CC BY
6
сополимеров хитозана, изучение их физико-химических свойств и культивирование на/в них различных типов клеток в модели in vitro. Сополимеры Chit (ММ 60 кДа, СД 0.9) с олиго(1_,1_- и /LD-лактидами с ММ 5 кДа (Chit-L,L и Chit-L,D, соответственно) получали методом твердофазного синтеза. Показано, что структура матриксов представляла собой систему взаимосвязанных макропор со средним размером пор в диапазоне 50-250мкм (конфокальная лазерная микроскопия). Отсутствие цитотоксичности подтвердили путем культивирования клеток мышиных фи-бробластов L929 в экстрактах, полученных после инкубации гидрогелей в среде DMEM (10% FBS) — МТТ-тест. Культивирование клеток острого моноцитарного лейкоза человека (THP-1) в гидрогелях не приводило к их активации (ИФА на TNF-a и IL-6). Показано, что «химия и топография поверхности» гидрогелей обеспечивала адгезию клеток L929 и МСК (конфокальная микроскопия), рост и пролиферацию в течение 7-14 дней (МТТ-тест). Для изучения диф-ференцировки МСК использовали 2D пленки. Определяли активность щелочной фосфатазы, а также уровни экспрессии генов-маркёров Runx2, ALPL, SPP1 (пЦр в режиме реального времени). Окрашивание везикул, содержащих три-глицериды, и активность ADIPOQ, PPAR/(n^) применяли для доказательства адипогенеза. Показано, что все сопо-лимерные плёнки поддерживали пролиферацию и диффе-ренцировку МСК, при этом Chit-L,D усиливали их остеоген-ный, а Chit-L,L — адипогенный потенциал. Таким образом, полученные матриксы являются перспективными биоматериалами для регенеративной медицины. Это исследование частично финансировано Российским научным фондом (номер гранта 22-13-00261).
РЕКОНСТРУКЦИЯ СТРУКТУРЫ ФИБРОТИЧЕСКОГО ФОКУСА КАК МОДЕЛИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГРЕССИРОВАНИЯ ФИБРОЗА IN VITRO
А.Е. Толстолужинская2, Н.А. Басалова1, E.C. Новоселецкая1, М.Н. Карагяур1 2, Р.Ю. Еремичев1, А.Ю. Ефименко1, 2
1 Институт регенеративной медицины, Медицинский научно-образовательный центр, МГУ
им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Факультет фундаментальной медицины, МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: a.luzh@yandex.ru
Ключевые слова: фиброз, фибротический фокус, сфероид, внеклеточный матрикс, децеллюляризация, миофибробласты.
Фибротический фокус является основной морфо-функциональной единицей при развитии фиброза различных тканей, в том числе фиброза лёгких. Такой фокус состоит из ядра неправильно уложенных специфических белков внеклеточного матрикса (ВКМ), синтезируемых миофибробластами и их предшественниками, расположенными на периферии ядра. Поскольку фибротический фокус является одним из ключевых объектов для изучения механизмов регуляции и прогрессирования фиброза, необходима разработка релевантной модели данной морфофункциональной структуры. Поэтому основная цель данной работы заключалась в реконструкции фи-бротического фокуса in vitro.
Для получения ядра фибротического фокуса собирали сфероиды, образованные миофибробластами, на различных культуральных средах. Полученные сфероиды подвергали децеллюляризации (Новоселецкая, 2020).
Структуру сфероидов и децеллюляризованных сфероидов (децелл-сфероид) оценивали с помощью конфокальной микроскопии и дот-блоттинга. Децелл-сфероиды рецеллюляризировали миофибробластами и на полученной модели «фибротического фокуса in vitro» оценивали их функциональную активность.
Было показано, что культуральная среда, содержащая эмбриональную бычью сыворотку, аскорбиновую кислоту и трансформирующий фактор роста бета (TGFb) способствует сборке сфероидов и отложению специфических компонентов фибротического ВКМ, включая коллаген I типа и EDA-фибронектин. Децелл-сфероиды нетоксичны и могут быть рецеллюляризованы с помощью фибробла-стов. Фибробласты в составе децелл-сфероидов могут дифференцироваться в миофибробласты под влиянием TGFb. Миофибробласты были способны дедифференциро-ваться в фибробласты и разрушать ВКМ децелл-сфероида после обработки внеклеточными везикулами мезенхимных стромальных клеток (МСК), обладающими установленными антифибротическими свойствами (Басалова, 2020).
Таким образом, нами разработана модель, воспроизводящая клеточный состав и микроокружение, характерные для фибротического фокуса. Мы показали, что миофибробласты в составе фибротического фокуса под воздействием внеклеточных везикул способны разрушать ядро фокуса, что может быть одним из возможных механизмов антифибротического действия МСК. Данная система может быть использована в качестве модельного 3D объекта для изучения in vitro динамики формирования и деградации фибротического фокуса (грант РФФИ № 20-315-90120 и 21-315-70002).
Литература:
1. Novoseletskaya E., Grigorieva O., Nimiritsky P et al. Front. Cell
Dev. Biol. 2020. V. 8. № 9. P. 1-25.
D-АСПАРАГИН УЛУЧШАЕТ ПРИЖИВЛЕНИЕ
БИОПОЛИМЕРНОГО СКАФФОЛДА КОЖИ
ПОСЛЕ РАННЕЙ НЕКРЭКТОМИИ
А.И. Трофименко, А.Х. Каде
Кубанский государственный медицинский
университет, Краснодар, Россия
e-mail: artemtrofimenko@mail.ru
Ключевые слова: желатин, альгинат натрия, скаффолд,
кожа.
Разработка биодеградируемых скаффолдов является перспективным подходом к решению проблемы дефицита донорского материала у пациентов с обширными ожогами кожи.
Цель — изучить влияние D-аспарагина на приживление биополимерного скаффолда для замещения дефектов кожи после некрэктомии ожоговых ран в эксперименте у крыс.
В исследовании на 20 крысах-самцах, после моделирования ожога кожи III ст. [1], проводили раннюю некрэктомию с одномоментной имплантацией скаффолда на основе альгината натрия, желатина тип А и винилтриэтоксисилана [2], в группе 1 без и в группе 2 с D-аспарагином.
Окраску микропрепаратов кожи (30-е сутки) выполняли по протоколу для гематоксилин-эозина, а также по Маллори. Для фрактального анализа фибриллярной структуры внеклеточного матрикса применяли плагин FracLac 2.5 (NIH, США) для «Image J 1.51j8». При
помощи «box-counting method» определяли значение фрактальной размерности (ФР) и лакунарности (ЛК) [3].
В группе 1 эпидермис истончен, наблюдается грубая дезорганизация его слоев, нечеткая граница перехода эпидермиса в дерму, сосочковый и сетчатый слои дермы не дифференцируются (видна ячеистая структура скаффолда), в дерме видны выраженные признаки воспалительной инфильтрации, множество гигантских и эпителиоидных клеток, большое количество крупных, вариабельных по диаметру сосудов.
В группе 2 толщина эпидермиса на 45,5% (p=0,002) больше, чем в группе сравнения. Прослеживается дифференциация эпидермиса на слои, виден переход эпидермиса в дерму, при этом также отсутствует разделение на сосочковый и сетчатый слои дермы (видна ячеистая структура скаффолда), выявлены единичные гигантские и эпителиоидные клетки, умеренное количество крупных, тонкостенных сосудов.
Различия в ремоделировании структуры фибриллярного компонента внеклеточного матрикса в зоне имплантации скаффолда нашли подтверждение в изменении ФР и ЛК. В группе 2 ФР на 2,9% больше (p=0,042) и ЛК на 5 % меньше (p=0,028), чем в группе 1.
Таким образом, включение D-аспарагина оказывает положительное влияние на приживление и ремоделиро-вание биополимерного скаффолда на 30-е сутки от имплантации после некрэктомии ожоговых ран.
Литература:
1. Cai E.Z., Ang C.H., Raju A. et al. Arch Plast Sung. 2014. V. 41.
№ 4. P. 317.
2. Kade A.Kh., Tnofimenko A.I., Bogdanov S.B. et al. Medical News
of North Caucasus. 2021. V. 16. № 2. P. 184.
3. Taniguchi B.A., Bneda M.R.S., Nogueina R.M.B. et al. 2018. V.
11. P. 5241.
ПОЛИ-3-ОКСИБУТИРАТ КАК ИНСТРУМЕНТ
ИМИТАЦИИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ОПУХОЛИ
Е.А. Трусова1, М.С. Холина1, Д.С. Святославов2,
С.И. Самойлова2, И.В. Решетов2,
К.В. Шайтан1, А.П. Бонарцев1
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: ekaterina.trusova2001@gmail.com
Ключевые слова: поли-3-оксибутират, полиоксиалканоаты,
3й-модели культур клеток, рак, регенеративная медицина.
Данная работа посвящена разработке и анализу структуры 313-модели раковой опухоли, ее сравнению с опухолями пациентов с плоскоклеточным раком языка и ротоглотки. 313-культуры являются перспективными моделями тестирования на этапе доклинических испытаний и должны обладать максимально близкими к условиям in vivo свойствами [1]. Гипотеза заключалась в том, что наиболее подходящими компонентами имитации микроокружения опухоли являются микросферы диаметром 90 и 75 мкм, тогда как использование микросфер диаметром 205 мкм не позволило разработать 313-модель опухоли.
Сфероиды были получены методом культивирования клеток линии HEp-2 (плоскоклеточной карциномы гортани) на низкоадгезивной поверхности с добавлением высокопористых микросфер из поли-3-оксибутирата (ПОБ) различного диаметра. При достижении 80% кон-флюэнтности, жизнеспособность клеток оценивалась
с помощью окрашивания трипановым синим при помощи подсчета в камере Горяева (Freshney).
Микросферы из ПОБ использовались в качестве имитации микроокружения, в частности, элементов микрососудистого русла. В качестве источника ПОБ использовался штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б [2]. Для получения микросфер диаметром 205, 90 и 75 мкм применялся метод "water-in-oil-in-water" (W1/O/W2), позволяющий получать микросферы с высокой пористостью (более 90%). Детекция пролиферативной активности клеток в сфероиде проводилась с помощью МТТ-теста. Анализ морфологии клеток, структуры сфероидов и диаметра микросфер проводился методами СЭМ и конфокальной микроскопии (с использованием флуоресцентных красителей Calcein AM и Hoechst 33342). Полученные сфероиды имели характерные для данной 30-модели зоны, морфология клеток была приближенной к нативной. Оценка корреляции сфероидов с биопсией опухолей пациентов проводилась с помощью иммунофенотипирования. В качестве молекулярных мишеней были использованы антитела к биомаркерам р1611\1К4А и р53 (DO-7). Повышенная экспрессия p16 свидетельствует о ВПЧ-положительном статусе клеточной линии, преобладание дикого типа p53 — об отсутствии быстрого развития опухоли. Полученные результаты иммуногистохимического окрашивания коррелируют с клиническими образцами. Включения в модель микросфер диаметром 205 мкм не показало никакого эффекта.
Тесты резистентности модели к препаратам доксору-бицин и патлитаксел (таксол) показали, что 3D-модели с микросферами диаметром 90 и 75 мкм проявляют больший уровень лекарственной устойчивости к обоим препаратом, что характерно и для естественных опухолевых образований.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-29-09099, на оборудовании ЦКП Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета.
Литература:
1. Gianluca Colella, Flavio Fazioli, Michele Gallo et al. Int. J. Mol. Sci.
2018. V. 19 № 615.
2. V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V. et al. Preparative Biochemistry
and Biotechnology 2017. V. 47. N. 2. P. 173
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ГОРМОНОВ НА СЕКРЕТОРНО-СИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
Е.П. Турищева1, М.С. Вильданова1, П.А. Вишнякова2, 3, Д.К. Матвеева4, Г.Е. Онищенко1, Е.А. Смирнова1
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, Россия
2 НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения РФ, лаборатория Регенеративной медицины, Москва, Россия
3 РУДН, кафедра гистологии, Москва, Россия
4 ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, лаборатория Клеточной физиологии, Москва, Россия
e-mail: kitten-caterina@yandex.ru
Ключевые слова: абсцизовая кислота, гиббереллиновая кислота, фибробласты, миофибробласты, фиброз, диффе-ренцировка, проколлаген, фибронектин.
