CC BY
4
помощи «box-counting method» определяли значение фрактальной размерности (ФР) и лакунарности (ЛК) [3].
В группе 1 эпидермис истончен, наблюдается грубая дезорганизация его слоев, нечеткая граница перехода эпидермиса в дерму, сосочковый и сетчатый слои дермы не дифференцируются (видна ячеистая структура скаффолда), в дерме видны выраженные признаки воспалительной инфильтрации, множество гигантских и эпителиоидных клеток, большое количество крупных, вариабельных по диаметру сосудов.
В группе 2 толщина эпидермиса на 45,5% (p=0,002) больше, чем в группе сравнения. Прослеживается дифференциация эпидермиса на слои, виден переход эпидермиса в дерму, при этом также отсутствует разделение на сосочковый и сетчатый слои дермы (видна ячеистая структура скаффолда), выявлены единичные гигантские и эпителиоидные клетки, умеренное количество крупных, тонкостенных сосудов.
Различия в ремоделировании структуры фибриллярного компонента внеклеточного матрикса в зоне имплантации скаффолда нашли подтверждение в изменении ФР и ЛК. В группе 2 ФР на 2,9% больше (p=0,042) и ЛК на 5 % меньше (p=0,028), чем в группе 1.
Таким образом, включение D-аспарагина оказывает положительное влияние на приживление и ремоделиро-вание биополимерного скаффолда на 30-е сутки от имплантации после некрэктомии ожоговых ран.
Литература:
1. Cai E.Z., Ang C.H., Raju A. et al. Arch Plast Sung. 2014. V. 41.
№ 4. P. 317.
2. Kade A.Kh., Tnofimenko A.I., Bogdanov S.B. et al. Medical News
of North Caucasus. 2021. V. 16. № 2. P. 184.
3. Taniguchi B.A., Bneda M.R.S., Nogueina R.M.B. et al. 2018. V.
11. P. 5241.
ПОЛИ-3-ОКСИБУТИРАТ КАК ИНСТРУМЕНТ
ИМИТАЦИИ МИКРООКРУЖЕНИЯ ОПУХОЛИ
Е.А. Трусова1, М.С. Холина1, Д.С. Святославов2,
С.И. Самойлова2, И.В. Решетов2,
К.В. Шайтан1, А.П. Бонарцев1
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России, Москва, Россия
e-mail: ekaterina.trusova2001@gmail.com
Ключевые слова: поли-3-оксибутират, полиоксиалканоаты,
3й-модели культур клеток, рак, регенеративная медицина.
Данная работа посвящена разработке и анализу структуры 313-модели раковой опухоли, ее сравнению с опухолями пациентов с плоскоклеточным раком языка и ротоглотки. 313-культуры являются перспективными моделями тестирования на этапе доклинических испытаний и должны обладать максимально близкими к условиям in vivo свойствами [1]. Гипотеза заключалась в том, что наиболее подходящими компонентами имитации микроокружения опухоли являются микросферы диаметром 90 и 75 мкм, тогда как использование микросфер диаметром 205 мкм не позволило разработать 313-модель опухоли.
Сфероиды были получены методом культивирования клеток линии HEp-2 (плоскоклеточной карциномы гортани) на низкоадгезивной поверхности с добавлением высокопористых микросфер из поли-3-оксибутирата (ПОБ) различного диаметра. При достижении 80% кон-флюэнтности, жизнеспособность клеток оценивалась
с помощью окрашивания трипановым синим при помощи подсчета в камере Горяева (Freshney).
Микросферы из ПОБ использовались в качестве имитации микроокружения, в частности, элементов микрососудистого русла. В качестве источника ПОБ использовался штамм-продуцент Azotobacter chroococcum 7Б [2]. Для получения микросфер диаметром 205, 90 и 75 мкм применялся метод "water-in-oil-in-water" (W1/O/W2), позволяющий получать микросферы с высокой пористостью (более 90%). Детекция пролиферативной активности клеток в сфероиде проводилась с помощью МТТ-теста. Анализ морфологии клеток, структуры сфероидов и диаметра микросфер проводился методами СЭМ и конфокальной микроскопии (с использованием флуоресцентных красителей Calcein AM и Hoechst 33342). Полученные сфероиды имели характерные для данной 30-модели зоны, морфология клеток была приближенной к нативной. Оценка корреляции сфероидов с биопсией опухолей пациентов проводилась с помощью иммунофенотипирования. В качестве молекулярных мишеней были использованы антитела к биомаркерам р1611\1К4А и р53 (DO-7). Повышенная экспрессия p16 свидетельствует о ВПЧ-положительном статусе клеточной линии, преобладание дикого типа p53 — об отсутствии быстрого развития опухоли. Полученные результаты иммуногистохимического окрашивания коррелируют с клиническими образцами. Включения в модель микросфер диаметром 205 мкм не показало никакого эффекта.
Тесты резистентности модели к препаратам доксору-бицин и патлитаксел (таксол) показали, что 3D-модели с микросферами диаметром 90 и 75 мкм проявляют больший уровень лекарственной устойчивости к обоим препаратом, что характерно и для естественных опухолевых образований.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РФФИ № 18-29-09099, на оборудовании ЦКП Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, приобретенного за счет средств Программы развития Московского университета.
Литература:
1. Gianluca Colella, Flavio Fazioli, Michele Gallo et al. Int. J. Mol. Sci.
2018. V. 19 № 615.
2. V.A., Akoulina E.A., Ivanova E.V. et al. Preparative Biochemistry
and Biotechnology 2017. V. 47. N. 2. P. 173
ВЛИЯНИЕ РАСТИТЕЛЬНЫХ ГОРМОНОВ НА СЕКРЕТОРНО-СИНТЕТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ДЕРМАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА
Е.П. Турищева1, М.С. Вильданова1, П.А. Вишнякова2, 3, Д.К. Матвеева4, Г.Е. Онищенко1, Е.А. Смирнова1
1 МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, Москва, Россия
2 НМИЦ акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Министерства здравоохранения РФ, лаборатория Регенеративной медицины, Москва, Россия
3 РУДН, кафедра гистологии, Москва, Россия
4 ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, лаборатория Клеточной физиологии, Москва, Россия
e-mail: kitten-caterina@yandex.ru
Ключевые слова: абсцизовая кислота, гиббереллиновая кислота, фибробласты, миофибробласты, фиброз, диффе-ренцировка, проколлаген, фибронектин.
Регуляция синтеза и секреции компонентов внеклеточного матрикса дермальными фибробластами может позволить ускорять заживление ран и подавлять развитие фиброза. Известно, что растительные гормоны аб-сцизовая кислота (АБК) и гиббереллиновая кислота (ГК) могут оказывать влияние на секреторную активность некоторых типов клеток человека (р-клеток островков Лангерганса, энтероэндокринных клеток, мезенхимных стромальных клеток). Поэтому целью нашей работы было исследовать влияние растительных гормонов АБК и ГК на секреторно-синтетическую активность культивируемых дермальных фибробластов человека.
Фибробласты синтезируют и секретируют компоненты внеклеточного матрикса, среди которых наиболее распространёнными в соединительной ткани коллагеновы-ми и неколлагеновыми белками являются проколлаген I и фибронектин, соответственно. Анализ уровня синтеза проколлагена I и фибронектина с помощью вестерн-блот-тинга показал, что АБК вызывает повышение уровня синтеза проколлагена I и фибронектина в дермальных фибро-бластах, а ГК — снижение уровня синтеза проколлагена I. Анализ уровня секреции проколлагена I и фибронектина с помощью ИФА показал, что АБК стимулирует секрецию проколлагена I и не влияет на секрецию фибронектина, а ГК стимулирует секрецию фибронектина, не влияя при этом на секрецию проколлагена I. Полуколичественный анализ содержания коллагеновых и неколлагеновых белков во внеклеточном матриксе после культивирования с АБК и ГК показал, что при действии АБК содержание кол-лагеновых и неколлагеновых белков в матриксе, формируемом дермальными фибробластами, повышается, а при действии ГК содержание коллагеновых белков снижается.
В организме млекопитающих фибробласты способны дифференцироваться в миофибробласты, играющие важную роль в заживлении ран. Оценка уровня синтеза основного маркёра миофибробластов a-SMA с помощью вестерн-блоттинга и подсчёт доли миофибробластов в популяции дермальных фибробластов с помощью иммуно-цитохимического выявления a-SMA показал, что АБК стимулирует увеличение уровня синтеза a-SMA и количества миофибробластов в популяции дермальных фибробла-стов, а при действии ГК уровень синтеза a-SMA снижается и количество миофибробластов уменьшается.
Таким образом, АБК стимулирует синтез и отложение коллагеновых и неколллагеновых белков дермальными фибробластами и повышает количество миофибробла-стов, что может быть использовано для ускорения заживления ран. В свою очередь, ГК подавляет синтез и отложение коллагеновых белков, что может быть использовано для подавления развития фиброза. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (гранты № 19-01500233 и 20-315-90118) в рамках научного проекта государственного задания МГУ № 121032300098-5.
ДЛИТЕЛЬНОЕ СОКУЛЬТИВИРОВАНИЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭФФЕКТОВ МИКРОГРАВИТАЦИИ
Е.А. Тырина, Л.Б. Буравкова
ГНЦ РФ - ИМБП РАН, Москва, Россия e-mail: eagolikovamsu@gmail.com
Ключевые слова: микрогравитация, сокультивирование, МСК, мононуклеары пуповинной крови.
Известно, что длительные космические полеты оказывает негативное влияние на гемопоэз, поэтому актуальными являются исследования влияния микрогравитации на гемопоэтические клетки различной степени коммитирования. Важная роль в поддержании гемопоэ-тического микроокружения принадлежит мезенхималь-ным стромальным клеткам (МСК), которые участвуют в создании ниши для пролиферации гемопоэтических предшественников. Целью данной работы было изучение эффектов 21-суточного моделирования микрогравитации в модели совместного культивирования гемопоэти-ческих клеток, выделенных из пуповинной крови, и МСК.
Мононуклеары пуповинной крови и МСК культивировали в течение 72 часов, после чего удаляли неадге-зированные клетки. МСК с ассоциированными к ним ге-мопоэтическими клетками продолжали культивировать в статическом контроле и на машине случайногопозици-онирования (RPM) в течение 21 суток. Оценивали количество суспензионной и адгезированной фракций гемо-поэтических клеток. С помощью проточной цитометрии определяли иммунофенотип ассоциированных с МСК клеток, а также клоногенный потенциал суспензионной фракции (количество колониеобразующих единиц — КОЕ).
После экспозиции на RPM количество ассоциатов МСК и гемопоэтических клеток не изменилось. При этом доля CD45+ клеток, в среднем, была в полтора раза ниже при моделировании эффектов микрогравитации. В составе МСК-ассоциированной фракции наблюдали снижение доли клеток моноцитарной и эритроидной линии, а также увеличение доли клеток гранулоцитарного ростка. Кроме этого, отмечалось снижение доли ранних гемопоэтических предшественников. Количество суспензионных клеток и содержащихся среди них КОЕ достоверно не изменилось после экспозиции на RPM. Однако произошло снижение доли унипотентных КОЕ-гранулоцитов и увеличение доли КОЕ-моноцитов. Общая клеточность колоний была идентичной в обеих группах. При этом иммунофенотипирова-ние колоний показало значительное снижение доли клеток эритроидной линии, что свидетельствует о более коммити-рованном составе эритроидных предшественников при моделировании эффектов микрогравитации.
Таким образом, 21-суточное моделирование эффектов микрогравитации в модели сокультивирования МСК и гемопоэтических клеток, приводило к снижению доли гемопоэтического компартмента, а также изменению соотношения и распределения клеток различных гемопоэтических ростков между фракциями. Снижение доли ранних гемопоэтических предшественников в МСК-ассоциированной фракции и клеточности эритроид-ных колоний в совокупности может свидетельствовать о преобладании коммитированности гемопоэтических клеток в условиях моделирования микрогравитации. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-29-04026.
ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ИНИЦИАЦИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК
П.А. Тюрин-Кузьмин, В.И. Чечехин, К.Ю. Кулебякин, В.С. Попов, Н.И. Калинина, В.А. Ткачук
Факультет фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
e-mail: tyurinkuzmin.p@gmail.com
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимные стро-мальные клетки, мезенхимные стволовые клетки, инициация дифференцировки, норадреналин, гормональная регуляция.
