CC BY
17
и ИК-Фурье спектроскопии. Для получения гидрогелей стерильный хитозан растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и добавляли водный раствор р-глицерофосфата при температуре 4°С. Высокопористые (пористость 98%) частицы полилактида получали распылением замороженных эмульсий полимера с применением сублимационной сушки. Массовая доля полилактид-ных гранул составляла 1-20 %. BMP-2 импрегниро-вали в PLA-гранулы в концентрациях 10 и 50 мкг/ мл. Оценку цитотоксичности проводили на мульти-потентных стромальных клетках (ММСК) человека с помощью МТТ-теста. Адгезию и выживаемость клеток на поверхности композиций материалов оценивали с помощью витального окрашивания PKH26, DAPI и кальцеином. Прочностные характеристики были исследованы на электромеханической системе «Instron-5965» (Instron, США). Биосовместимость и способность индуцировать экто- и ортотопический остеогенез исследовали на моделях подкожной имплантации и критического дефекта теменных костей у крыс линии Wistar. Для этого через 14 и 28 дней имплантированный материал подвергали гистологической обработке с последующей морфометрией.
Результаты и обсуждение. Снижение степени деа-цетилирования хитозана (DD%) в составе гидрогеля с p-глицерофосфатом приводило к увеличению относительной выживаемости клеток ММСК in vitro и снижению лейкоцитарной инфильтрации при подкожной имплантации крысам in vivo. Включение 12 масс.% полилактидных гранул оказалось оптимальным с точки зрения моделируемости композиции и приводило к возрастанию модуля упругости материала в ~ 100 раз, по сравнению с хитозановым гидрогелем без наполнителя. Избыточное наполнение PLA-гранулам более 15% приводило к разрушению материала при деформации ~ 10%. Остеоиндуктивные и остеокон-дуктивные способности материала на основе хитоза-нового гидрогеля из реацетилированного хитозана (39 DD%) и высокопористых PLA-гранул, импрегни-рованных BMP-2, были продемонстрированы на моделях орто- и эктопического остеогенеза. Так, при имплантации композиции внутрь критического дефекта теменных костей крыс оказалось, что концентрация BMP-2 10 мкг/мл обладала оптимальными свойствами: костная ткань в виде островков заполняла толщу всего материала. В тех же условиях при имплантации материала с 50 мкг/мл BMP-2 происходило избыточное разрастание костной ткани и выталкивание материала за пределы дефекта. Достаточные остеоиндук-тивные свойства материала с 10 мкг/мл BMP-2 были также показаны при подкожной имплантации, то есть в условиях без костного окружения.
Заключение. Разработанная матрица костно-пла-стического материала на основе реацетилированного хитозана, p-глицерофосфата и высокопористых поли-лактидных гранул с BMP-2 может быть использована для получения способных к моделированию и биорезорбции биосовместимых остеопластических материалов, которые обладают выраженными остеоиндуктивными и осте-окондуктивными свойствами.
СФЕРОИДЫ НА ОСНОВЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И.В. Вахрушев1, Г.Е. Леонов1, А.В. Цветкова1, В.Д. Новикова1, Л.А. Кирсанова2, П.А. Каралкин1, С.А. Родионов3, Н.С. Сергеева3, Ю.Б. Басок2, К.Н. Ярыгин1
1 ФГБНУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова, Москва, Россия
3 МНИОИ им. ПА. Герцена - филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: клеточные сфероиды, мезенхимальные стромальные клетки, in vitro модели, хондрогенная диффе-ренцировка, ангиогенез.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) широко применяют в тканевой инженерии благодаря их доступности, возможности дифферен-цировки в различных направлениях и иммуномодули-рующим свойствам. Однако наиболее полным образом эти важные особенности ММСК проявляются лишь при наличии специфического окружения, формирующего их тканевую нишу in vivo. Одним из наиболее перспективных подходов к решению данной проблемы in vitro является трехмерное культивирование клеток в виде сфероидов. В отличие от двумерных культур, в сфероидах клетки имеют возможность образовывать контакты и обмениваться регуляторными сигналами, а также продуцировать экстрацеллюлярный матрикс, что способствует реализации их функций.
Данная работа посвящена применению сфероидов на основе ММСК из различных источников для моделирования регенеративных процессов in vitro.
В первой части работы был изучен хондрогенный потенциал ММСК при сфероидном культивировании [1]. Источниками ММСК были выбраны пульпа молочного зуба, Вартонов студень (строма) пуповины и подкожная жировая клетчатка, положительным контролем служили первичные хондроциты. Сфероиды получали путем агрегации 8 тыс. клеток в низкоадгезивных 96-луноч-ных планшетах. Хондрогенную дифференцировку проводили в течение 3-х недель в среде, содержащей TGF-ß1. Гистохимический анализ всех образцов выявил прогрессивное накопление экстрацеллюлярного матрикса и присутствие в нем коллагена и гликозаминогликанов.
Далее была разработана 3й-модель ангиогенеза, основанная на культивировании сфероидов из ММСК и эндотелиоцитов в гидрогеле [2]. Сфероиды, состоящие из эндотелиоцитов пуповинной вены и МСК стро-мы пуповины в соотношении 1:1 (1000 клеток в одном сфероиде), культивировали в фибриновом геле с добавлением 20% лизата тромбоцитов (ЛТ). Прижизненное наблюдение осуществляли при помощи системы IncuCyte Zoom (Essen Bioscience, США). Трехмерные отростки (спрауты), а также распределение обоих типов клеток в геле анализировали при помощи фазово-контрастной и сканирующей лазерной конфокальной микроскопии. Показано, что ЛТ поддерживал миграцию обоих типов клеток и способствовал образованию «истинных» в морфологическом плане спраутов, образующих анастомозы II типа.
Полученные результаты позволяют заключить, что модели, созданные на основе сфероидов из ММСК,
обладают высокой биологической релевантностью и могут быть широко использованы при разработке терапевтических регенеративных технологий. Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021-2030 годы) (№ 122022800499-5).
Литература:
1. Цветкова А.В., Вахрушев И.В., Басок Ю.Б. и др. Клеточные технологии в биологии и медицине. 2020. No 4. С. 237.
2. Vakhrushev I.V., Nezhurina E.K., Karalkin P.A. et al. Biology (Basel). 2021. V. 11 P. 18. doi: 10.3390/biology11010018.
ВЛИЯНИЕ СТАРЕНИЯ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОГО ВОСПАЛЕНИЯ И СНИЖЕНИЯ ДВИГАТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НА ТРАНСКРИПТОМ СКЕЛЕТНОЙ МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА
Т.Ф. Вепхвадзе1, 2, М.А. Виговский1, 2,
Н.С. Курочкина1, П.А. Махновский1,
О.А. Григорьева2, Е.М. Леднев1, В.В. Филиппов2,
Я.Р. Бородай2, М.Ю. Высоких1, 2,
А.Ю. Ефименко2, Д.В. Попов1, 2
1 Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия
2 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: старение, воспаление, двигательная активность, скелетная мышца, транскриптом, РНК секвенирование.
При старении наблюдаются комплексные изменения, включающие снижение двигательной активности, массы и функциональных возможностей (инсулиновая чувствительность, работоспособность и сила мышц) скелетных мышц, которые зачастую развиваются на фоне хронического воспаления. Цель работы — исследовать влияние старения на транскриптом скелетной мышцы человека.
Транскриптомный профиль (РНК секвенирование) скелетной мышцы пожилых пациентов с первичным артрозом коленного/тазобедренного сустава (OP, n=35, 72(66-83) года, индекс массы тела (ИМТ) 30(21-43) кг/м2) сопоставляли с транскриптомом молодых здоровых добровольцев (YH, n=10, 35(25-43) лет, ИМТ 22,5(18,9-29,4) кг/м2). Для выявления вклада хронического воспаления и снижения двигательной активности в изменение генной экспрессии YH сопоставляли с группой молодых пациентов с артрозом (YP, n=7, 39(26-45) лет, ИМТ 25,8(25,4-30,9) кг/м2). Для оценки влияния возраста сопоставляли группы YP и OP.
Субъективная оценка двигательных возможностей не различалась между пациентами разного возраста и была значительно ниже, чем у YH. Маркеры воспалительного ответа (уровень лейкоцитов и нейтрофилов крови) были сопоставимы между OP и YP, но значительно выше, чем в YH. У старых людей (сравнение OP vs. YH) гены с повышенной экспрессией (2529) были ассоциированы с процессами воспаления, перестройкой внеклеточного матрикса и жировым обменом; гены с пониженной экспрессией (1 007 генов), преимущественно, кодировали белки митохондрий и регуляторы углеводного обмена. У молодых пациентов (сравнение YP vs. YH) гены, увеличившие экспрессию (2107), были связаны с воспалением и биогенезом внеклеточного ма-трикса, а уменьшившие экспрессию (558) кодировали
митохондриальные белки. Эти изменения были сопоставимы, но менее выражены, чем при сравнении ОР уэ. УЧ. Сравнение ОР уэ. УР показало, что у пожилых пациентов количество изменивших экспрессию генов по сравнению с молодыми было значительно меньше, чем в остальных случаях: 536 и 299 снизили и увеличили экспрессию, соответственно.
Таким образом, у старых пациентов с первичным артрозом происходят выраженные изменения транс-криптома скелетных мышц (ОР уэ. УЧ). Большинство из этих изменений были обнаружены у молодых пациентов с артрозом и сниженной двигательной активностью относительно молодых здоровых людей (УР уэ. УЧ). Это позволяет предполагать, что возраст-зависимые изменения транскриптома скелетных мышц индуцированы преимущественно воспалением и снижением двигательной активности.
Работа поддержана РНФ (грант 21-15-00405, биоматериалы здоровых добровольцев, транскриптомное исследование, биоинформатическое исследование), государственным заданием МГУ им. М.В. Ломоносова и выполнена с использованием оборудования, полученного в рамках программы развития МГУ им. М.В. Ломоносова (биоматериалы пациентов, клинические и лабораторные исследования).
СЕНЕСЦЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ТЕРЯЮТ СПОСОБНОСТЬ ПОДАВЛЯТЬ РАЗВИТИЕ ФИБРОЗА ЛЕГКИХ ПРИ СТАРЕНИИ
М.А. Виговский1, 2, Н.А. Басалова1, У.Д. Дьячкова2, В.С. Попов1, 2, А.Е. Толстолужинская2, О.А. Григорьева1, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Кафедра биохимии и молекулярной медицины факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: [email protected]
Ключевые слова: фиброз легких, мезенхимные стромаль-ные клетки, секретом, внеклеточные везикулы, индуцированная сенесценция, старение
Мезенхимные стромальные клетки (МСК) признаны важнейшими регуляторами процессов репарации и регенерации поврежденных тканей. Во многих исследованиях была показана способность секретома МСК, в том числе фракции внеклеточных везикул (ВВ), предотвращать вызванное повреждением развитие фиброза. Однако, в результате изменения микроокружения при повреждении состав секретома МСК может существенно меняться. Ранее в нашей лаборатории было показано, что МСК, культивируемые в профибротических условиях, демонстрируют признаки индуцированного клеточного старения (сенесценции), при этом значительно снижается способность ВВ от таких клеток ингибировать диффе-ренцировку миофибробластов в in vitro моделях. Целью данной работы было в сложной многофакторной модели фиброза легких in vivo проверить, утрачивают ли ВВ, секретируемые сенесцентными МСК (ВВсенМСК), свой антифибротический потенциал или локальное микроокружение способно скомпенсировать дисфункцию вводимых ВВ. Для этого у мышей разного возраста (4-6 нед и 20-24 нед) моделировали фиброз легких введением
