversity and Abundance / L. Zhao, Q. Meng, L. Ren, etc. // Asian-Australasian Journal of Animal Sciences. 2015. Vol. 28. Pp. 1433-1441.
10. Пристеночная микрофлора кишечника / И. Д. Лоранская, М. Н. Болдырева, О. А. Лаврентьева и др. М.: Прима Принт, 2015. 100 с.
11. Uyeno Y., Shigemori S., Shimosato T. Effect of Probiotics/Prebiotics on Cattle Health and Productivity // Microbes and Environments. 2015. Vol. 30. No. 2. Pp. 126-132.
"
Координата 1
Metagenomic Analysis of the Microbiota Change of Cow Rumen with the Use of Experimental Feed Concentrate
E. O. Krupin1, A. M. Kharchenko2, Sh. K. Shakirov1, T. V. Grigor'eva2, M. Sh. Tagirov1
1Tatar Research Institute of Agriculture - Subdivision of the Federal Research Center «Kazan Scientific Center of Russian Academy of
Sciences», ul. Orenburgskii trakt, 48, Kazan', 420059, Russian Federation
2Kazan Federal University, ul. Kremlevskaya, 18, Kazan', 420000, Russian Federation
Abstract. The purpose of the research was a comparative analysis of changes in the rumen microbiota of dairy cows when experimental feed concentrate was included in diets. The studies were performed in the Republic of Tatarstan in 2017-2018 on 80 dairy cows of Kholmogorskaya breed of the Tatarstan type. The animals were divided into four groups of 20 animals each. Cows from the control group (I) were fed by the basic diet. Animals from experimental groups II, III, and IV were fed by 100, 150 and 200 g/head of the experimental feed concentrate in addition to the basic diet. The additive included a complex of enzymes and probiotic microorganisms (5%), L-carnitine (5%) and sapropel (90%). Rumen microflora analysis was performed using sequencing of the 16S rRNA gene on the IlluminaMiSec platform. The obtained metagenomic data was analyzed with the help of the QIIME pipeline using the Greengenes v.13.8 database and the RDP Classifier. In animals from groups III and IV, it was revealed the highest content of microorganisms of genera of Fibrobacter (0.0110-0.0162% and 0.0070-0.0160%), Ruminococcus (0.0275- 0.0493% and 0.0250-0.0437%); Anaeroplasma (0.0330-0.0580% and 0.0220-0.0610%); Ruminobacter (0.0003-0.0036 and 0.0022-0.0064%). In animals from group I, the share of these microorganisms was, respectively, 0.0035-0.0122, 0.0150-0.0200, 0.0080-0.0430, 0.0002-0.0064%. The Shannon index in animals from group I was 8.21, II - 7.50, III - 8.80, IV - 8.18. Perhaps, the most balanced representation of the rumen microbiota in cows of group III was facilitated by the optimally selected dose of the experimental feed concentrate. Keywords: digestion; microbiota; cow; feed; sequencing; DNA; metagenome.
Author Details: E. O. Krupin, Cand. Sc. (Vet.), head of division (e-mail: evgeny.krupin@gmail.com); A. M. Kharchenko, master's student (e-mail: public.mail@kpfu.ru); Sh. K. Shakirov, D. Sc. (Agr.), chief research fellow; T. V. Grigor'eva, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; M. Sh. Tagirov, D. Sc. (Agr.), director of economically autonomous structural subdivision.
For citation: Krupin E. O., Kharchenko A. M., Shakirov Sh. K., Grigor'eva T. V., Tagirov M. Sh. Metagenomic Analysis of the Microbiota Change of Cow Rumen with the Use of Experimental Feed Concentrate. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2018. Vol. 32. No. 10. Pp. 79-81 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11018.
