CC BY
52
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК: 577.151.35:572.152.9:577.125.5:616.993.161
Метаболизм D-арабинозы:
характеристика
бифункциональной
арабинокиназы/
пирофосфорилазы
Leishmania major
Н.М. Новожилова*, Н.В. Бовин
Институт биоорганической химии им. акад. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, 117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 *E-mail: [email protected]
РЕФЕРАТ Арабиноза входит в состав биологически важных гликоконъюгатов клеточной поверхности многих бактерий, простейших и растений. В составе природных соединений этот моносахарид находится преимущественно в виде L-арабинофуранозы, в то время как форма D-арабинопиранозы (D-Arap) встречается крайне редко. Только паразитирующие простейшие рода Leishmania (возбудители лейшманиоза — заболевания кожи и внутренних органов млекопитающих, в т.ч. и человека), на определенных стадиях жизненного цикла используют D-Arap в качестве важного компонента гликоконъюгатов, необходимых для их вирулентности [1]. Биосинтез D-Arap практически не изучен, и, так как этот сахар отсутствует в клетках млекопитающих, его изучение может дать ключ к созданию лекарств против лейшманиоза. Известно, что донором D-Arap в биосинтезе гликоконъюгатов Leishmania и Crithidia является GDP-D-Arap [2]. Настоящая работа направлена на изучение биосинтеза D-Arap на стадии активации моносахарида до GDP-D-Arap и характеризации необычного фермента из L.major, который оказался арабинокиназой-пирофосфорилазой, т.е. способен синтезировать GDP-D-Arap из D-Arap через промежуточный Б-арабино-1-фосфат в присутствии АТР и GTP. В данной работе также сделана попытка установить, какой из белков-переносчиков транспортирует GDP-D-Arap в люмен аппарата Гольджи, где происходит синтез арабинозосодержащих гликоконъюгатов клеточной поверхности Leishmania. Ключевые слова: D-арабинопираноза, Leishmania, бифункциональный фермент, киназа, пирофосфорилаза, липофосфогликан.
Список сокращений: D-Arap — D-арабинопираноза; L-Fuc — L-фукоза; Km — константа Михаэлиса-Ментен; Vmax — максимальная скорость реакции.
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что бактерии (род Bacteriodes) и растения (род Arabidopsis) могут синтезировать GDP-L-Fuc из L-фукозы (L-Fuc) через промежуточный L-фукозо-1-фосфат с помощью бифункционального фермента L-фукокиназы/ GDP-L-фукозопирофосфорилазы [3,4]. Т.к. D-Arap и L-Fuc являются структурно родственными моносахаридами, представлялось логичным, что биосинтез GDP-D-Arap у Leishmania может протекать по механизмам, схожим с биосинтезом GDP-L-Fuc у других организмов. Чтобы проверить это предположение, геном L.major был изучен на наличие открытых рамок считывания, гомологичных участкам генов фукокиназы и GDP-L-фукозопирофосфорилазы. В результате были обнаружены два почти идентичных гена (lmjF16.0440 и lmjF16.0480), обладающие высокой схожестью с генами fkp Bacteriodes fragilis и at1g01220 Arabidopsis thaliana, кодирующими L-фукокиназы/ GDP-L-фукозопирофосфорилазы [3, 4].
Открытые рамки считывания lmjF16.0440 и lmjF16.0480 соответствуют предполагаемым полипептидам, состоящим из 1187 аминокислот, с расчетной молекулярной массой 126.5 ^a. Единственным различием (три аминокислотных остатка) между двумя белками является участок 196—199,
а именно PheGlnAsnHis для LmjF16.0480 и LeuGlnAspTyr для Lm.jF16.0440. На Ы-концах этих белков находится высококонсервативный участок Val100-Lys117, который обладает высоким сходством с консервативным мотивом пиро-фосфорилаз, Lys(X)2GlyXThrXMet(X)4Lys [5]. На С-концах также находится консервативный участок Gly950—11е958, гомологичный мотиву GlyXGly(X)2Gly(Ser)2Gly, формирующему АТР-связывающий карман у многих киназ [6]. Присутствие этих консервативных последовательностей дало основание предполагать наличие киназной и пиро-фосфорилазной активностей на С- и Ы-концах белков, соответственно.
Таблица 1. Кинетические параметры сродства к субстрату рекомби-нантных ферментов LmjF16.0440 и LmjF16.0480
Фермент Субстрат Km (mM) V (uM/L/min) max M '
LmjF16.0440 D-арабиноза D-арабинозо-1-фосфат 1.23 0.35
LmjF16.0480 D-арабиноза D-aрабинозо-1-фосфат 2.90 67.0 0.50 160.0
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для тестирования активности предполагаемых ферментов гены lmjF16.0440 и lmjF16.0480 были клонированы в плаз-мидный вектор pET16b. Рекомбинантные LmjF16.0440 и LmjF16.0480 были экспрессированы в клетках E.coli BL21 (DE3)-RIPL и протестированы на наличие ферментативной активности, результаты представлены на рис. 1. Белок LmjF16.0480 катализировал образование D-Arap-фосфата и GDP-D-Arap, в то время как LmjF16.0440 синтезировал только D-Arap-фосфат. Когда в реакционной смеси присутствовали только неспецифические белки, полученные из клеток E.coli, трансформированных пустым вектором pET 16b, образование продуктов реакции не наблюдалось. Полученные данные позволяют заключить, что продукт гена lmjF16.0480 действительно действует как бифункциональная арабинокиназа-пирофосфорилаза, т.е. обладает D-арабинокиназной и GDP-D-Arap-пирофосфорилазной активностями, в то время как рекомбинантный белок LmjF16.0440 обладает только D-арабинокиназной активностью.
Чтобы подтвердить необходимость АТР для киназной и GTP для пирофосфорилазной активностей изучаемых белков, ферментативные реакции проводили в присутствии только одного из трифосфатов. В отсутствие как АТP, так и GTP образования продуктов реакции не наблюдалось. В присутствии только АТP реакция шла не полностью, и приводила только к арабинозо-фосфату. Когда в реакционной смеси находился только GTP, образовывались небольшие количества GDP-D-Arap, по-видимому, благодаря тому, что фермент был способен частично утилизировать GTP вместо ATP. Однако в присутствии только GTP реакция шла медленно, и выход продуктов реакций был низким, по сравнению с реакцией в присутствии ATP + GTP. Таким образом, для протекания полноценной реакции необходимо присутствие в реакционной среде обоих трифосфатов: АTP для киназной и GTP для пирофосфорилазной активности исследуемых бифункциональных ферментов.
Для рекомбинантных LmjF16.0440 и LmjF16.0480 были измерены кинетические параметры, а именно константы Михаэлиса-Ментен (K ) и максимальная скорость реакции (V ). В табл. 1 приведены параметры для каждой реакции с участием обоих ферментов. Как киназы, оба фермента ведут себя схожим образом. Обращает на себя внимание необычно большое значение K = 67 мМ для пирофосфорилазной реакции, катализируемой LmjF16.0480. Такое низкое сродство к арабинозо-фосфату может свидетельствовать о том, что в ферменте оба каталитических центра связаны между собой, и D-Arap-1-фосфат из киназного центра сразу попадает в пирофосфорилазный. Поэтому, для того чтобы «внешний» арабинозо-фосфат достиг пи-рофосфорилазного активного центра, потребовалось добавление его значительных количеств, что и отразилось на значении K .
m
Геном человека содержит гены, обладающие частичной гомологией с бифункциональным ферментом Leishmania. Например, локус NP 659496 кодирует белок, состоящий из 1185 аминокислотных остатков и обладающий 44 % гомологии на киназном С-конце, однако его N-конец не имеет значимой схожести с пирофосфорилазными доменами. Ген
был клонирован, и рекомбинантный продукт гена был проверен на способность синтезировать GDP-D-Arap. Результаты тестирования показали отсутствие активности у человеческого белка. Учитывая низкую степень гомологии Ы-конца человеческого белка с пирофосфорилазными доменами, отсутствие у него пирофосфорилазной активности не удивительно. Способность активировать D-арабинозу также не выявлена, несмотря на большое сходство киназного С-конца с Lm.jF16.0440 и Lm.jF16.0480.
»I [3H]-D-Arap Rf= 0.56
£ J" d и 1
0 J
0 ¡1 GL |M J /'
A. Контроль
,Mil [3H]-D-Arap-1-фосфат
Rf = 0.26
£:it " I
U
0 il 1
0 ¡ï 1 1
m • J
Б. LmjF16.0440
GDP-[3H]Arap [3H]-D-Arap-1-фосфат
Rf = 0.16 Rf = 0.26
£ pi - d и 0 и
0 ■ï !.. ÛL ; 1 У \nfn*
В. LmjF16.0480
Рис. 1. Анализ продуктов ферментативной реакции. Штамм E.coli BL21 (DE3)-RIPL трансформировали плазмидами pET16b-LmjF16.0440(His)6 и pET16b- LmjF16.0480(His)6, индуцированные клетки лизировали, белки солюбилизировали 0.1 % Tween 20 и иммобилизовали на аффинном сорбенте TALON за счет гистидинового тэга на N-концах. Связанные с TALON рекомбинантные LmjF16.0440 и LmjF16.0480 тестировали на наличие ферментативной активности. Реакционная среда содержала 5 мМ АТР, 5 мМ GTP, 5 мМ MgSO4 и 0.15 |jCi [3H]D-Arap в качестве субстрата. Реакционную смесь инкубировали в течение ночи при 37 0С и продукты реакции разделяли на силикагельных ТСХ пластинках (1-бутанол/уксусная кислота/вода, 2 : 1 : 1). Положение тритилированных продуктов реакции выявляли с помощью радиохроматографического сканера Bio Scan System 200. В контрольной смеси, содержащей только неспецифические белки, продуктов реакции не наблюдается (А). При добавлении в реакционную смесь белка LmjF16.0440 образовывался только D-Arap-фосфат (Б), в то время как фермент LmjF16.0480 синтезировал D-Arap-фосфат и GDP-D-Arap (В)
№ 3 2009 | ACTA NATURAE | 91
L.major дикого типа
< I
а
О
L.major дикого типа
L.major
igp 2-/-
L.major
igp 2-/-
Липофосфогликан
Гликозилинозитол-фосфолипиды
Рис. 2. Идентификация белка, ответственного за перенос GDP-D-Arap в аппарат Гольджи. Культуры L.major дикого типа и нокаут-ной по гену lpg2 (L.major lpg2-/-) были метаболитически мечены [3H]-D-Arap. Липофосфогликан и гликозилинозитолфосфолипиды клеточной поверхности меченых клеток были экстрагированы, как описано в [8], после чего измерено количество включенной P^-D-Arap. Нокаутирование гена lpg2, кодирующего мультиспецифичный белок-транспортер LPG2, предотвращало включение D-Arap в состав фосфогликанов клеточной поверхности L.major
ВЫВОДЫ
В большинстве случаев активированные формы углеводов синтезируются в цитоплазме и затем переносятся в люмен аппарата Гольджи, где они используются соответствующими гликозилтрансферазами как доноры субстратов в реакциях гликозилирования. Ранее было доказано существование в аппарате Гольджи Leishmania мультиспе-цифичного белка-транспортера LPG2, способного, помимо GDP-Man, также переносить GDP-D-Arap и GDP-L-Fuc [7]. Чтобы показать, что LPG2 является единственным
транспортером, ответственным за перенос GDP-D-Arap в аппарат Гольджи, клетки L.mаjor дикого типа и нокаут-ные по гену lpg2 (L.mаjor lpg2-/-) растили в присутствии [3Н]-арабинозы, после чего измеряли количество [3H]Ara включенной в гликоконъюгаты клеточной поверхности (рис. 2). Из приведенных данных видно, что у клеток L.major, нокаутных по гену lpg2, не происходит включения [3Н]-арабинозы. Отсутствие арабинозы в липофосфо-гликане L.major lpg2-/- вполне объяснимо, т.к. потеря LPG2 приводит к прекращению транспорта GDP-Man в аппарат Гольджи и, соответственно, прекращению синтеза углеводной части молекулы [9]. Таким образом, даже при наличии GDP-Arap, транспортируемой в люмен Гольджи другим белком, у арабинозил-трансфераз нет акцепторных сайтов для переноса арабинозы на липофосфогликан. Этого нельзя сказать о гликозилинозитолфос-фолипидах. Гликозилирование этих молекул происходит по другому биосинтетическому пути, с использованием долихол-фосфат-маннозы в качестве донора [10], поэтому отсутствие арабинозы в составе гликозилинозитолфосфо-липидов L.major lpg2-/- можно объяснить прекращением транспорта GDP-Arap в аппарат Гольджи в клетках, лишенных гена lpg2.
Таким образом, полученные данные позволяют с высокой долей вероятности предположить, что синтезируемый в цитоплазме GDP-D-Arap транспортируется в люмен аппарата Гольджи мультифункциональным белком-переносчиком LPG2. Также установлено, что находящийся в геноме L.major ген lmjF16.0480 кодирует бифункциональную арабинокиназу-пирофосфорилазу, способную синтезировать GDP-D-Arap из D-Arap через промежуточную стадию D-арабино-1-фосфата при одновременном наличии АТР и GTP.
Авторы выражают свою признательность Х. Гуо (Университет Вашингтона, США) за помощь в идентификации и клонировании генов Leishmania major и человека, и С. Турко (Университет Кентукки, США) за помощь в обсуждении результатов. •
Финансирование исследований осуществлялось с помощью Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. McConville M., Turco S., Ferguson M., Sacks D. // EMBO J. 1992. V. 11. P. 3593-3600.
2. Schneider P., McConville M., Ferguson M. // J. Biol. Chem. 1994. V. 269. P. 18332-18337.
3. Coyne M., Reinap B., Lee M., Comstock L. // Science. 2005. V. 307. P. 1778-1781.
4. Kotake T., Hojo S., Tajima N., Matsuoka K., Koyama T. et al // JBC. 2008. V. 283. P. 8125-8135.
5. Peneff C., Ferrari P., Charrier V., Taburet Y., Monnier C. et all // EMBO J. 2001. V. 20. P. 6191-6202.
6. Hanks S., Quinn A., Hunter T. // Science. 1988. V. 241. P. 42-52.
7. Hong K., Ma D., Beverley S., Turco S. // Biochemistry. 2000. V. 39. P. 2013-2022.
8. McConville M. J., Bacic A. // JBC. 1989. V. 264. P. 757-766.
9. Spath G., Lye L., Segawa H., Sacks D., Turco S. et al // Science. 2003. V. 301. P. 1241-1243.
10. Ilgoutz S.C., Zawadzki J.L., Ralton J.E., McConville M.J. // EMBO J. 1999. V. 18. P. 2746-2755.
