CC BY
315
Вестник ДВО РАН. 2004. № 3
Биохимия, биотехнология, фармакология
П. А.ЛУКЬЯНОВ, Н.В .ЖУРАВЛЕВА
Современная гликобиология и медицина
Предметом исследования гликобиологии являются углевод—зависимые процессы, происходящие в клетке. Особое внимание уделяется состоянию гликозилирования протеинов и липидов, а также трансмембранной передаче сигнала, основанной на углевод—белковом взаимодействии. Нарушение экспрессии и функции углевод—связывающих рецепторов и ферментов углеводного обмена в клетке приводит к различным патологиям. Частичные нарушения гликозилирования белков и липидов отражаются в задержке развития, спонтанных абортах, дисфункции печени, расстройстве пищеварительной системы и др. Точное определение строения и роли углеводных цепей в гликопротеинах имеет важное значение для медицины, так как создает основу для разработки новых лекарственных препаратов, например тканевых активаторов плазминогена, иммуномодуляторов, антивирусных лекарственных веществ, применяемых в препаратах отвлекающей терапии аутоиммунных заболеваний. При некоторых дисфункциях возможна замещающая терапия с блокадой соответствующих рецепторов орально применяемыми моносахаридами — фукозой, маннозой или N—ацетилглюкозамином. Теоретически возможна и генная терапия, направленная на восстановление биосинтеза гликанов или их рецепторов.
Основное внимание, уделяемое коллективом лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН в области гликобиологии, направлено на изучение структуры гликопротеинов — он-кофетальных антигенов и белков острой фазы, разработку иммунохимических тест-систем для их определения в биологических жидкостях. Разрабатываются новые тест-системы с использованием лек-тинов морских беспозвоночных для выявления нарушений гликозилирования секретируемых и мембран—связанных клеточных гликоконъюгатов. Проводятся исследования углевод—зависимых процессов адгезии, пролиферации и ферментативной активности в экспериментах in vitro на первичных культурах клеток онкопациентов и линиях клеток различной этимологии.
The current glycobiology and medicine. P.A.LUKYANOV, N.VZHURAVLEVA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
The subject of glycobiology is the carbohydrate—dependent processes occurring in a cell. The special emphasis is placed on the glycosylation status of proteins and lipids as well as the transmembrane signal transduction based on the carbohydrate—protein interactions. Alteration of expression and function of the carbohydrate-binding receptors and enzymes of the carbohydrate biosynthesis in a cell results in different pathologies. The partial alternation in the protein and lipid glycosylation is accompanied by various symptoms, which include the development delay, spontaneous abortions, liver dysfunction, frustration of a digestive system, and others. Exact definition of structure and role of the carbohydrate chains in glycoproteins is important for medicine since it provides a basis for development of new therapeutical agents, for example, plasminogene activators, immunomodulators, and antiviral substances and formulations used in distracting therapy of the autoim-munological diseases. Under some dysfunctions, replacing therapy with blockade of appropriate receptors is possible by oral use of monosaccharides, namely, fucose, mannose and N—acetylglucosamine. The gene therapy directed to recovery of the glycan biosynthesis or their receptors is theoretically possible too.
The basic research in glycobiology carried out at the Laboratory of Chemistry of Noninfectious Immunity of the Pacific Institute of Bioorganic Chemistry of FEB RAS is directed to studying the structure of glycoproteins, such as the oncofetal antigenes and acute phase proteins, and developing the diagnostic kits for their
ЛУКЬЯНОВ Павел Александрович — доктор химических наук, ЖУРАВЛЕВА Наталья Владимировна (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).
detection in the biological fluids. New test—systems for investigating the alternations in glycosylation of secreted and membrane-binding glycoconjugates are developed with using the marine in-vertebrate lectins. The carbohydrate-dependent processes of adhesion, proliferation and enzyme activities are studied in vitro in the initial cell cultures took from the cancer patients and in different cell lines of various etymologies.
В последние несколько лет достижения в области гликобиологии позволили по-новому взглянуть на роль углеводов. В настоящее время система угле-вод-белкового узнавания рассматривается как дополнительная к генетическому коду, суть которой заключается в следующем. Углеводы в живых организмах представлены в виде гликопротеинов, гликолипидов и полисахаридов, которые обладают огромным потенциалом кодирования биологической информации. Если в пептидах или олигонуклеотидах информация кодируется числом аминокислот или нуклеотидов и их последовательностью, то в случае углеводных структур — также аномерной конфигурацией и положением связи. Так, две молекулы одного моносахарида (например, глюкозы) могут образовать 11 различных дисахаридов, тогда как две молекулы одной аминокислоты или нуклеотида могут образовать, соответственно, только один дипептид или один динуклеотид. Благодаря этому углеводные цепи обладают уникальными возможностями кодирования информации.
В эукариотических организмах углеводы присоединены к белкам (гликопротеины), липидам (гликолипиды), являются частью нуклеотидов. Процесс присоединения сахаров известен как гликозилирование. Гликозилирование белков может проходить двумя путями. В первом случае N-ацетилглюкозамин связан с аспарагином (N-гликозилирование), во втором — N-ацетилгалактозамин или N-ацетилглюкозамин, фукоза или манноза образуют связь с серином или треонином (О-гли-козилирование). Пути гликозилирования отличаются друг от друга:
N-связанные олигосахариды формируются на липидной мембране до того, как произойдет их связывание с белком в эндоплазматическом ре-тикулуме, в то время как O-связанные олигосахариды надстраиваются на белок шаг за шагом благодаря гликозилтрансфе-разам аппарата Гольджи.
Типичные углеводные цепи гликопротеинов показаны на рис. 1 и 2.
Лучше изучена регуляция N-гликозилирова-ния. Известны аминокислотные последовательности, ответственные за этот процесс. Регуляция О-гликозилиро-вания, вероятно, зависит от комплексного взаимо-
±Mana1—► 2Mana1
/fanal
±Mana1-
■ 2Mana1
\a
Manß1
/г
(Mana1-> 2)o.2Mana 1
► 4GlcNAcß 1-^ 4GlcNAc—► Asr
А
±Mana
Mana
ч
(R-
± GlcNAcß1 Mana1
\ 4
Manß1-/
GlcNAc)b2Mana1
►4GlcNAcß1 ■
±Fuca1
I
6
4GlcNAc
►Asn
±GlcNAcß1
Manal
^ 4
(R—>GlcNAc)b5 { Manß1 —► 4GlcNAcß1 -
/
Mana1
±Fuca1
I
6
4GlcNAc
►Asn
В
Рис. 1. Главные типы N-связанных углеводных цепей гликопротеинов: А — высокоманнозный, Б — комплексный, В — гибридный
ОШАср1-3СаМАс-| (Соге 3)
ОШАср1-3СаШАс-^Р1-6 ОШАс (Соге 4)
■ ОаШАс- (Тп)__8Аа2-6СаШАс- (8Л-Тп)
1
Оа1р1-3СаШАс- (Соге 1) (ТЕ)
* 8Аа2-30а1р1-30аШАс- (8Л-ТЕ)
^Оа1р1-3ОаМАс- (8Л-ТЕ)
^а2-6 8А
*■ 8Аа2-30а1р1-30аШАс- (Ш8Л-ТЕ) ^а2-6
8А
* 8040а1р1-30аШАс- (804-ТЕ) *Тиса1-20а1р1-30аШАс- (Еис-ТЕ)
Оа1р1-3СаШАс- —►Оа1р1-3СаШАс-(Соге 2) ^р1-6 ^ р 1-6
ОШ^с ОаШАср1-3СШАс
0а1р1-30аШАс -----р. Оа1р1-3СаШАс-
|р1-6 |р1-6 Оа1р 1-4С1сКАс 8Аа2-3Са1р 1-4СШАс
0а1р1-30а1КАс-
|р1-6
Оа1р1-4СШАс-
а1-3
Бис
8Аа2-30а1р1-30аШАс-
|р1-6
Оа1р1-4в1сКАс
Рис. 2. Главные типы О-связанных углеводных цепей гликопротеинов
действия между аминокислотной последовательностью белка, который будет гли-козилирован, доступностью субстрата (нуклеотидных углеводов), концентрацией и местоположением гликозилтрансфераз аппарата Гольджи, ответственных за процесс гликозилирования. В некоторых случаях процесс усложняется дальнейшей модификацией с помощью гликозидаз.
Олигосахаридные цепи гликопротеинов, или гликаны, чрезвычайно разнообразны. Они отличаются по длине, моносахаридной последовательности, положению связи, конфигурации аномерного центра, разветвлению и замещению сульфатной или О-ацетильной группы в сиаловых кислотах. Это позволяет получить огромное разнообразие структур.
Гликаны теплокровных построены из семейства шести моносахаридов: манно-зы, галактозы, фукозы, М-ацетилглюкозамина, М-ацетилгалактозамина и нейрами-новой кислоты. В состав О-гликозидных цепей манноза не входит (за исключением некоторых минорных О-гликанов, найденных в нервной ткани). В зависимости от размера белка олигосахариды могут составлять до 70 % веса некоторых муцинов и маскировать антигенные детерминанты белкового кора.
Мапа1—►401сКЫ2-Р1
ность конформации белка. Присутствие сиаловых кислот, обычно М-ацетилнейраминовой, и (или) сульфатных остатков придает отрицательный за-
Мапа1
ряд молекуле гликопротеина. Таким образом, гликозилирование имеет огромное значение для био- Рис. 3. Структура кора гликозилфос-логической функции белков. Необходимо отме- фатидилин°зита тить, что важность этого процесса не может быть
полностью оценена до тех пор, пока не будут изучено О-гликозилирование, так же как и М-гликозилирование, и оценена их роль в функционировании клетки.
Гликозилированные липиды клеточной мембраны представлены двумя типами — сфингогликолипидами (СГЛ) и гликозилфосфатидилинозитами (ГФИ) (рис. 3). Олигосахариды в СГЛ связаны через глюкозу с церамидом. Во многих клетках СГЛ содержатся в высоких концентрациях в плазматической мембране. СГЛ формируют огромные кластеры на внешней поверхности липидного бислоя, которые располагаются независимо от кластеров трансмембранных гликопротеинов [11]. В нормальных клетках большое разнообразие антигенных структур, включая групповые вещества крови и антигены Льюиса, экспрессированы на СГЛ и на гликопротеинах. Сфингогликолипиды участвуют в процессах дифференци-ровки клеток, клеточной адгезии и трансмембранной передаче сигнала в клетке. Глобальные изменения в экспрессии их углеводных структур отмечаются при диф-ференцировке, эмбриогенезе и онкогенезе [12]. Олигосахариды ГФИ богаты ман-нозой, галактозой и глюкозамином. Они связаны через дисахаридный кор с фосфа-тидилинозитом [29]. Основная функция ГФИ заключается в удерживании белков, полисахаридов или небольших олигосахаридов в клеточной мембране, что позволяет стабилизировать эти молекулы в липидном бислое. Такие иммобилизованные в мембране белки являются ферментами, молекулами клеточной адгезии, они участвуют в создании гликокаликса клетки [18].
Далее мы расскажем о медицинских вопросах, для решения которых необходимо знание данных гликобиологии, и областях наших интересов в данной проблематике.
Межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия
Большинство белков клеточной поверхности гликозилированы, включая Е-кадгерин (посредник межклеточной адгезии в эпителиальной ткани) и рецептор СБ44 (посредник клеточно-матриксной адгезии). Обе эти молекулы могут значительно изменять свои функции при нарушении гликозилирования. Действие специфических гликозилтрансфераз, например 01сМАс-трансферазы типа III, приводит к увеличению количества Р(1^4)-связанного М-ацетилглюкозамина на М-гликанах Е-кадгерина и других гликопротеинах. Это уменьшает доступность субстрата для конкурирующих трансфераз (в1сМАс-трансферазы типа V) и, следовательно, уменьшает образование в1сМАс-Р(1^6)-антенн, которые формируют мультиантенные структуры на М-связанных олигосахаридах Е-кадгерина. Это усиливает адгезию между клетками опухоли и, как было показано, значительно снижает метастатический потенциал клеточной линии меланомы мыши [32]. Рецептор СБ44 принадлежит к семейству молекул адгезии, которые связывают гиа-луроновую кислоту межклеточного матрикса. Индукция экспрессии антигена Н
групповых веществ крови на СБ44 с помощью трансфекции раковых клеток с а-(1^2)-фукозилтрансферазным геном показала огромное увеличение метастатического потенциала клеток рака кишечника крысы [9].
Гликозилирование является важным процессом для функции интегринов. При ингибировании М-гликозилирования происходит диссоциация а- и р-субъединиц интегринов с последующей потерей функции связывания фибронектина [34].
Молекулы Е-кадгерина и интегрины являются посредниками взаимодействия между контактирующими клетками. Но начальное сродство между клетками, проявляющееся в их движении друг к другу, происходит благодаря углевод-связыва-ющим белкам — лектинам или селектинам. Они инициируют оседание циркулирующих клеток крови на эндотелиум. Были определены несколько семейств таких селектинов: Е (эндотелиальные), Ь (лейкоцитные) и Р (тромбоцитарные). Селекти-ны Ь и Е специфически связываются с сиалированными или сульфатированными антигенами Льюиса X (Ьех). Эта структура групповых веществ крови расположена на нескольких различных гликопротеинах клеточной мембраны, включающих в1уСАМ-1 (гликозилированная молекула клеточной адгезии 1), Р8вЬ-1 (Р-селек-тиновый лиганд гликопротеина 1) и трансмембранный муцин МиС1. Взаимодействие может быть конкурентно блокировано сульфатированными олигосахаридами, например гепаринами [19], или при помощи сульфатированных фуканов (фу-коиданов) [10]. Такие молекулы имеют значительный терапевтический потенциал как противовоспалительные вещества.
Онкопатологии
Существует обширная статистика, показывающая связь между нарушениями гликозилирования и развитием онкопатологии. Но, к сожалению, пока известно немного о биологических механизмах, приводящих к таким последствиям. С онкопатологией связаны в основном два типа нарушений гликозилирования белков: усечение коротких олигосахаридных структур, которые получаются даже более короткими, чем онкофетальные углеводные антигены, и модификация периферических структур — антигенов Льюиса и групповых веществ крови АВО. Одной наиболее хорошо изученной онкофетальной углеводной структурой является антиген Томсена-Фриденритча (ТБ) — галактозил-р-(1^3)-а-М-ацетилглюкозамин, который обычно экспрессируется на 0-гликанах эмбрионального эпителия, но его экспрессия подавляется в здоровых тканях у взрослых. Более простые структуры, связанные с онкопатологиями, такие как сиалилированный Тп антиген (М-ацетил-галактозаминил-а-1-0-серин/треонин), являются следствием снижения О-аце-тилирования остатков сиаловой кислоты. Другие изменения, связанные с развитием онкопроцессов, включают увеличение экспрессии ди- и трисиалилпроизвод-ных антигена Ьех, уменьшение сульфатирования муциновых олигосахаридов и значительное уменьшение длины олигосахаридных цепей. Изменение экспрессии групповых веществ крови зачастую приводит к развитию опухоли. Большинство этих модификаций, вероятно, происходят вследствие нарушения биосинтеза гли-козилтрансфераз. Например, в клетках линии аденокарциномы с повышенным ма-лигнизирущим потенциалом понижена экспрессия в1сМАс-трансферазы, ответственной за создание олигосахаридной структуры кора. Также в этих клетках было отмечено снижение активности галактозилсульфотрансферазы [30].
Некоторые нарушения гликозилирования, связанные с онкопатологиями, например изменение статуса сиалирования и фукозилирования антигенов Льюиса, явля-
ются общими как для гликопротеинов, так и для гликолипидов. Дополнительные изменения гликолипидов включают накопление ганглиозидных и глобозидных предшественников. Такие изменения затрагивают не только межклеточное взаимодействие, но и адгезию клеток к молекулам межклеточного матрикса, а также трансмембранную передачу сигнала через тирозинкиназные рецепторы или киназу С [12].
Нарушенное гликозилирование раковых клеток коррелирует с их малигнизиру-ющим потенциалом. Было предположено, что способность клеток колоректального рака к метастазированию в печень может быть следствием увеличения экспрессии олигосахаридов с терминальными остатками галактозы. Эти олигосахариды являются лигандами для асиалогликопротеиновых рецепторов гепатоцитов — га-лактоз-связывающих лектинов. Кроме того, при метастазировании клеток рака кишечника обнаружено увеличение сиалирования ТБ антигена и антигенов Льюиса по сравнению с начальными стадиями опухолевого процесса у одних и тех же пациентов [4]. Выявляемые нарушения гликозилирования, в частности увеличение экспрессии антигенов Льюиса, их сиалированных производных Ьеа и Ьех, онкофе-тальных антигенов и муцинов, — признаки неблагоприятного прогноза течения болезни. Некоторые из антигенов Льюиса, например частично сиалированные Ьеа и Ьех, могут функционировать как лиганды для селектинов и, таким образом, осуществлять взаимодействие между раковыми и другими клетками в процессах инвазии при метастазировании. Раковые клетки могут непосредственно экспрессировать лектины. Клетки млекопитающих содержат семейство галактоз-связываю-щих лектинов — галектинов, чьи природные лиганды и функции большей частью не известны. Экспрессия галектина-3 на поверхности клетки, который связывает раковоэмбриональный антиген и молекулы адгезии ЬАМР-1, обусловливает их малигнизирующий потенциал. Экспериментально показано, что обратная регуляция приводит к значительному снижению метастатического потенциала клеток колоректального рака [5]. Групповые вещества крови могут также взаимодействовать друг с другом. Взаимодействие Ьех-Ьех является определяющим фактором аутоагрегации клеток опухоли с последующей микроэмболией и метастазировани-ем [16]. Антигены Ьеу, экспрессируемые раковыми клетками, могут также взаимодействовать с фукозными детерминантами групповых веществ крови Ы на клетках эндотелия. Эти антигены участвуют в первичных этапах метастазирования клеток опухоли. Муцины являются относительно сильными ингибиторами межклеточного взаимодействия. Хотя есть предположение, что это в большей степени зависит от белкового кора муцинов, чем от их олигосахаридных компонентов [2].
Частичное нарушение гликозилирования может быть обнаружено еще в предраковых изменениях, таких как метаплазия и дисплазия. Например, в этом случае отмечается нарушение гликозилирования клеток слизистой оболочки кишечника, возможным функциональным следствием которого является привлечение к слизистой поверхности пищевых или микробных лектинов. В поддержку этой концепции говорит факт увеличения более чем на 40 % пролиферации в ректальной слизистой оболочке у пациентов с экспрессией ТБ антигена после недельной арахисовой диеты, богатой ТБ-связывающими лектинами [28]. ТБ-связывающие лектины съедобных грибов ингибируют пролиферацию раковых клеток, не вызывая их гибели [33].
Структурно-функциональные взаимоотношения нарушений гликозилирова-ния, приводящих к онкопатологиям, имеют потенциальное значение для терапии последних. Множество раковых клеток имеют на клеточной поверхности олигосахариды с терминальными остатками галактозы. Такие олигосахариды включены в адгезию метастатических клеток или в привлечение митогенных лектинов. В свя-
зи с этим было предположено, что галактоз-содержащие полисахариды могут иметь терапевтическое или защитное действие. Так, при добавлении в пищевой рацион пектина цитрусовых, со значительным количеством терминальных остатков галактозы, было обнаружено уменьшение образования метастазов в модели рака простаты мышей [24] и постулировано, что овощные волокна, обогащенные галактозой, имеют защитное действие против рака толстой кишки [28].
Болезни слизистой оболочки
Свойства слизи, защищающей поверхность оболочки кишечника и бронхов от микробного воздействия, определяются в большой степени гликопротеинами слизи, или муцинами. Это очень большие белки с молекулярными массами до 20 МДа в гликозилированной форме. Более 80 % массы муцинов составляют O-связанные олигосахаридные цепи. Они защищают белковый кор от действия протеаз, хотя некоторые муцины расщепляются протеазами на низкомолекулярные фрагменты. За исключением нескольких эндогликаназ, которые могут расщеплять дисахарид кора гликанов, бактериальные ферменты способны только к последовательному отщеплению олигосахаридов в периферических областях. Во многих муцинах терминальные остатки сиаловой кислоты зачастую О-ацетилированы, что делает их устойчивыми к действию сиалидаз, если в среде не присутствует О-аце-тилаза. Сульфатирование олигосахаридов является традиционным в местах скопления большого количества бактерий, например в толстой кишке. В этом случае такие модифицированные гликаны устойчивы к действию гликозидаз (в отсутствии соответствующих сульфатаз).
При язвенных колитах слизистый слой истончается, и существует пока не подтвержденная гипотеза, что это связано с генетическими дефектами синтеза или секреции муцинов [6, 27]. Это инициировало исследование слизи и нарушений гликозилирования слизистых компонентов при колитах и других воспалительных процессах в кишечнике, например болезни Крона. Нарушения гликози-лирования отмечены при обоих заболеваниях и схожи с изменениями при колоректальном раке, а в некоторых случаях идентичны им. Так, олигосахаридные цепи муцинов при колоректальных онкопатологиях укорочены почти наполовину по сравнению с их обычной длиной у здоровых доноров. Кроме того, в них снижена степень О-ацетилирования сиаловых кислот на 50 %, увеличена экспрессия TF и сиалил-Tn антигенов, понижен уровень сульфатирования. Некоторые из этих изменений могут быть тесно связаны: уменьшение сиалирования или сульфатирования, например, может сопровождаться увеличенной экспрессией TF антигена, или увеличенная экспрессия сиалил-Tn антигена, вероятно, является результатом пониженного О-ацетилирования остатков сиаловой кислоты. Даже если большинство или все эти нарушения гликозилирования являются скорее вторичными по отношению к заболеванию, они неизбежны и будут иметь важные функциональные последствия. Уменьшение длины олигосахаридной цепи муцинов, уменьшение количества О-ацетилирования сиаловых кислот и степени сульфатирования будут увеличивать восприимчивость муцинов к действию бактериальных ферментов. В большинстве случаев нарушение гликозилирова-ния муцинов совмещено со схожими изменениями в гликозилировании гликопротеинов клеточной поверхности эпителиальных клеток. Это показывает, что одни и те же гликозилтрансферазы вовлечены в гликозилирование различных белков. Последующее увеличение экспрессии онкофетальных углеводных антигенов гликопротеинами поверхности клетки, возможно, приводит к изменениям флоры
слизистой. Например, она пополняется бактериями с лектинами, которые специфичны к TF антигену или к сиалил-Tn антигену. Интересно, что патогенная амеба Entamoeba histolytica обладает TF-связывающим лектином, который используется ею для адгезии к клеткам человека. Поэтому можно предположить, что пациенты с воспалительным заболеванием кишечника и с увеличенной экспрессией компонентами слизистой TF антигена склонны к развитию амебной дизентерии в эндемических регионах. Некоторые изменения гликозилирования могут привести к предраковым состояниям, а хронические воспалительные процессы в кишечнике — почти к десятикратному увеличению риска заболевания колоректальным раком. Экспрессия сиалил-Tn антигена, выявляемая моноклональными антителами TKH2, была предложена как маркер для выявления пациентов группы риска с хроническими колитами [14].
Кистозный фиброз (КФ) связан с увеличением сульфатирования муцинов. Исследование слизистой оболочки мыши с КФ показало увеличение степени глико-зилирования и сульфатирования компонентов слизи. Механизм этих изменений до конца не изучен. Одна из гипотез предполагает, что дефект переноса хлорид-иона при кистозном фиброзе приводит к изменениям в pH-градиенте аппарата Гольджи с последующим воздействием на функции гликозилтрансфераз и сульфотрансфе-раз. У пациентов с хроническим бронхитом, как и у пациентов с КФ, увеличивается степень сульфатирования и сиалирования муцинов бронхов, связанная с увеличением экспрессии а(2^3)-сиалилтрансферазы [7].
Взаимодействия патоген-хозяин
Лектин-углеводные взаимодействия используются патогенными микроорганизмами для адгезии к гликоконъюгатам слизистой оболочки. Некоторые из углеводных структур являются гликолипид-специфичными, например дисахаридная конструкция Gal-a(1^4)-Gal является рецептором для уропатогенной бактерии Escherichia coli. Хотя углеводная специфичность клеточных рецепторов большинства изученных патогенов хорошо известна, мало внимания уделялось роли наследственных или приобретенных нарушений в гликозилировании компонентов слизи в восприимчивости клеток хозяина к таким патогенам. Устойчивая связь была отмечена между секреторным статусом, кодируемым гликозилтрансферазным геном, и восприимчивостью к гриппу, респираторному синцитиальному вирусу, риновирусу и эховирусу. Известно, что адгезия клеток Candida sp. и Neisseria meningitidis усиливается к несекретируемым компонентам клеточной мембраны [25]. Механизмы этих взаимодействий не установлены, хотя было показано, что патогенность вируса гриппа коррелирует с его продукцией нейраминидазы. Вирус использует этот фермент для отщепления остатков нейраминовой кислоты сиалогликопротеинов слизи, что является предпосылкой к проникновению в клетку хозяина [31].
Во многих случаях специфичность микробных лектинов к углеводным лигандам хозяина определяет инвазию микробных патогенов. Например, клетки E. coli K-99 связываются с остатками N-гликолилнейраминовой кислоты мукозных секретов свиньи. Люди с дефицитом гидроксилазы, превращающей N-ацетилнейраминовую кислоту в N-гликолилнейраминовую, не восприимчивы к этому микроорганизму. Углевод-опосредованная адгезия патогенов была использована для разработки новых профилактических и терапевтических приемов. Например, диарею у телят, вызываемую E. coli K-99, можно предотвратить добавлением в питьевую воду гликопептидов, которые идентичны экспрессируемым клетками E. œli. Патогенность и инвазивность вируса иммунодефицита человека или бактерии Vibrio cholerae также зависят от начального связывания с гликолипидами клеточной поверхности хозяина.
Таким образом, существует огромный потенциал для развития будущих исследований синтетических гликоконъюгатов в качестве ингибиторов адгезии патогенов при разработке профилактики и терапии инфекционных заболеваний.
Нарушение гликозилирования циркулирующих гликопротеинов
Возможно, все циркулирующие белки, за исключением альбумина, гли-козилированы. Известно, что утрата сиалирования циркулирующими гликопротеинами приводит к увеличению доступности остатков галактозы. В результате эти гликопротеины удаляются из циркуляции при помощи асиалогликопротеиновых рецепторов гепатоцитов, которые являются непосредственно галактоз-связываю-щими лектинами. Свидетельством функциональной значимости этого гликозили-рования являются наследственные углевод-дефицитные гликопротеиновые синдромы (УДГС). Были описаны четыре различных синдрома. УДГС первого типа изучен более чем у 100 пациентов. Мутации были определены в двух фосфоман-номутазных генах 22q13 и 16p13 [17]. Фибробласты и лейкоциты таких пациентов лишены фосфоманномутазы — фермента, ответственного за превращение манно-зо-6-фосфата в маннозо-1-фосфат, необходимой в синтезе ГДФ-маннозы. При этом отмечается значительный дефект в N-гликозилировании. Он связан с уменьшением экспрессии N-концевых сиалоолигосахаридов и может быть определен по изменению подвижности сывороточных гликопротеинов при изоэлектрофокусировании. Вероятно, существуют также дефекты синтеза ГДФ-фукозы, которые затрагивают процесс О-гликозилирования. Эти дефекты имеют аутосомно-рецессив-ное наследование и приводят к неврологическим нарушениям с атаксией, задержкой в развитии, прогрессирующей мышечной атрофией, различными дисфункциями печени, патологией свертываемости крови и анатомическими изменениям. Был описан похожий синдром, который возникал при нарушении синтеза долихола [23]. Выявлены также наследственные дефекты, приводящие к классической га-лактозамии, которая определяется дефицитом УДФ-галактозы. При УДГС типа IB вследствие точечной мутации полностью отсутствует активность фосфоманноизо-меразы. Клиническая картина в этом случае отличается от УДГС типа IA выявляемыми нарушениями утилизации белков и кишечными кровотечениями. Терапия орально применяемой маннозой была эффективной при УДГС типа IB, но не приводит к положительным результатам при лечении УДГС типа 1А. УДГС типа II возникает вследствие дефицита N-ацетилглюкозаминтрансферазы II, необходимой для синтеза биантенных N-гликанов. Пациенты с таким синдромом имеют задержку в развитии и гипотонию. УДГС типа III и IV связаны с неврологическими аномалиями и характеризуются присутствием изоформ трансферрина с различной изоэлектрической подвижностью. Вероятно, список типов УГДС будет значительно расширен благодаря дополнительным исследованиям.
Основные направления, развиваемые в лаборатории химии неинфекционного иммунитета в области гликобиологии
Традиционно в нашей лаборатории исследуется структура онкофеталь-ных антигенов и белков острой фазы как маркеров опкопатологий и различных воспалительных процессов, а также разрабатываются иммунохимические тест-системы для их определения в биологических жидкостях. Тест-система для определения трофобласт-специфического бета-1-гликопротеина (ТБГ) в сыворотке кро-
ви универсальна и пригодна для определения сроков беременности и ее патологии. На основе наших реактивов НПО «Вектор-Бест» (Новосибирск) с 1999 г. выпускает эти наборы и распространяет в клиниках по всей России. Разработанная новая тест-система для определение уровня ТБГ и нарушений его гликозилирования на основе GalNAc/GlcNAc-специфичного лектина, выделенного нами из асцидии Didemnum tematanum, позволяет проводить дифференциальную диагностику злокачественного процесса (пузырного заноса и хорионэпителиомы) и нормально протекающей беременности, а также вести контроль за эффективностью лечения трофобластических онкологических заболеваний.
Лектины (углевод-связывающие белки) являются универсальным инструментом в исследовании структуры углеводных цепей и выявлении нарушений их гликозилирования при различных патологиях. В лаборатории постоянно проводится скрининг новых лектинов среди гидробионтов Мирового океана. Описано и охарактеризовано более десятка лектинов с различной специфичностью. Некоторые лектины проявляют перспективные биологические свойства в усилении адгезии клеток, модуляции их роста и морфологии, открывающие перспективы их использования в биотехнологии [3, 15, 21, 22]. Выделены и такие лектины, которые обладают высокой антивирусной активностью, они способны блокировать прикрепление вируса иммунодефицита человека и его репликацию в экспериментах in vitro в диапазоне концентраций 6—40 нг/мл [1]. Кроме того, изучение особенностей взаимодействия лектинов с природными мультивалентными гликоконъюгатами позволяет понять механизм функционирования лектинов человека в норме и патологии [8, 13, 15, 20, 26].
ЛИТЕРАТУРА
1. Ли Вэй. Маннан-связывающие лектины из морского червя Serpula vermicularis и GlcNAc/GalNAc специфический лектин из колониальной асцидии Didemnum ternatanum: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. Владивосток, 2004. 24 с.
2. Agrawal B., Krantz M.J., Redish M.A., Longenecker B.M. Cancer-associated MUC1 mucin inhibits human T-cell proliferation, which is reversible by IL-2 // Nature Medicine. 1998. Vol. 4, N 1. P. 43—49.
3. Belogortseva N., Molchanova V., Glazunov V, Evtushenko E., Lukyanov P. N-Acetyl-D-glu-cosamine-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1380, N 2. P. 249—256.
4. Bresalier R.S., Ho S.B., Schoepner H.L. Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasis // Gastroenterology. 1996. Vol. 110, N 3. P 1354—1367.
5. Bresalier R.S., Mazurek N., Sternber L.R. Metastasis of human colon cancer is altered by modifying expression of the beta-galactoside-binding galectin-3 // Gastroenterology. 1998. Vol. 115, N 1. P 287—296.
6. Corfield A.P, Myersough N., Gough M., Brockhausen I., Schauer R., Paraskeva C. Glycosylation patterns of mucins in colonic diseases // Biochem. Soc. Trans. 1995. Vol. 23. P. 840—845.
7. Davril M., Degroote S., Humbert P. The sialylation of bronchial mucins secreted by patients suffering from cystic fibrosis or from chronic bronchitis is related to the severity of airway infection // Glycobiology. 1997. Vol. 9, N 1. P 311—321.
8. Furtak V., Hatcher F., Ochieng J. Galectin-3 mediates the endocytosis of beta-1 integrins by breast carcinoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. Vol. 289, N 4. P. 845—850.
9. Goupille C., Halloin F., Meflak K., Le Pendu J. Increase of rat colon carcinoma cell tumorigenicity by alpha (1-2) fucosyltransferase gene transfection // Glycobiology. 1997. Vol. 7, N 4. P. 221—229.
10. Granert C., Raud J., Xie X., Lindquist L., Lindbom L. Inhibition of leukocyte rolling with polysaccharide fucoidin prevents pleocytosis in experimental meningitis in the rabbit // J. Clin. Invest. 1994. Vol. 93, N 7. P. 929—936.
11. Hakomori S.I. Structure and function of sphingoglycolipids in transmembrane signaling and cell-cell interaction // Biochem. Soc. Trans. 1993. Vol. 21. P. 583—595.
12. Hakomori S. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingoglycolipid metabolism // Cancer Res. 1996. Vol. 56, N 3. P. 5309—5318.
13. Kang S.-G., Choi K.-S., Bulgakov A.A., Kim Y., Kim S.—Y. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) used in quantification of reproductive output in the pacific oyester, Crassostrea gigas, in Korea // J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 2003. Vol. 282. P. 1—21.
14. Karlen P, Young E., Brostorm O. Sialyl-Tn antigen as a marker of colon cancer risk in ulcerative colitis: relation to dysplasia and DNA aneuploidy // Gatroenterology. 1998. Vol. 155, N 4. P. 1395—1404.
15. Kobelev S., Molchanova V., Belogortseva N., Luk’yanov P. Interaction of a lectin from the mussel Crenomytilus grayanus with polyvalent neoglycoconjugates // Abstr. GLYCO XVI Symp. Hague, 2001. P. 100.
16. Kojima N., Fenderson B.A., Stroud M.R. Further studies on cell adhesion based on Lex-Lex interaction with new approaches: embryoglycan aggregation of F9 teratocarcinoma cell, and adhesion of various tumor cells based on Lex expression // Glycoconj. J. 1994. Vol. 11, N 7. P. 238—248.
17. Matthijs G., Schollen E., Pardon E. Mutations in PMMM2, a phosphomannomutase gene on chromosome 16p13, in carbohydrate-deficient glycoprotein type I syndrome // Nature Genetics. 1997. Vol. 16, N 2. P. 88—92.
18. McConville J., Ferguson M.A. The structure, biosynthesis, and function of glycosylated phospha-tidilinositols in the parasitic protozoa and higher eukaryotes // Biochem. J. 1993. Vol. 294, N 3. P. 305—324.
19. Nelson R.M., Cecconi O., Roberts W.G., Aruffo A., Linhardt R.J., Revilacqua M.P Heparin oligosaccharides bind L- and P-selectins and inhibit acute inflammation // Blood. 1993. Vol. 82, N 3. P. 3253—3258.
20. Ochieng J., Furtak V., Lukyanov P. Extracellular functions of galectin-3 // Glycoconj. J. 2002. Vol. 19, N 7—9. P. 527—535.
21. Odintsova N.A., Belogortseva N.I., Ermak A.V., Molchanova V.I., Lukyanov P.A. Adhesive and growth properties of lectin from ascidian Didemnum ternatanum on cultivated marine invertebrate cells // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1380, N 2. P. 240—256.
22. Odintsova N.A., Belogortseva N.I., Khomenko A.V, Chikalovets I.V, Lukyanov P.A. Effect of lectin from the ascidian on the growth and the adhesion of HeLa cells // Mol. Cell Biol. 2001. Vol. 221. P. 133—138.
23. Ohkura T., Fukushima K., Kurisaki A. A partial deficiency of dehydrodolichol is cause of carbohydrate-deficient glycoprotein syndrome type 1 // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272, N 11. P. 6868—6875.
24. Pienta K.J., Naik H., Akhtar A. Inhibition of spontaneous metastasis in a rat prostate cancer model by oral administration of modified citrus pectin // J. Nat. Cancer Inst. 1995. Vol. 87, N 2. P. 348—353.
25. Raza M.V., Blackwell C.C., Molyneux P. Association between secretor status and respiratory viral illness // Brit. Med. J. 1991. Vol. 303, N 17. P. 815—818.
26. Ray S., Lukyanov P., Ochieng J. Members of the cystatin superfamily interact with MMP-9 and protect it from autolytic degradation without affecting its gelatinolytic activities // Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1652, N 2. P 91—102.
27. Rhodes J.M. Unifying hypothesis for inflammatory bowel disease and related colon cancer: sticking the pieces together with sugar // Lancet. 1996. Vol. 343, N 3. P 40—44.
28. Ryder S.D., Jacuna M.R., Levi A.J., Rizzi PM., Rhodes J.M. Eating peanuts increases rectal proliferation in individuals with mucosal expression of peanut lectin receptors // Gastroenterology. 1998. Vol. 114, N 2. P. 44—49.
29. Thomas R.J., Dwek R.A., Rademacher T.W. Structure, biosynthesis and function of glycosylphos-phatidylinositols // Biochem. 1990. Vol. 29, N 1. P. 5413—5422.
30. Vavasseur F., Dole K., Yang J. O-glycan biosynthesis inhuman colorectal adenoma cells during progression to cancer // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 222, N 12. P. 415—424.
31. Von Itzstein M., Wu W.Y., Kok G.B. Rational design of potent sialidase-based inhibitors of influenza virus replication // Nature. 1993. Vol. 363, N 2. P 418—423.
32. Yoshimura M., Ihara Y., Matsuzawa Y., Taniguchi N. Aberrant glycosylation of E-cadherin enhances cell-cell binding to suppress metastasis // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, N 13. P. 13811—13815.
33. Yu L.G., Fernig D.G., White M.R.H. Edible mushroom (Agaricus bisporus) lectin, which reversibly inhibits epithelial cell proliferation, blocks NLS-depend nuclear protein import // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 274, N 5. P. 4890—4899.
34. Zheng M., Fang H., Hakomori S. Functional role of N-glycosylation in a5p1 integrin receptor: de-N-glycosylation induces dissociation or altered association of a5 and p 1 subunits and concomitant loss of fibronectin binding activity // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, N 27. P 12325—12331.
