CC BY
8
уровень экспрессии бета-галактозидазы снижался. Это можно объяснить их элиминацией иммунными клетками. Замедление роста хряща, скорее всего, связано с ремо-делированием внеклеточного матрикса [2]. На 90 сутки в группе № 2 выявили наименьшую активность бета-галактозидазы и наибольшую площадь регенератов. В группе № 3 уровень экспрессии бета-галактозидазы был в 5 раз выше, чем в группе № 2 (p<0,05). Из этого следует, что длительная персистенция стареющих клеток негативно влияет на регенерацию [1].
Число стареющих клеток в ткани связано с размером дефекта. После повреждения стареющие клетки ускоряют регенерацию хряща, а при длительной персистенции ингибируют. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 21-75-00081.
Литература:
1. Ritschka B. et al. Genes & development. - 2017. - Т. 31. - № . 2. - С. 172-183.
2. Yun M.H., Davaapil H., Brockes J.P. E-life. - 2015. - Т. 4.
Т-КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ ПРИ
РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ
М. Ваньямбе1, И.П. Иванова2, Д.В. Дёмина2,
М.Н. Давыдова2, Г.В. Селедцова2, Е.А. Блинова2
1 Институт медицины и психологии им.В. Зельмана при Новосибирском государственном университете, Новосибирск, Россия
2 НИИ Фундаментальной и Клинической Иммунологии, Новосибирск, Россия
e-mail: wanyambemwiya433@gmail.com
Ключевые слова: Т-клетки, вакцинация, рассеянный
склероз.
Четырнадцать пациентов с ремиттирующей формой рассеянного склероза были многократно иммунизированы аутологичной поликлональной T-клеточной вакциной [1,2,3]. Индуцирующий курс иммунотерапии состоял из 4 еженедельных Т-клеточных вакцинаций. Вакцинальная доза варьировала в пределах 2,0-4,0х107 клеток. Поддерживающее лечение включало в себя вакцинации с интервалом в один месяц. Неврологический статус всех обследованных пациентов, оцениваемый по функциональной шкале Курцке с использованием расширенной шкалы инвалидизации (EDSS), до начала лечения составлял в среднем 3,6 ± 0,39 балла, среднее количество обострений в год - 1,4 ± 0,16.
В течение 1 года от начала лечения у всех наблюдавшихся больных обострений заболевания зарегистрировано не было, а у 11 из них отмечено отчетливо улучшение неврологических параметров (EDSS в среднем 2,9 ± 0,38) . У 3 пациентов состояние сохранялось стабильным на протяжении всего срока наблюдения. Субъективная оценка основных симптомов заболевания показала, что у 9 из 14 пациентов уменьшилась слабость в конечностях, головокружение и шаткость при ходьбе; у 6 - улучшилась функция тазовых органов (произошло урежение императивных позывов); у 3 - уменьшилась утомляемость, проявления астении, эмоциональная лабильность. 3 пациента отметили улучшение когнитивной функции по МоСа тесту. Переносимость вакцинации в целом была удовлетворительной, единичные побочные эффекты в виде покраснения в месте инъекции купировались самостоятельно.
Проведение Т-клеточной вакцинации сопровождалось достоверным снижением уровня IFNy и подъемом уровня IL-4 и IL-10 в сыворотке крови пациентов, двукратным снижением частоты IFNy-продуцирующих CD4+ и CD8+ Т-клеток памяти. Также, у пациентов с рассеянным склерозом через 1 год после проведенного лечения регистрировалось значительное снижение пролифера-тивного ответа мононуклеарных клеток периферической крови на миелиновый антиген. Наши данные указывают на значительный иммунорегуляторный потенциал Т-клеточной вакцинации, которая в перспективе может найти широкое применение в лечении рассеянного склероза и других аутоиммунных заболеваний.
Литература:
1. Иванова И.П., Селедцов В.И., Банул Н.В. и др. Мед. Иммунология. 2005. Т.7. № 1. С.27.
2. Hellings N., Raus J., Stinissen P. Autoimmun. Rev. 2004. V. 3. P. 267.
3. Willekens B., Cools N. CNS Drugs. 2018. V. 32. P. 401.
КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ РЕАЦЕТИЛИРОВАННОГО ХИТОЗАН-ГЛИЦЕРОФОСФАТНОГО ГИДРОГЕЛЯ С ВЫСОКОПОРИСТЫМИ PLA-ГРАНУЛАМИ И BMP-2 ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
А.В. Васильев1' 2 4, В.С. Кузнецова1' 2,
Т.Б. Бухарова2, Т.Е. Григорьев3, Ю.Д. Загоскин3,
И.И. Бабиченко1, 4, С.Н. Чвалун3,
Д.В. Гольдштейн2, 4, Ф.Ф. Лосев, А.А. Кулаков1
1 — ФГБУ Центральный НИИ стоматологии
и челюстно-лицевой хирургии МЗ РФ, Москва, Россия
2 — ФГБНУ Медико-генетический научный центр им. акад. Н.П. Бочкова, Москва, Россия
3 — НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
4 — Российский Университет Дружбы Народов, медицинский институт, Москва, Россия
e-mail: vav-stom@yandex.ru
Ключевые слова: костно-пластический материал, BMP-2, хитозан, полилактид
Введение. Высокопористые полилактидные гранулы могут длительно высвобождать малые дозы BMP-2, обеспечивая экто- и ортотопический неоостегенез и исключая вероятные риски, которые могут быть связаны с избыточной концентрацией BMP-2: гиперостоз, воспаление, анаплазия (Vasilyev, et al., 2019, 2020). Использование полилактидных (PLA) гранул в сочетании с хитозан-глицерофосфатным гелем позволит улучшить его прочностные и манипуляционные свойства за счёт получения пластилиноподобной композиции, способной отверждаться после внесения в рану за счёт температуры внутренней среды организма и её буферных систем. Степень деацетилирования хитозана (DD%) при этом может оказывать выраженное влияние на цито- и биосовместимость, и на прочностные свойства системы. Однако взаимосвязь всех этих факторов ещё не была показана.
Материалы и методы. Образец хитозана (ChitoClear HQG 1600, «43040», Primex, Island) был реацетили-рован до 19,5, 39, 49, 55, 56 DD% для исключения воздействия других факторов: длины цепи, степени очистки и пр. DD% устанавливали с помощью 1Н-ЯМР
и ИК-Фурье спектроскопии. Для получения гидрогелей стерильный хитозан растворяли в 0,1 М уксусной кислоте и добавляли водный раствор р-глицерофосфата при температуре 4°С. Высокопористые (пористость 98%) частицы полилактида получали распылением замороженных эмульсий полимера с применением сублимационной сушки. Массовая доля полилактид-ных гранул составляла 1-20 %. BMP-2 импрегниро-вали в PLA-гранулы в концентрациях 10 и 50 мкг/ мл. Оценку цитотоксичности проводили на мульти-потентных стромальных клетках (ММСК) человека с помощью МТТ-теста. Адгезию и выживаемость клеток на поверхности композиций материалов оценивали с помощью витального окрашивания PKH26, DAPI и кальцеином. Прочностные характеристики были исследованы на электромеханической системе «Instron-5965» (Instron, США). Биосовместимость и способность индуцировать экто- и ортотопический остеогенез исследовали на моделях подкожной имплантации и критического дефекта теменных костей у крыс линии Wistar. Для этого через 14 и 28 дней имплантированный материал подвергали гистологической обработке с последующей морфометрией.
Результаты и обсуждение. Снижение степени деа-цетилирования хитозана (DD%) в составе гидрогеля с p-глицерофосфатом приводило к увеличению относительной выживаемости клеток ММСК in vitro и снижению лейкоцитарной инфильтрации при подкожной имплантации крысам in vivo. Включение 12 масс.% полилактидных гранул оказалось оптимальным с точки зрения моделируемости композиции и приводило к возрастанию модуля упругости материала в ~ 100 раз, по сравнению с хитозановым гидрогелем без наполнителя. Избыточное наполнение PLA-гранулам более 15% приводило к разрушению материала при деформации ~ 10%. Остеоиндуктивные и остеокон-дуктивные способности материала на основе хитоза-нового гидрогеля из реацетилированного хитозана (39 DD%) и высокопористых PLA-гранул, импрегни-рованных BMP-2, были продемонстрированы на моделях орто- и эктопического остеогенеза. Так, при имплантации композиции внутрь критического дефекта теменных костей крыс оказалось, что концентрация BMP-2 10 мкг/мл обладала оптимальными свойствами: костная ткань в виде островков заполняла толщу всего материала. В тех же условиях при имплантации материала с 50 мкг/мл BMP-2 происходило избыточное разрастание костной ткани и выталкивание материала за пределы дефекта. Достаточные остеоиндук-тивные свойства материала с 10 мкг/мл BMP-2 были также показаны при подкожной имплантации, то есть в условиях без костного окружения.
Заключение. Разработанная матрица костно-пла-стического материала на основе реацетилированного хитозана, p-глицерофосфата и высокопористых поли-лактидных гранул с BMP-2 может быть использована для получения способных к моделированию и биорезорбции биосовместимых остеопластических материалов, которые обладают выраженными остеоиндуктивными и осте-окондуктивными свойствами.
СФЕРОИДЫ НА ОСНОВЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КАК МОДЕЛЬНЫЙ ОБЪЕКТ ТКАНЕВОЙ ИНЖЕНЕРИИ
И.В. Вахрушев1, Г.Е. Леонов1, А.В. Цветкова1, В.Д. Новикова1, Л.А. Кирсанова2, П.А. Каралкин1, С.А. Родионов3, Н.С. Сергеева3, Ю.Б. Басок2, К.Н. Ярыгин1
1 ФГБНУ НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича, Москва, Россия
2 ФГБУ НМИЦ трансплантологии и искусственных органов им. ак. В.И. Шумакова, Москва, Россия
3 МНИОИ им. ПА. Герцена - филиал ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: vakhrunYa@gmail.com
Ключевые слова: клеточные сфероиды, мезенхимальные стромальные клетки, in vitro модели, хондрогенная диффе-ренцировка, ангиогенез.
Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) широко применяют в тканевой инженерии благодаря их доступности, возможности дифферен-цировки в различных направлениях и иммуномодули-рующим свойствам. Однако наиболее полным образом эти важные особенности ММСК проявляются лишь при наличии специфического окружения, формирующего их тканевую нишу in vivo. Одним из наиболее перспективных подходов к решению данной проблемы in vitro является трехмерное культивирование клеток в виде сфероидов. В отличие от двумерных культур, в сфероидах клетки имеют возможность образовывать контакты и обмениваться регуляторными сигналами, а также продуцировать экстрацеллюлярный матрикс, что способствует реализации их функций.
Данная работа посвящена применению сфероидов на основе ММСК из различных источников для моделирования регенеративных процессов in vitro.
В первой части работы был изучен хондрогенный потенциал ММСК при сфероидном культивировании [1]. Источниками ММСК были выбраны пульпа молочного зуба, Вартонов студень (строма) пуповины и подкожная жировая клетчатка, положительным контролем служили первичные хондроциты. Сфероиды получали путем агрегации 8 тыс. клеток в низкоадгезивных 96-луноч-ных планшетах. Хондрогенную дифференцировку проводили в течение 3-х недель в среде, содержащей TGF-ß1. Гистохимический анализ всех образцов выявил прогрессивное накопление экстрацеллюлярного матрикса и присутствие в нем коллагена и гликозаминогликанов.
Далее была разработана 3й-модель ангиогенеза, основанная на культивировании сфероидов из ММСК и эндотелиоцитов в гидрогеле [2]. Сфероиды, состоящие из эндотелиоцитов пуповинной вены и МСК стро-мы пуповины в соотношении 1:1 (1000 клеток в одном сфероиде), культивировали в фибриновом геле с добавлением 20% лизата тромбоцитов (ЛТ). Прижизненное наблюдение осуществляли при помощи системы IncuCyte Zoom (Essen Bioscience, США). Трехмерные отростки (спрауты), а также распределение обоих типов клеток в геле анализировали при помощи фазово-контрастной и сканирующей лазерной конфокальной микроскопии. Показано, что ЛТ поддерживал миграцию обоих типов клеток и способствовал образованию «истинных» в морфологическом плане спраутов, образующих анастомозы II типа.
Полученные результаты позволяют заключить, что модели, созданные на основе сфероидов из ММСК,
