CC BY
10
лечению и регенерации ран. Особого внимания заслуживают бесклеточные матриксы (ECM), получаемые из различных тканей человека и животных путем децеллюляри-зации. Каждый тип ткани имеет свой уникальный состав ECM, представленный гликопротеинами, протеогликанами и гликозаминогликанами, важными для пролиферации и синтетической активности соединительнотканных клеток, модулирующими ангиогенез и способствующими заживлению ран. Вартонов студень пуповины человека (WJ) представляет собой твердую слизистую соединительную ткань внеэмбрионального происхождения. Фенотип тканей пуповины аналогичен эмбриональным тканям, у которых выявлена способность к безрубцовому заживлению ран. Это делает пуповину человека особенно привлекательным биоматериалом для регенеративной медицины [1].
В настоящем исследовании децеллюляризацию WJ проводили детергентным способом с использованием 0,05% раствора додецилсульфата натрия (SDS) по ранее описанному протоколу [2]. Эффективность удаления клеток и нуклеиновых фрагментов оценивали с помощью гистологического окрашивания флуоресцентным красителем 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и количественного определения ДНК. Сохранность структурного состава подтверждали с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR).
Гистологические исследования выявили отсутствие ядер клеток в децеллюляризованном WJ (dWJ). Среднее содержание ДНК в WJ составило 468,75 (453,65-475,15) нг/мкл, в dWJ - 29,2 (27,8-30,7) нг/мкл (p<0,001).
FTIR-спектры dWJ показали отсутствие фосфолипид-ного плеча, свидетельствующее о качественности децел-люляризации и, вместе с минимальным содержанием ДНК, — о потенциальной неиммуногенности изготовленного продукта. FTIR-спектры WJ и dWJ продемонстрировали аналогичные характеристические полосы поглощения, соответствующие функциональным группам коллагенов, протеогликанов и гликозаминогликанов.
Таким образом, изготовленный из высокорегенеративного биоматериала гомологичного происхождения бесклеточный продукт является потенциально неиммунноген-ным, сохраняет основные структурные и функциональные компоненты, присущие нативной пуповине и важные для процессов регенерации глубоких повреждений кожи.
Литература:
1. Kocl Z., Vyborny K., Dubisova J. et al. Tissue Eng. Pant C Methods. 2017. V. 23, № 6. P/ 333.
2. Калюжная Л.И., Чернов В.Е., Фрумкина А.С. и др. Вестн. Росс. воен.-мед. акад. 2020. Т. 22. № 1. C. 124.
ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ ЛИЗАТА ТРОМБОЦИТОВ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОЧНОГО КАНАТИКА ЧЕЛОВЕКА
Л.Н. Токтохоева1, Е.С. Дёмина1, Н.П. Рабданова1, Р.Ю. Абашеев1, А.С. Долодоев1, 2, А.П. Цыбденова1 2, Ю.С. Балханов2, А.А. Нимаева3, М.Ф. Серых3
1 Бурятский государственный университет им. Доржи Банзарова, Улан-Удэ, Россия
2 ООО «МИП «Байкальский центр биотехнологий»
3 ООО «Шэнэскин», Улан-Удэ, Россия
e-mail: lyubov2316@mail.ru
Ключевые слова: ксеногенная сыворотка, лизат тромбоцитов, мезенхимальные стволовые клетки пупочного канатика.
Применение лизата тромбоцитов в связи с поиском оптимального состава сред для культивирования клеток, не содержащих ксеногенных компонентов и предназначенных для клинических и лабораторных протоколов, представляется актуальным [1]. Целью работы являлось определение влияния лизата тромбоцитов на морфофи-зиологические особенности стволовых клеток пупочного канатика человека in vitro.
Выделение мезенхимальных стволовых клеток осуществляли из вартонова студня пупочного канатика человека ферментативным способом с помощью коллагеназы I типа и эксплантами. Ведение мезенхимальных стволовых клеток проводили в среде DMEM/ F12 c эмбриональной телячьей сывороткой и лизата-ми тромбоцитов человека. Криодеструкцию тромбоцитов из пулированных лейкоредуцированных концентратов осуществляли при -200С не менее 48 часов. Размороженные и ресуспендированные образцы лизата тромбоцитов центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 15 минут и привносили в бессывороточную среду.
Показана пролиферативная активность и дифферен-цировочный отклик мезенхимальных стволовых клеток пупочного канатика человека при добавлении 10% лизата тромбоцитов в среду культивирования. Установлено, что внесение тромболизата в специализированную питательную среду для культивирования стволовых обеспечивает получение качественного клеточного трансплантата в те же сроки, что и при культивировании с эмбриональной телячьей сывороткой. Полученные данные позволяют рекомендовать использование лизата тромбоцитов в качестве альтернативы ксеногенной сыворотки.
Литература:
1. Сергеева Н.С., Шанский Я.Д., Свиридова И.К., Кирсанова В.А., Ахмедова С.А., Кувшинова Е.А., Мейснер И.С. Гены и клетки. - 2014. - Том IX. - № 1. - С. 77-85.
МАТРИКСЫ НА ОСНОВЕ СОПОЛИМЕРОВ
ХИТОЗАНА С ОЛИГОЛАКТИДАМИ:
ПОЛУЧЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ В МОДЕЛИ IN VITRO
Т.В. Толстова1, М.Г. Дроздова1, Т.Н. Попырина2,
Т.С. Демина2, Т.А. Акопова2, Е.А. Марквичева1
1 ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина
и ЮА. Овчинникова РАН, Москва, Россия
2 ФГБУН Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН, Москва, Россия
e-mail: balabanovatv88@gmail.com
Ключевые слова: хитозан, биоматериалы, тканевая инженерия, мезенхимальные стромальные клетки.
Природные полимер хитозан (Chit) используют как биоматериал для получения матриксов благодаря его биосовместимости и способности к биодеградации. Однако, Chit матриксы обладают низкой механической прочностью, а скорость их биодеградации недостаточно высокая. Создание композитных матриксов на основе Chit позволяет преодолеть эти недостатки, а также регулировать скорость их биодеградации и гидрофильно-гидрофобный баланс. Эти параметры определяют направленность дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток (МСК), которые обладают большим потенциалом в тканевой инженерии. Цель работы — получение плёнок (2D) и макропористых гидрогелей (3D) на основе
сополимеров хитозана, изучение их физико-химических свойств и культивирование на/в них различных типов клеток в модели in vitro. Сополимеры Chit (ММ 60 кДа, СД 0.9) с олиго(1_,1_- и /LD-лактидами с ММ 5 кДа (Chit-L,L и Chit-L,D, соответственно) получали методом твердофазного синтеза. Показано, что структура матриксов представляла собой систему взаимосвязанных макропор со средним размером пор в диапазоне 50-250мкм (конфокальная лазерная микроскопия). Отсутствие цитотоксичности подтвердили путем культивирования клеток мышиных фи-бробластов L929 в экстрактах, полученных после инкубации гидрогелей в среде DMEM (10% FBS) — МТТ-тест. Культивирование клеток острого моноцитарного лейкоза человека (THP-1) в гидрогелях не приводило к их активации (ИФА на TNF-a и IL-6). Показано, что «химия и топография поверхности» гидрогелей обеспечивала адгезию клеток L929 и МСК (конфокальная микроскопия), рост и пролиферацию в течение 7-14 дней (МТТ-тест). Для изучения диф-ференцировки МСК использовали 2D пленки. Определяли активность щелочной фосфатазы, а также уровни экспрессии генов-маркёров Runx2, ALPL, SPP1 (пЦр в режиме реального времени). Окрашивание везикул, содержащих три-глицериды, и активность ADIPOQ, PPAR/(n^) применяли для доказательства адипогенеза. Показано, что все сопо-лимерные плёнки поддерживали пролиферацию и диффе-ренцировку МСК, при этом Chit-L,D усиливали их остеоген-ный, а Chit-L,L — адипогенный потенциал. Таким образом, полученные матриксы являются перспективными биоматериалами для регенеративной медицины. Это исследование частично финансировано Российским научным фондом (номер гранта 22-13-00261).
РЕКОНСТРУКЦИЯ СТРУКТУРЫ ФИБРОТИЧЕСКОГО ФОКУСА КАК МОДЕЛИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ФИБРОЗА IN VITRO
А.Е. Толстолужинская2, Н.А. Басалова1, E.C. Новоселецкая1, М.Н. Карагяур1 2, Р.Ю. Еремичев1, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: a.luzh@yandex.ru
Ключевые слова: фиброз, фибротический фокус, сфероид, внеклеточный матрикс, децеллюляризация, миофибробласты.
Фибротический фокус является основной морфо-функциональной единицей при развитии фиброза различных тканей, в том числе фиброза лёгких. Такой фокус состоит из ядра неправильно уложенных специфических белков внеклеточного матрикса (ВКМ), синтезируемых миофибробластами и их предшественниками, расположенными на периферии ядра. Поскольку фибротический фокус является одним из ключевых объектов для изучения механизмов регуляции и прогрессирования фиброза, необходима разработка релевантной модели данной морфофункциональной структуры. Поэтому основная цель данной работы заключалась в реконструкции фи-бротического фокуса in vitro.
Для получения ядра фибротического фокуса собирали сфероиды, образованные миофибробластами, на различных культуральных средах. Полученные сфероиды подвергали децеллюляризации (Новоселецкая, 2020).
Структуру сфероидов и децеллюляризованных сфероидов (децелл-сфероид) оценивали с помощью конфокальной микроскопии и дот-блоттинга. Децелл-сфероиды рецеллюляризировали миофибробластами и на полученной модели «фибротического фокуса in vitro» оценивали их функциональную активность.
Было показано, что культуральная среда, содержащая эмбриональную бычью сыворотку, аскорбиновую кислоту и трансформирующий фактор роста бета (TGFb) способствует сборке сфероидов и отложению специфических компонентов фибротического ВКМ, включая коллаген I типа и EDA-фибронектин. Децелл-сфероиды нетоксичны и могут быть рецеллюляризованы с помощью фибробла-стов. Фибробласты в составе децелл-сфероидов могут дифференцироваться в миофибробласты под влиянием TGFb. Миофибробласты были способны дедифференциро-ваться в фибробласты и разрушать ВКМ децелл-сфероида после обработки внеклеточными везикулами мезенхимных стромальных клеток (МСК), обладающими установленными антифибротическими свойствами (Басалова, 2020).
Таким образом, нами разработана модель, воспроизводящая клеточный состав и микроокружение, характерные для фибротического фокуса. Мы показали, что миофибробласты в составе фибротического фокуса под воздействием внеклеточных везикул способны разрушать ядро фокуса, что может быть одним из возможных механизмов антифибротического действия МСК. Данная система может быть использована в качестве модельного 3D объекта для изучения in vitro динамики формирования и деградации фибротического фокуса (грант РФФИ № 20-315-90120 и 21-315-70002).
Литература:
1. Novoseletskaya E., Grigorieva O., Nimiritsky P et al. Front. Cell
Dev. Biol. 2020. V. 8. № 9. P. 1-25.
D-АСПАРАГИН УЛУЧШАЕТ ПРИЖИВЛЕНИЕ
БИОПОЛИМЕРНОГО СКАФФОЛДА КОЖИ
ПОСЛЕ РАННЕЙ НЕКРЭКТОМИИ
А.И. Трофименко, А.Х. Каде
Кубанский государственный медицинский
университет, Краснодар, Россия
e-mail: artemtrofimenko@mail.ru
Ключевые слова: желатин, альгинат натрия, скаффолд,
кожа.
Разработка биодеградируемых скаффолдов является перспективным подходом к решению проблемы дефицита донорского материала у пациентов с обширными ожогами кожи.
Цель — изучить влияние D-аспарагина на приживление биополимерного скаффолда для замещения дефектов кожи после некрэктомии ожоговых ран в эксперименте у крыс.
В исследовании на 20 крысах-самцах, после моделирования ожога кожи III ст. [1], проводили раннюю некрэктомию с одномоментной имплантацией скаффолда на основе альгината натрия, желатина тип А и винилтриэтоксисилана [2], в группе 1 без и в группе 2 с D-аспарагином.
Окраску микропрепаратов кожи (30-е сутки) выполняли по протоколу для гематоксилин-эозина, а также по Маллори. Для фрактального анализа фибриллярной структуры внеклеточного матрикса применяли плагин FracLac 2.5 (NIH, США) для «Image J 1.51j8». При
