УДК 577.3:621.384.8:547.495.9
МАС-СПЕКТРОМЕТРИЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ ОЛІГОМЕРНОГО СКЛАДУ ПОЛІГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНІДИНУ
А. В. Лисиця1
A. В. Ребрієв2
B. В. Поліщук1
інститут сільського господарства Західного Полісся НААН України, Рівне 2Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Київ
Е-mail: lysycya@ukr.net, rebriev@ukr.net
Отримано 26.07.2012
Наведено результати мас-спектрометричних досліджень олігомерного складу солей полігексаметиленгуанідину. Зазвичай полімерні похідні гуанідину використовують як дезінфектанти, проте в деяких випадках вони здатні підсилювати проліферативну активність клітин, можуть використовуватись у біотехнології для регуляції росту мікроорганізмів, а також стимулювати проростання насіння сільськогосподарських культур. Визначено будову чотирьох типів олігомерів полігексаметиленгуанідину лінійної структури, що відрізняються складом кінцевих груп. Ідентифікація за допомогою методу мас-спектрометрії складу і будови різних зразків полігексаметиленгуанідину дасть змогу краще зрозуміти механізми їхньої біологічної активності. У дослідженнях використано такі варіанти методу мас-спектрометрії, як MALDI-TOF-MS і TOF-PDMS. Встановлено, що аніонний склад солей полігексаметиленгуанідину має суттєве значення за іонізації в PDMS і неістотно впливає на якість мас-спектрів, отриманих методом MALDI.
Ключові слова: полігексаметиленгуанідин, олігомери, метод мас-спектрометрії.
Полімерні похідні гуанідину зазвичай використовують як дезінфектанти. Одним із типових представників цієї групи є полігексаметиленгуанідин (ПГМГ) (рис. 1). Біологічна активність ПГМГ зумовлена наявністю гуанідинових груп. Препарати ПГМГ ефективні щодо вегетативних форм бактерій, багатьох видів грибків та вірусів [1]. Завдяки полімерній природі похідні гуанідину менш токсичні і водночас мають вищу антимікробну активність порівняно з їх низькомолекулярними аналогами на зразок хлоргексидину.
Молекула ПГМГ може мати лінійну, розгалужену або частково замкнену форми [1]. Наприклад, методом часопролітної мас-спектрометрії з іонізацією електророзпилю-ванням (electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry, ESI-TOF MS) було встановлено структуру 3 типів молекулярних
Рис. 1. Структура молекули гідрохлориду полігексаметиленгуанідину
(маса мономера * 141 а.о.м.)
структур олігомерів ПГМГ лінійної будови
[2] і ще 4 типів замкненої або розгалуженої
[3]. Зазвичай маса молекул полімеру лежить у межах від кількох сотень до кількох тисяч а.о.м. і залежить від технології синтезу. Олігомерний склад препарату і будова функціональних кінцевих груп молекул полімеру можуть суттєво впливати на його біоцид-ну активність. Часто неоднорідність за масою, розмірами та формою молекул забезпечує синергізм протимікробної дії. Наприклад, низькомолекулярні складові полімеру легше долають ліпополісахаридний бар’єр клітинної стінки бактерії та руйнують її цитоплазматичну мембрану [4].
Крім того, відомо, що в багатьох випадках низькі концентрації полімерних похідних гуанідину здатні підсилювати проліферативну активність клітин, можуть використовуватись у біотехнології для регуляції росту мікроорганізмів, а також стимулювати проростання насіння сільськогосподарських культур [5]. Загалом слід зазначити, що біофізичні механізми дії ПГМГ на мембрани про- та евкаріотів на сьогодні вивчено недостатньо [6].
Метою досліджень було визначити за допомогою методу мас-спектрометрії (МС) будову і олігомерний склад кількох синтезованих нами солей ПГМГ, які застосовують
під час виготовлення дезінфектантів і стимуляторів проростання насіння.
Для цього використовували такі методи, як часопролітна плазмово-десорбційна мас-спектрометрія (fame-of-fUght plasma desorption mass spektrometry, TOF-PDMS) [7, 8] і мас-спектрометрія, яка базується на мат-рично-активованій лазерній десорбції/іонізації з часопролітним аналізатором (matñx-assіsted laser desorbtaon/ ^rnsaUon
tіme-of-flіght mass speсtrometry, MALDI-TOF MS) [9]. Обидва методи відзначаються порівняно м’яким типом іонізації і дозволяють отримувати на мас-спектрах чіткі піки молекулярних іонів або протонованих молекул. Відомо, що MALDI може застосовуватись для характеристики молекулярно-масового розподілу олігомерів (полістиролу, поліметилакрилату, поліетиленгліколю та ін.), для вивчення різних механізмів ініціювання і обриву ланцюга у процесі синтезу полімерів, для визначення функціональних кінцевих груп у полімері тощо [10]. За допомогою методу PDMS можна ідентифікувати біологічно активні сполуки різних класів та визначати їхню будову [11,12].
Матеріали і методи
Дослідження проводили на мас-спектрометрі біохімічному МСБХ-01 з іонізацією зразка уламками ділення ядер 252Cf (ВАТ «SELMI», Суми, Україна). Під час підготовки нітроцелюлозної матриці використовували спеціальний пристрій електронапилення зразків УНП-2 (ВАТ «SELMI», Суми, Україна). Підготовку зразків до мас-спектро-метричних досліджень і самі експерименти здійснювали згідно з методиками для PDMS [12-14]. Використовували прискорювальні напруги МСБХ-01 від +10 кВ до -10 кВ. При цьому реєстрували переважно мас-спектри позитивних іонів, які є більш інформативними. Об’єм накопичуваних даних процесу розпаду 252Cf (стартів) становив від 5 000 до 15 000, ширина каналу детектування —
1 нс/канал. Оброблення спектрів виконували за допомогою спеціальної комп’ютерної програми керування, накопичення та обчислення даних (МСБХ, версія 4.0/m). На масспектрах по вісі абсцис позначено m/z, тобто відношення маси іона (m) до його заряду (z), ординат — відносна інтенсивність піків, яка пропорційна кількості накопичених іонів.
Дослідження методом MALDI-TOF проводили на спектрометрі Voyager DE PRO (Apphed Bwsystems, США). Застосовували
Н+-матричну іонізацію поліалкіленгуаніди-ну за допомогою 2,5-дигідроксибензойної кислоти (DHB, Fluka, Швейцарія) під дією лазерного опромінення. Концентрація DHB у матричному реагенті становила 1 мг/мл, реактив розводили у розчині, що складався з однакових об’ємів метанолу (Sigma-Aldrich, США) та води. Співвідношення матричного реагенту до досліджувального зразка 1:1 (за об’ємом). Застосовували рефлекторний режим роботи часопролітного детектора мас-спектрометра з прикладеною напругою 20 кВ. Отримані спектри обробляли за допомогою програми Data Explorer 4.0 (Applied Biosystems, США). Вимірювали моноізотоп-ні значення протонованих молекул, для усереднення використовували дані від 4 до 10 мас-спектрів.
Солі ПГМГ було синтезовано поліконденсацією гексаметилендіаміну і гуанідину. Зразки розчиняли в суміші вода-етанол (1:1), для аналізу зазвичай послуговувалися розчинами 1%-ї концентрації.
Результати та обговорення
Встановлено, що характери мас-спектрів MALDI для солей ПГМГ різного аніонного складу суттєво не відрізняються. На рис. 2, 3 наведено мас-спектри ПГМГ хлориду і ПГМГ сукцинату, відповідно. Найкраще видно іонізацію молекул в діапазоні мас від 500 до 1000 а.о.м. На мас-спектрах чітко простежуються послідовності піків іонів з різницею Am/z = 141, що відповідає масі одного мономера (рис. 1).
Наприклад, для ПГМГ хлориду (рис. 2) це така послідовність піків (серія І): m/z 541, m/z 682, m/z 823 і m/z 964. Аналіз молекулярної будови ПГМГ показує, що ця серія піків протонованих молекул [М+Н]+ відповідає олігомерам такої будови (n = 3, 4,
5, 6):
Н-,М - [- К Hv if, - ЫН - г - ЫН - |г, - iC HvV, - ЫН: .
II
NH
Аналіз серії ІІ (піки m/z 583, m/z 724 і m/z 865) дає підстави стверджувати, що це такі протоновані молекули (n = 4, 5, 6):
H2N-[-(СН2)е-NH -С -NH -]n-H.
II
NH
Аналогічні серії піків іонів наявні також на мас-спектрах солей ПГМГ з янтарною (рис. 3) кислотою.
Рис. 2. Хлорид полігексаметиленгуанідину 1%, мас-спектр MALDI
Рис. 3. Сукцинат полігексаметиленгуанідину 1%, мас-спектр MALDI
Менш помітними для ПГМГ хлориду є серія ІІІ (ш/г 566 і ш/г 707) та серія IV (ш/г 625 і ш/г 766). На мас-спектрах ПГМГ сукци-нату це, відповідно, ш/г 567 (протонована молекула олігогексаметиленгуанідину, [М+Н+], Дш/г = 1) і ш/г 707 (серія ІІІ), та ш/г 625, ш/г 766 (серія IV). Серія ІІІ, на нашу думку, належить таким олігомерам (п = 4, 5):
А серія IV точно відповідає протонованим молекулам [М+Н]+ (п = 4, 5) такої будови:
Н:і, - СН -НІЧ - [- (СН:>, - МН - - МН - ]г, - н.
І II
ІМН2 N4
Із застосуванням методу PDMS з’ясували, що серед різних випробуваних нами солей ПГМГ найкраще відбувається іонізація ПГМГ малеату. Зразок наносили на матрицю з нітроцелюлози, яку електростатично напилювали на позолочену металеву підкладку. На мас-спектрі (рис. 4) присутні піки протонованих молекул олігомерів [М+Н]+: ш/г 301, 442, 583, 724, 865 і 1006 (п = 2, 3,
4, 5, 6), аналогічні серії ІІ, яку було визначено методом MALDI.
Щодо інших солей ПГМГ, то отримати достатньо якісні мас-спектри PDMS для них було досить складно. На нашу думку, це пов’язано з присутністю у зразках значної кількості низькомолекулярних сполук і солей лужних металів. Окрім того, малеїнова кислота, на відміну від хлоридної або янтарної, є кращим донором електрону. Подібні сполуки здатні полегшувати процес десорбції в PDMS і збільшувати вихід прото-нованих іонів [12].
Таким чином, з’ясували, що як і в разі інших полімерів за допомогою методів MALDI і PDMS на мас-спектрах ПГМГ можна одержати чіткі піки олігомерів. Іони що їх виявлено в діапазоні мас 300-1600
а.о.м., дають змогу ідентифікувати кілька типів олігогексаметиленгуанідинів лінійної форми.
На мас-спектрах, отриманих методом MALDI, за характером кінцевих груп виділено лінійні олігомери ПГМГ 3 типів: одна гуанідинова і одна аміногрупа (тип А), дві аміногрупи (тип В), дві гуанідинові групи (тип С) [2, 3]. Аналогічні групи характерні й для поліоксіалкіленгуанідину [15]. Нами вперше серед олігомерів ПГМГ ідентифіковано компонент амфіфільної будови (серія ІІІ). На нашу думку, завдяки цій складовій препарат набуває властивостей поверхнево-активної речовини.
Оскільки різні солі ПГМГ мають різну антибактеріальну активність [1, 16], це може бути пов’язано не лише з відмінностями у формі молекул полімеру (видовжена або глобулоподібна), яка залежить від типу
Рис. 4. Малеат полігексаметиленгуанідину 1%, мас-спектр PDMS
аніона, а й із різним олігомерним складом зразків. Вивчення за допомогою мас-спек-трометрії, будови і складу різних препаратів ПГМГ уможливить краще розуміння механізмів їхньої мембранно-тропної активності.
Отже, нами вперше отримано мас-спектри TOF-PDMS для ПГМГ, а методом MALDI-TOF М8 визначено його олігомерний склад. На мас-спектрах чітко простежується різниця ш/г = 141, що відповідає масі мономера. З’ясовано, що аніонний компонент різних зразків ПГМГ для методу MALDI не має такого лімітуючого значення, як для
ЛІТЕРАТУРА
1. И. И. Воинцева, П. А. Гембицкий. Полигуанидины — дезинфекционные средства и полифункциональные добавки в композиционные материалы. — М.: ЛКМ-пресс, 2009. — 304 с.
2. Albert M., Feiertag P., Hayn G. еt al. Structure Activity Relationships of Oligoguani-dines Influence of Counterion, Diamine, and Average Molecular Weight on Biocidal Activities // Biomacromolecules. — 2003. — V. 4, № 6. — P. 1811-1817.
3. Wei D., Ma Q., Guan Y. еt al. Structural characterization and antibacterial activity of oli-goguanidine (polyhexamethylene guanidine hydrochloride) // Mat. Sci. Eng. — 2009. — V. 29, № 6. — P. 1776-1780.
4. Gilbert P., Pemberton D., Wilkinson D. E. Synergism within polyhexamethylene biguanide biocide formulations // J. Appl. Bacteriol. — 1990. — V. 69. — P. 593-598.
5. Лисиця А. В. Стимулюючі властивості полігексаметиленгуанідину // Тез. докл. научно-практ. конф. «Биологически активные вещества: фундаментальные и прикладные вопросы получения и применения», Новый Свет, Крым, Украина, 23-28 мая 2011. — К., 2011. — С. 749, 750.
6. Лисиця А. В. Механізми бактерицидної дії полігексаметиленгуанідину // Наук. доп. Нац. ун-ту біоресурс. природокор. України. — 2011, № 3 (25). Електр. вид.: http://www.nbuv.gov.ua/e-journals/Nd/ 2011_3/11lav.pdf.
7. Macfarlane R. D., Torgerson D. F. 252-Cf-Plasma DesorpUon Tme-of-FHght Mass Spectroemtry // !nt. J. Mass Spectrom. !on Ph. — 1976. — V. 21. — P. 81-92.
8. Сысоев А. А., Артаев В. Б. Масс-спектромет-рия с ионизацией осколками деления ядер калифорния-252 // Журн. анал. хим. — 1991. — Т. 46, № 1. — С. 6-18.
9. Li Liang. Maldi Mass Spectrometry for Synthetic Polymer Analysis. Chemical
РБМ8. Встановлено, що молекулярний склад синтезованих нами зразків полімеру неоднорідний. Визначено декілька типів олігогексаметиленгуанідинів. Олігомери ПГМГ відрізняються не лише за кількістю мономерних ланок, а й за будовою кінцевих груп. Це може суттєво впливати як на антимікробну, так і на ростостимулювальну активність препаратів. Отримані результати дають змогу краще зрозуміти біофізичні механізми дії полімерних похідних гуанідину на мембрани про- та евкаріот, на проліфе-ративну активність клітин мікро- і макроорганізмів.
Analysis: A Series of Monographs on Analytical Chem (V. 175). — John Wiley & Sons, 2009. — 304 p.
10. Аверко-Антонович И. Ю., Бикмуллин Р.Т. Методы исследования структуры и свойств полимеров . — Казань: КгТу, 2002. — 604 с.
11. Бондаренко П. В., КнышА. H., Зубарев Р. А., Розынов Б. В. Особенности пробоподготов-ки и анализа белков на новом масс-спектрометре с ионизацией осколками деления калифорния-252 // Применение масс-спектрометрии в биологии и медицине. — Харьков: ФТИНТ, 1992. — С. 56-57.
12. Лисиця А. В. Фізико-хімічна характеристика біологічно активних речовин за даними часопролітної плазмово-десорбційної мас-спектрометрії: Автореф. дис... канд. біол. наук: 03.00.02 / Київський нац. ун-т імені Тараса Шевченка. — К., 2002. — 19 с.
13. Деклараційний патент 47720 А Україна, МПК G01N33/50. Спосіб визначення хімічної сумісності біологічно активних речовин за допомогою мас-спектрометрії /
А. В. Лисиця, М. С. Мандигра (UA). — 2001085672; Заявл. 09.08.2001; Опубл. 15.07.2002, Бюл. №7.
14. Мандигра М. С., Лисиця А В., Дмитрієв І. М. Метод мас-спектрометрії як один із підходів до розробки і випробування нових лікувально-профілактичних препаратів // Наук.-техн. бюл. Інст. біол. твар. ДНДКІ ветпрепа-ратів та кормових добавок. — Львів. — 2005. — Вип. 6, № 3. — С. 259-264.
15. Feiertag P., Albert M., Ecker-Eckhofen E.-M. еt al. Structural Characterization of Biocidal Oligoguanidines / // Macromol. Rap. Commun. — 2003. — V. 24, N 9. — P. 567-570.
16. Мандигра М. С., Лисиця А В., Степаняк І. В. та ін. Порівняльна оцінка бактерицидної активності різних похідних гуанідину / // Наук. вісн. Львів. нац. ун-ту вет. мед. біо-технол. ім. С. Ґжицького. — 2009. — Т. 11. № 2 (41). — Ч. 2. — С. 220-226.
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОЛИГОМЕРНОГО СОСТАВА ПОЛИГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИНА
А. В. Лисица1 А. В. Ребриев2
В. В. Полищук1
1Институт сельского хозяйства Западного Полесья НААН Украины, Ровно 2Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
E-mail: lysycya@ukr.net, rebriev@ukr.net
Приведены результаты масс-спектрометрических исследований олигомерного состава солей полигексаметиленгуанидина. Полимерные производные гуанидина используют в качестве дезинфектантов, но в ряде случаев они способны усиливать пролиферативную активность клеток, могут использоваться в биотехнологии для регуляции роста микроорганизмов, а также стимулировать прорастание семян сельскохозяйственных культур. Определено строение четырех типов олигомеров полигексаметиленгуанидина линейной структуры, которые отличаются по составу конечных групп. Идентификация с помощью метода масс-спектрометрии состава и строения различных образцов полигексаметиленгуани-дина позволит лучше понять механизмы их биологической активности. В исследованиях использованы такие варианты метода масс-спектрометрии, как MALDI-TOF MS и TOF-PDMS. Установлено, что анионный состав солей полигексаметиленгуанидина имеет существенное значение при ионизации в PDMS и оказывает незначительное влияние на качество масс-спектров, полученных методом MALDI.
Ключевые слова: полигексаметиленгуанидин, олигомеры, метод масс-спектрометрии.
MASS-SPECTROMETRY STUDIES OF OLIGOMERES COMPOSITION OF POLYHEXAMETHYLENEGUANIDINE
V. Lysytsya1 A. V. Rebriev2 V. V. Polischuk1
Agriculture Institute of West Polissya of National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine, Rivne 2Palladian Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: lysycya@ukr.net, rebriev@ukr.net
The results of mass-spectrometry studies of oligomere composition of polyhexamethy-leneguanidine salts are given. Although polymer derivatives of guanidine are commonly applied as disinfectants, they are also capable to increase cell proliferation activity, regulate growth of microorganisms in biotechnology and stimulate germination of agriculture seeds. We have defined a construction of four types of oligomeres for polyhexamethyleneguanidine linear structure. They differ in composition of final groups. The identification, by means of mass-spectrometry, composition and constructions of the different sample polyhexamethyl-eneguanidine will hereinafter allow understanding the mechanisms of their biological activity. The variants of the mass-spectrometry method MALDI-TOF MS and TOF-PDMS were used. We have found that anion composition of polyhexa-methyleneguanidine salts has a vital importance when ionizing in PDMS and little effect upon quality of the mass-spectra got by MALDI method.
Key words: polyhexamethyleneguanidine, oligomeres, mass-spectrometry method.