CC BY
268
УДК 579.852.11.222
МІКРОБНІ а-АМІЛАЗИ: ВИДІЛЕННЯ, ВЛАСТИВОСТІ, ПРАКТИЧНЕ ЗАСТОСУВАННЯ
Л. Д. ВАРБАНЕЦЬ, К. В. АВДІЮК, Н. В. БОРЗОВА Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ
E-mail: [email protected]
а-Амілази — одна з найбільших родин глікозидгідролаз, трансфераз та ізомераз, що належать до клану GH-H. Ферменти цієї родини окрім а-1,4-, а-1,6-зв’язків здатні гідролізувати а-1,1-, а-1,2-, а-1,3-, а-1,5-гліко-зидні зв’язки, містять 4 незамінні залишки амінокислот (Авр204, Авр206, Glu230, Авр297) і мають (Р/а)8 або ТІМ-ЬаггеІ каталітичний домен. Обговорюються питання щодо методів виділення і очищення а-амілаз, які охоплюють осадження органічними розчинниками і нейтральними солями, діаліз, ультрафільтрацію, гель-фільтрацію, хроматографію, електрофорез тощо. Наведено сучасні дані щодо можливості продукування а-амілаз мікроорганізмами різних таксономічних груп, зокрема бактерій, мікроміцетів. Докладно висвітлюються фізико-хімічні властивості а-амілаз, їхні рН- та термооптимуми, рН- та термостабільність, молекулярні маси, вплив іонів металів і різних хімічних реагентів. Розглядається можливість використання а-амілаз у різних галузях промисловості (спиртовій, крохмале-патоковій, хлібопекарській, кондитерській, текстильній, паперовій тощо), а також у медицині.
Ключові слова: а-амілази, фізико-хімічні властивості, практичне використання.
В останні роки розширюються можливості використання мікроорганізмів як біотехнологічних джерел промислово важливих ферментів. Крохмальдеградуючі ферменти, зокрема амілази, привертають увагу дослідників завдяки їх технологічній важливості й економічній вигідності. Вони характеризуються широким спектром застосування в різних галузях, таких як клінічна, медична і аналітична хімія, у цукрофікації крохмалю, текстильній, харчовій, бродильній, фармацевтичній, паперовій, пивоварній і спиртовій промисловості. Амілази становлять близько 30% світової продукції ферментів [1]. Унаслідок підвищених потреб у цих ферментах в різних галузях промисловості існує величезний інтерес в одержанні ферментів з поліпшеними властивостями, зокрема такими, як здатність деградувати грубий (сирий) крохмаль, що робить їх придатними для застосування в деяких ефективних, але не дуже високовартісних технологіях. Особливості технологічних процесів у багатьох промислових виробництвах, де використовують амілолітичні ферменти, а саме у спиртовому, крохмале-патоковому, пивоварному, текстильному, целюлозно-паперовому, потребують використання комплексних ферментних препаратів, які були
б стійкими до підвищених температур і здатними гідролізувати сировину при 80-100 0С. Перевагами високотемпературного процесу є суміщення клейстеризації крохмалю і його ферментативного гідролізу, зниження дозування ферментів, скорочення тривалості конверсії крохмалю, підвищення виходу кінцевого продукту, зменшення собівартості процесу. Здатність до біосинтезу термостабільних амілолітичних ферментів у природних штамів виявляють рідко.
а-Амілази належать до глікозидгідролаз — ферментів, здатних метаболізувати різноманітні сахариди. Їх було поділено на класи (групи) — за механізмом дії, а також на родини — на основі подібності їхньої амінокислотної послідовності. Так, існує 4 класи глікозидаз: 1) ендоамілази, які розщеплюють внутрішні а-1,4-зв’язки, утворюючи а-аномерні сполуки; 2) екзоамілази, що гід-ролізують а-1,4- або а-1,6-зв’язки у термінальних залишках глюкози, утворюючи а-або в-аномерні продукти; 3) ферменти, які відщеплюють виключно розгалужені а-1,6-зв’язки, утворюючи лінійний полісахарид; 4) трансферази, що розщеплюють а-1,4-гліко-зидні зв’язки донорної молекули і переносять частину донора до глікозидного акцептора з утворенням нового глікозидного зв’язку [2].
Концепцію такої групи ферментів, як а-амілази (EC 3.2.1.1; 1,4-а-О-глюкан глюка-ногідролаза), було запропоновано в 1992 р. рядом авторів [3]. Це — одна з найбільших родин глікозидгідролаз, трансфераз та ізо-мераз, до якої належать близько 30 різних специфічностей. Згідно із зазначеною концепцією, а також відповідно до сучасної ситуації [4, 5] члени цієї родини мають задовольняти таким вимогам: 1) виявляти гліколітичну активність, розщеплюючи а-глюкозидні зв’язки з утворенням а-аномерних моно-і олігосахаридів, або трансглікозилюючу активність, внаслідок якої утворюються а-1,4-або а-1,6-глікозидні зв’язки або комбінація обох активностей; 2) серед 14 кланів (A-N), які визначено для глікозидаз і трансгліко-зидаз, родина а-амілаз (1,4-а-О-глюкан глюканогідролаз) (GH-13) належить до восьмого клану (GH-H), який охоплює родини
13, 70 і 77. Представники одного клану характеризуються однаковою тривимірною структурою каталітичного домена, але з обмежено подібною послідовністю. Це свідчить про те, що білкова структура еволюційно краще захищена, ніж амінокислотна послідовність; 3) ферменти цієї родини можуть гідролізувати, крім а-1,4- і а-1,6-зв’язків, також а-1,1-, а-1,2-, а-1,3- і а-1,5-глікозидні зв’язки; 4) взаємозв’язки головної родини а-амілаз (клан GH-H) з родиною екстремофільних а-амілаз, родиною гліко-зидгідролаз 57 поки ще ані підтверджено, ані спростовано; 5) тільки 4 залишки амінокислот мають бути незамінними для представників усієї родини (Asp204, Asp206, Glu230 і Asp297, нумерація як у така-амілази). Деякі з цих консервативних амінокислот утворюють каталітичний центр, а деякі залучаються до стабільності консервативної топології TIM-barrel; 6) мати (в/а)8 або TIM-barrel (бочонок тріозофосфатізоме-разного типу) каталітичний домен; 7) 4 консервативні ділянки послідовностей, які присутні у ланцюгах Р3, Р4, Р5 і Р7 каталітичного (в/а)-Ьагге1 домена, було ідентифіковано, їх використовують для визначення родини а-амілаз. В останні роки дослідники [6] встановили наявність трьох додаткових ділянок консервативної послідовності, дві з яких розташовані на ланцюгах Р2 і Р8 каталітичного (в/а)-Ьагге1 і одна — поблизу С-кінця домена В у ^3-а3-зв’язку каталітичного (в/а)-Ьагге1. Тимчасом як 4 ділянки первісно консервативної послідовності містять каталітичні і субстратзв’язувальні залишки індивідуальних членів родини, останні 3 ділянки консервативної послідов-
ності містять амінокислотні залишки, які зумовлюють специфічність даного ферменту. Автори припускають, що ферменти родини а-амілаз мають бути охарактеризовані як такі, що містять так багато ділянок консервативної послідовності, як тільки можливо.
Відомо, що ферменти родини а-амілаз містять 3 суттєвих каталітичних залишки Asp206, Glu230 і Asp297, які строго консервативні як в амінокислотній послідовності, так і в тривимірній структурі. Мутагенез будь-якого із цих залишків на іншу амінокислоту призводить до майже повної втрати активності. Функціональні ролі G1u230 і Asp206, як прийнято вважати, такі, що беруть участь у каталізі як кислота (донор протона) і луг (нуклеофіл), відповідно. Однак критичну роль третього залишка Asp297 не було описано. Автор [7] показав, що Asp297 централізовано працює для зв’язування субстрату, що призводить до деформації кальцію субстрату в точці розщеплення, яка є цілковито необхідною для каталізу. Таким чином, показано роль цього залишка як «фіксатора» в каталізі а-амілазних ферментів.
У табл. 1 наведено відомі на сьогодні глікозилгідролази родини 13 [8].
а-Амілази ізолюють із різних біологічних джерел: тварин (панкреатична або слинна), злакових (пшениці або ячменю), грибів (види Aspergillus) і бактерій (види Bacillus). До бактеріальних а-амілаз належать такі, що працюють як при нормальній температурі (представники B. subtilis), так і при дуже високих температурах (B. licheni-formis). а-Амілази каталізують розщеплення а-1,4-глікозидних зв’язків в амілозі й амілопектині, які є первинними компонентами очищених крохмалів, що їх використовують під час приготування тіста. Вони зумовлюють швидке зменшення довжини полімера крохмалю. Утворювані фрагменти є олігосахаридами, які розчинні у воді й надто короткі, щоб зберігати здатність до адгезії.
а-Амілази відіграють суттєву роль у метаболізмі а-глюкану. Кристалічну структуру раніше не ідентифікованої амілази (AmyC) з Thermotoga maritima було визначено за MAD (Multi-wavelength anomalous dispersion). Цей метод застосовують у Х-променевій кристалографії [9]. У AmyC відсутня послідовність, яка аналогічна канонічним а-амілазам, що належать до родин гідролаз 13, 70 і 77, однак виявляють суттєву подібність із групою ще не охарактеризованих білків у COG1543, і споріднена
Таблиця 1. Відомі глікозидгідролази родини 13 [8]
Фермент Номер згідно ЕС Головний субстрат
Амілосахараза 2.4.1.4 Сахароза
Сахарозофосфорилаза 2.4.1.7 Сахароза
Глюканрозгалужувальний фермент 2.4.1.18 Крохмаль, глікоген
Цикломальтодекстрин глікозилтрансфераза 2.4.1.19 Крохмаль
Аміломальтаза 2.4.1.25 Крохмаль, глікоген
а-Амілаза, що утворює мальтопентаозу 3.2.1 Крохмаль
а-Амілаза 3.2.1.1 Крохмаль
Оліго-1,6-глюкозидаза 3.2.1.10 1,6-а-О-зв’язки у деяких олігосахаридах
а-Глюкозидаза 3.2.1.20 Крохмаль
Амілопулулоназа 3.2.1.41 Пулулан
Цикломальтодекстриназа 3.2.1.54 Лінійний і цикломальтодекстрин
Ізопулулоназа 3.2.1.57 Пулулан
Ізоамілаза 3.2.1.68 Амілопектин
а-Амілаза, яка утворює мальтотетраозу 3.2.1.60 Крохмаль
Глюкодекстраназа 3.2.1.70 Крохмаль
Трегалозо-6-фосфатгідролаза 3.2.1.93 Трегалоза
а-Амілаза, яка утворює мальтогексаозу 3.2.1.98 Крохмаль
а-Амілаза, яка утворює мальтозу 3.2.1.133 Крохмаль
Неопулуланаза 3.2.1.135 Пулулан
Мальтоолігозилтрегалозогідролаза 3.2.1.141 Трегалоза
Мальтоолігозилтрегалозосинтаза 5.4.99.15 Мальтоза
з родиною гліцеролгідролаз 57 (GH-57). AmyC виявляє риси, характерні для а-амі-лаз, такі, зокрема, як скривлена TIM-barrel структура, утворена 7 в- і а-геліксами (домен А) та двома додатковими, але менш консервативними доменами. Один із них — домен В, який містить 3 гелікси, які вставлені в TIM-barrel після в-гелікса 2, а другий — домен С, у якого 5 геліксових зон на С-кінцях. Цікаво, що, незважаючи на помірну спорідненість гомології, порівняння структур виявило значну спорідненість із членами GH-57, які характеризуються добре відомою тривимірною структурою 4-глюканотрансфе-рази Thermococcus litoralis, і навіть більшу спорідненість зі структурою ферменту невідомої функції Thermus thermophilus.
Методи виділення й очищення а-амілаз
Оскільки а-амілаза у більшості мікроорганізмів є екстрацелюлярним ферментом, то операції з її виділення й очищення зводяться до такого:
1) відділення клітинної біомаси від куль-туральної рідини;
2) очищення і концентрування розчинів, які містять вихідний фермент, за допомогою вакуум-концентрування, осадження з розчинів органічними розчинниками та нейт-
ральними солями, діаліз, ультрафільтрація, гель-фільтрація, електрофорез, хроматографія тощо.
І. П. Галич [10] розробила спосіб одержання високоочищеного препарату а-амілази
А. огугає, який за основними властивостями відповідає кристалічному. Метод складається з дуже простих операцій (осадження спиртом, стабілізація іонами Са2+, висолювання сульфатом амонію та діаліз) і дозволяє отримати фермент з виходом 50-60 % за активністю, що в 3-4 рази перевищує вихід у разі кристалізації. Запропонований спосіб може стати основою виробничого одержання ферменту з метою його використання в медицині і в деяких галузях харчової промисловості. Препарати високоочищеної а-амілази мали амілолітичну активність 5 040-5 400 одиниць, містили 70-71% білка, 12-13% вуглеводів, 8-10% пептидів, 6-7% вологи і 3-4% золи.
Очищення а-амілази з іншого штаму
А. огугає [11] проводили шляхом діалізу фільтрату глибинної культури і подальшою хроматографією на колонці з ДЕАЕ-целюло-зою. Кількість а-амілази в отриманій фракції становила близько 90% від загальної кількості ферменту, який наносили на колонку, і більше 20% від загальної кількості білка. Подальше очищення ферменту здійснювали
методом гель-хроматографії на колонці з се-фадексом G-100. У результаті вдалося відокремити фермент від залишкової кількості неактивних білкових домішок. На очищеному ферменті встановлено, що кінцевою амінокислотою є аланін.
Колонковий метод на основі використання пористого технічного катіоніту КМ-2ПК було застосовано для виділення а-амілази з культуральної рідини А. огугає. Попереднє введення іонів кальцію в матрицю катіоніту підвищувало сорбційну ємність та селективність зв’язування і забезпечувало збереження нативної структури ферменту, оскільки макромолекула а-амілази містить у своїй структурі декілька атомів кальцію, які стабілізують її активну конформацію. Уперше було показано, що сорбційна іммобілізація на полімерах, які мають у своїй структурі позитивно і негативно заряджені групи, запобігає афінній десорбції амілази розчином субстрату. У результаті на основі використання амілаз, що іммобілізовані на каучукових катіонітах (СКН), було створено колонковий реактор, який був здатен працювати протягом 10-12 днів, і показано можливість використання зв’язаних амілаз для ферментативного гідролізу крохмалю. Препарати іммобілізованих амілаз залишались активними під час зберігання в замороженому стані протягом року [12].
У процесі вивчення амілолітичної активності А. иіцєг-475 досліджуваний розчин ферментного препарату одержували осадженням фільтрату глибинної культури чотирма об’ємами етилового спирту і наступним діалізом осаду, після чого його піддавали розділенню на колонці з ДЕАЕ-целюлозою. У такий спосіб було отримано препарат, який складався з двох білків — а-амілази і глю-коамілази. Питома активність а-амілази після хроматографії на іонообміннику зросла з 0,25 Од -мл-1 до 1,2 Од -мл-1 [11].
Виділення а-амілази з гриба А. flavipєs, добутого з морської води, здійснювали, вдаючись до стандартних методів — хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі й сефадексах G-75, G-100. У результаті одержали три фракції амілаз з різними фізико-хімічними властивостями [13].
В. М. Шкуматов зі співавт. [14] розробили схему отримання з культуральної рідини
В. subtilis а-амілази у гомогенному стані, яка включала такі стадії очищення, як фракціонування сульфатом амонію, іонообмінну та гель-хроматографію.
Н. А. Кічакова [15] для розділення та очищення амілолітичних ферментів, що синте-
зуються штамом Bacillus sp. 86, застосовувала класичні методи білкової хімії: фракціонування білків насиченим розчином сульфату амонію, іонообмінну й афінну хроматографію, гель-фільтрацію. На етапі видалення протеїназ, які майже завжди утворюються паралельно з амілазами, із ферментного розчину хроматографією на бацитрацин-сило-хромі здійснили розділення амілолітичних ферментів на дві фракції. Ці ферменти були очищені до гомогенного стану. Перший із них становив типову а-амілазу Bacillus. Другий, який поряд з амілолітичною виявляв і пулуланазну активність, імовірно, належить до пулуланаз, однак не виключена можливість, що це амілаза, яка розщеплює
1,4-глюкозидні зв’язки у крохмалі й пулулані.
Комбінація методів хроматофокусування і гель-фільтрації дозволила здійснити ефективне очищення а-амілази із B. licheniformis. Ls застосуванням вищезазначених методів фермент було очищено у 77 разів [16].
Фізико-хімічні та каталітичні властивості амілаз
Відомо, що продуцентами амілаз є мік-роміцети (Aspergillus, Penicillium, Mucor) і бактерії (Bacillus). Дані щодо деяких їхніх фізико-хімічних властивостей наведено в табл. 2.
Дослідження а-амілаз А. flavus, A. awa-mori та A. oryzae [17] показало, що вони характеризувались однаковими значеннями рН-оптимумів активності 5,0-5,25; зона їхньої рН-стабільності — 6,0-8,0; точка найбільшої стійкості — 7,0. Усі три а-амілази стабільні при кімнатній температурі, утім фермент А. flavus був стійкішим до нагрівання, ніж A. awamori та A. oryzae, і при 55 0С протягом 1 год зберігав 70% вихідної активності. Tемператyрний оптимум а-амілази
А. flavus — 50 0С, а а-амілаз A. awamori та
A. oryzae — 40 0С. Стабільність досліджуваних ферментів до теплової денатурації підвищувалась у присутності субстрату (крохмалю). Галогеніди у концентрації 0,25 М не стабілізували а-амілази, а навпаки, прискорювали їх інактивацію. Цей вплив зростав у послідовності Cl- < Br- < F- < I- і притаманний усім трьом ферментам. Сечовина концентрацією від 1,0 до 6,0 М денатурувала білки. !нактивуюча дія була більш вираженою для а-амілаз A. awamori та A. oryzae, стійкішим був фермент із А. flavus. EДTA — сильний інгібітор усіх трьох а-амілаз, а атоми кальцію — важливі для їхньої активності й стабільності.
Таблиця 2. Фізико-хімічні властивості деяких а-амілаз
Молекулярна маса, кДа Оптимум дії
Джерело виділення рН t, 0С Інгібітор Активатор
Aspergillus flavus A. awamori A. oryzae [17] — 5,0—5,25 50 40 40 EДTА Ca2+
A. flavipes [18] 1 2 3 50 63 50 6,0—7,5 5,5 5,5; 7,5 30—50 30—50 60—80 EДTА Cu2+, Zn2+, Co2+ Ca2+
A. niger [19] — 4,0 50-55 — —
Bacillus sp. 86 [21] 83—90 6,0; 8,5 85—90 — —
Bacillus sp. PN5 [22] — 10,0 90 — —
B. subtilis [24] 48 Zn2+, Fe2+, Pb2+, Hg2+, Mg2+, Cd2+, Cu2+
B. subtilis JS-2004 [25] — 7,0 50 Cu2+, Hg2+, Co2+ Ca2+
B. licheniformis MIR-61 [26] — 7,0 45 —
Geobacillus thermodenitrificans HR-010 [32] 58 5,5 80 EГTА, EДTА
Thermomyces lanuginosus F1 [35] 55 4,0 — Гуанідин-HCl, сечовина, EДTА 2+ ,2+ Mn n2 , 2+ F 3 5“
Примітка: «—» — даних нема; EГTА — етиленглікольтетраацетат; EДTА — етилендіамінтетраацетат.
Оскільки мікробна конверсія крохмалю і дотепер залишається одним із важливих напрямів досліджень у біотехнології, для удосконалення біотехнологічних процесів необхідним є пошук високоефективних амі-лолітичних ферментів з новими властивостями. Так, автори [18] із 245 штамів морських грибів відібрали перспективний продуцент позаклітинних амілаз — Aspergillus flavipes і показали, що залежно від умов культивування він здатен продукувати різні амілолі-тичні комплекси. На живильному середовищі, яке містить пептон і дріжджовий екстракт (рН 7,0), A. flavipes синтезував три форми амілази, які відрізнялись оптимумом рН. Зміна початкового значення рН середовища (8,6) або видалення з живильного середовища пептона супроводжувалось утворенням однієї з форм ферменту. Присутність протеолітичних ферментів знижувала активність ізольованих форм амілаз. У разі внесення в живильне середовище інгібітору протеаз діізопропілфторфосфату синтезувалась нова форма амілази з оптимумом рН 5,5 та 7,5, максимальною активністю при 60-80 0С і високою стабільністю. Амілаза 1 виявляла активність у широкому діапазоні значень рН (5,5-8,0), оскільки становила суміш двох молекулярних форм: кислої (м.м. 50 кДа, оптимальне значення рН 6,0, термооптимум 30-50 0С) і лужної (м. м. 14,5 кДа, оптимум
рН 7,5, термооптимум 30-50 0С) амілаз. Амілаза 2 мала характерні для більшості грибних амілаз властивості: м. м. 63 кДа, оптимум рН 5,5, максимальна активність у діапазоні температур 30-50 0С і температурна стабільність до 50 0С. Однак досліджувані форми амілаз були нестабільними у процесі виділення внаслідок присутності протеолітичних ферментів. Амілаза 3 (м. м. 50 кДа) помітно відрізнялась від вищезазначених форм ферменту. Вона виявляла активність у широкому діапазоні рН (5,5-8,5), два максимуми активності при 5,5 і 7,5 і температурі 60-80 0С, мала високу термостабільність (70 0С) і зберігала початкову активність упродовж 20 днів при температурі 22 0С за обох значень рН. Амілаза 3 була ме-талозалежним ферментом, її активність підвищували іони Са2+ і Mg2+, інгібували — ЕДТА й деякі метали — Си2+, Zn2+, Со2+. На відміну від амілаз морських бактерій, амілаза морського гриба А. flavipes виявляла стійкість до екстремально високих концентрацій солі (15% ЫаС1).
А. підег 1119 під час глибинного вирощування продукував амілази з високою активністю (3,9 Од-мл-1) при 50-55 0С і рН 4,0 і зберігав стабільність при 53 0С протягом 200 год. Для того щоб встановити, чи можна використовувати цей фермент у процесі очищення, різні детергенти досліджували
з використанням екстракту амілази A. niger і встановили можливість їх застосування для очищення хірургічних і ендоскопічних інструментів [19].
Деякі дослідники [20] показали здатність Tвін-80 і рамноліпіду стимулювати активність позаклітинної амілази Penicillium simplicissium.
Амілазу виявили також у різних представників бактерій, як патогенних (Vibrio cholerae, B. anthracis, Streptococcus, Staphylococcus, Pneumococcus), так і непатогенних (B. mesentericus, B. subtilis, B. macerans) видів. Промислове значення, безумовно, можуть мати і фактично мають лише непато-генні бактерії. На особливу увагу заслуговують термостабільні амілази, які здатні гідролізувати нативний крохмаль і витримувати високі концентрації солей, а також лужні амілази, оскільки більшість відомих грибних амілаз, що їх широко застосовують у промисловості, виявляють активність у кислому середовищі.
Амілолітичні ферменти термофільного штаму Bacillus sp. 86 виявляли активність при температурі 30—95 0С (термооптимум 85—90 0С) і в інтервалі значень рН 5,0—10,5 з двома рН-оптимумами (6,0 і 8,5). Активність препарату при 60 0С залишалася без змін протягом 4 год, а час його напівак-тивації при цій температурі — 9 год, при 90 0С активність препарату не змінювалась упродовж 50 хв, а час напівактивації становив 2 год [21]. Здатність досліджуваного ферменту здійснювати гідроліз крохмалю в умовах слабокислого, нейтрального і лужного середовищ є істотною перевагою перед іншими а-амілазами і зумовлює можливість використання його як каталізатора різних промислових реакцій розрідження крохма-левмісної сировини. Іони кальцію, які не впливають на активність а-амілази, значно підвищують стабільність ферменту, до того ж потреба в іонах цього металу зростає з підвищенням температури інкубації. Крохмалю, як специфічному субстрату а-амілази, також притаманний високий стабілізуваль-ний ефект. У 22,5%-му розчині крохмалю а-амілаза Bacillus sp. 86 за відсутності іонів кальцію цілком стабільна протягом 100 хв при 90 0С і 80 хв при 100 0С. Встановлено, що даний фермент є глікопротеїном. Білкова глобула ферменту тісно зв’язана з вуглеводним компонентом, який становить до 16% сухої маси. Молекулярна маса а-аміла-зи дорівнює 83—90 ^a. Молекула а-амілази Bacillus sp. 86, що містить 16 амінокислот і налічує в середньому 254 амінокислотних
залишки, відзначається високим вмістом аспарагінової і глутамінової кислот, аланіну, валіну і триптофану. У молекулі ферменту не виявлено цистеїну. Припускають, що роль дисульфідних зв’язків у створенні структури термостабільної а-амілази відіграють іони кальцію [15].
Високотермостабільну амілазу, яка продукується Bacillus sp. PN5, було ізольовано з ґрунту [22]. У разі вирощування на середовищі, яке містить (%) крохмаль (0,6), пептон (0,5) і дріжджовий екстракт (0,3), при 60 0С, рН 7,0, упродовж 60 год активність амілази, яка продукувалась, становила 65,23 Од/мл. Максимуму активності було досягнено при рН 10,0 і температурі 90 0С. Активність ферменту пригнічувалась при 105 0С на 65%, а при температурі від 80 до 100 0С була стабільною протягом 1 год. Фермент зберігав 83% активності після 1 год інкубації з доде-цилсульфатом натрію. Ці властивості вказують на можливість використання даної амілази при цукрофікації крохмалю і утворенні детергенту.
У Росії на цей час у промисловому масштабі виробляють препарати а-амілази на основі двох продуцентів — B. subtilis (аміло-субтилін) і A. oryzae (амілоризин) [23]. Однак ці амілази не належать до термостабільних ферментів, оскільки оптимальна температура їхньої дії 55—65 0С. Автори [23] методами мутагенезу і селекції одержали високопродуктивний штам B. licheniformis 103, який здатен синтезувати термостабільну а-амілазу (температурний оптимум 90—95 0С, рН-оптимум 6,0—8,5). Оптимізацією складу ферментаційного середовища і умов глибинного культивування продуцента їм вдалося майже у 8 разів у порівняно з вихідним штамом підвищити активність амілази, яка становила 260 Од -мл1.
За допомогою іонообмінної хроматографії і гель-фільтрації очистили позаклітинну а-амілазу B. subtilis [24]. Молекулярна маса її дорівнювала 48 кДа. Різноманітні іони металів навіть за низьких концентрацій інгібували активність а-амілази. Ca2+, Ba2+, Mn2+ і Ni2+ були слабкими, а Zn2+, Fe2+, Pb2+, Hg2+, Mg2+, Cd2+ і Cu2+ — сильними інгібіторами. Високі концентрації Ca2+ сприяли зниженню ферментативної активності, а за концентрації 2,5 мМ активність підвищувалась. EДTА також впливав на активність, аналогічно до впливу Ca2+ за низьких концентрацій. Відзначено підвищення активності ферменту в разі використання іонів металів у концентрації 10 мМ. Показники Km і Vmax для а-амілази становили 2,2 •Ю 4 г^мл1
і 0,020 Од^мл-1, 2,9Ъ10-4 г^мл-1 і 0,016 Од^мл-1; 4,04^10-4 г^мл-1 і 0,021 Од^мл-1 у випадку використання як субстратів крохмалю, амілози і глікогену, відповідно.
Автори [25] ізолювали штами В. subtilis JS-2004 з максимальною активністю 72 Од^мл-1 під час вирощування на рідкому середовищі з картопляним крохмалем упродовж 48 год при рН 7,0 і 50 0С. Додавання іонів Са2+ і дріжджового екстракту підвищувало продукування ферменту, тимчасом як додавання 1% глюкози сприяло значному інгібуванню. Оптимальної активності було досягнено при рН 8,0 і 70 0С. Фермент був стабільним протягом 1 год при 60 і 70 0С, водночас при 80 і 90 0С вихідна активність втрачалась на 12 і 48%, відповідно. Фермент активували іони Са2+ (117%), значною мірою інгібували іони Со2+, Си2+ та Hg2+ і меншою мірою Mg2+, Zn2+, №2+, Fe2+ і Мп2+. Штам продукував високі рівні а-амілази, яку можна використовувати в крохмале-пато-ковій та харчовій промисловості.
Зі зразків південноамериканських ґрунтів виділено штам В. licheniformis ШІЯ-61, який продукував підвищену кількість кислої а-амілази. У періодичних культурах
В. licheniformis ШІЯ-61 у фазі експоненцій-ного росту виявляли позаклітинні а-амілази та глюкозидази. Максимальної активності а-амілази було досягнено при 45 0С і рН 7,0 у пізній експоненційній фазі. Оптимум активності цього ферменту спостерігався при 50-67 0С і рН від 5,5 до 6,0. а-Амілаза характеризувалася термостабільністю при 60 0С [26].
а-Амілаза В. licheniformis є високостабіль-ним ферментом, який широко використовують у біотехнологічних процесах. Незважаючи на те, що її продукує не термофільна бактерія, вона зберігає активність протягом декількох годин при температурі, вищій за 90 0С , в умовах промислового гідролізу крохмалю. Вона також більш стабільна, ніж а-амілаза В. stearothermophilus і В. ату^Щ-uefaciens, попри значну подібність послідовностей між цими трьома білками. а-Амілаза
В. licheniformis є цікавою моделлю для білкової інженерії під час дослідження термостабільності й термостабілізації. Автори [27] здійснили мутаційний і структурний аналіз а-амілази В. licheniformis, для того щоб з’ясувати походження незвичайних термальних властивостей і, якщо можливо, підвищити термостабільність ферменту. Ще до того як було встановлено тривимірну структуру, дослідники використали мутагенез та ідентифікували два критичних поло-
ження, в яких заміщення амінокислот може або підвищити, або знизити значною мірою необоротну термоінактивацію. Коли детальну Х-променеву структуру а-амілази B. li-cheniformis було встановлено, заснований на структурі мутагенез застосували для визначення ролі залишків, які залучаються до утворення сольових містків, зв’язування з кальцієм або потенціальних процесів де-амідування. Результати дослідників [27] свідчать про ключову роль домена В та його взаємодії з доменом А у термостабільності а-амілази B. licheniformis. Більшість мутацій, які автори вводили в цю ділянку, так чи інакше модифікували стабільність завдяки впливу на електростатичну взаємодію тріади металів Ca—Na—Ca у місці контакту доменів А/В. Мутаційні дослідження показали важливість тріади металів для підтримання правильного вигину домену А, а також розщеплення конформації активного центру. Однак подібний тріадний металзв’язуваль-ний центр також присутній у менш термостабільних бактеріальних гомологів, таких як B. stearothermophilus і B. amyloliquefaciens. ^му підвищена термостабільність а-аміла-зи B. licheniformis не може бути зумовлена присутністю цієї тріади металів. У процесі мутаційних досліджень автори сконструювали понад 500 варіантів амілази, що несли від однієї до численних мутацій, серед яких було багато як високошкідливих, так і пев-ною мірою корисних для стабільності. Кумулятивний ефект мутацій дав дослідникам можливість модулювати стабільність ферменту в діапазоні 50 0С , включаючи значне втручання в амілолітичну функцію. Незважаючи на те, що повного розуміння походження природної термостабільності а-амі-лази B. licheniformis ще не досягнено, дослідження авторів показали, що вона не є оптимальною і що є можливість підвищувати або знижувати її штучно декількома шляхами, використовуючи як випадковий, так і цілеспрямований мутагенез. Цікаво, що інженерно створені гіпертермостабільні варіанти а-амілази B. licheniformis є також більш стабільними за низьких значень рН.
Вивчаючи взаємодію а-амілази B. amy-loliquefaciens з дивалентними катіонами кальцію і кобальту, дослідники [28], встановили 17 сайтів зв’язування кальцію на ферменті зі слабкою позитивною кооперативніс-тю. Зв’язування як кальцію, так і кобальту є екзотермічним процесом. Кальцій стабілізував фермент проти сурфактантів і термальної денатурації. Більш того, зв’язування з кальцієм запобігало спонтанному
зменшенню біологічної активності а-аміла-зи. На ферменті існує 25 некооперативних сайтів для зв’язування іонів кобальту. Активність ферменту значно підвищується зі збільшенням концентрації кобальту, але температура денатурації ферменту знижується. Tаким чином, дивалентні катіони кальцію і кобальту діють як стабілізатор і активатор, відповідно, для а-амілази
B. amyloliquefaciens.
Дослідники показали [29] здатність продукувати високоактивну амілазу для штамів Streptomyces somaliensis GS 1242 і Strep-tomyces sampsonii GS 1322.
Зростаючи на середовищі з глюкозою, Clostridium acetobutyricum продукує позаклітинну а-амілазу. Фермент достатньо охарактеризований біохімічно, однак його ген поки що не ідентифіковано. Ген amyP кодує 80 013-Дй зрілий білок з N-кінцевим доменом, який є ідентичним такому родини 13 глікозилгідролаз, таких як а-амілаза Bacillus. Tранскрипційний аналіз показав, що amyP транскрибується в розчині хемо-статної культури. Наведені дані відповідають активності а-амілази, а це свідчить про те, що експресія аmyP регулюється на транскрипційному рівні. AmyP локалізували на ме-гаплазміді pSOL1, яка несе всі гени, що беруть участь у кінцевій стадії утворення розчину. Дегенерація C. acetobutyricum пов’язана зі втратою pSOL1. Показано, що amyP можна використати як рецепторну систему для характеристики цього явища [30].
Новий термофільний спороутворюваль-ний штам MR3Ct, що його ізольовано з геотермального ґрунту, локалізованого на горі Ріттманн в Антарктиці, був здатен продукувати позаклітинну амілазу. На основі 16 S рРНК-послідовності було показано, що штам близький до Anoxybacillus amylolyticus [31].
З Geobacillus thermodenitrificans HR010 [32] виділено й очищено до гомогенного стану (13,6 раза, 11,5% вихід) а-амілазу. Молекулярна маса, визначена за допомогою ДСН-ПААГ-електрофорезу, становила 58 кДа. Активність була оптимальною на картопляному крохмалі при рН 5,5 і 80 0С. У присутності іонів Са2+ залишкова активність досягала 92% після 1 год інкубації при 70 0С. а-Амілаза не втрачала активності у присутності фітату (селективний інгібітор а-аміла-зи) у концентрації 10 мМ і зберігала 90% максимальної активності після 1 год інкубації при 70 0С. Б^А і EДTА були сильними інгібіторами ферменту. а-Амілаза гідролізу-вала розчинний крохмаль при 80 0С з Km 3,05 мг-мл1 і Vmax 7,35 Од-мл1.
Здатність до продукування позаклітинної а-амілази було виявлено і в галофільної бактерії Halomonas meridiana [33]. Найвища продукція а-амілази спостерігалась наприкінці логарифмічної фази під час зростання культури на середовищі з 5% солей чи крохмалю за відсутності глюкози. Фермент виявляв максимальну активність при рН 7,0, але був відносно стійким і в лужних умовах. Оптимальні значення температури і солоності для активності а-амілази становлять відповідно 37 0С і 10% NaCl.
У біотехнологічних процесах, а саме у ферментативному гідролізі крохмалю у процесі одержання глюкози, використовують амілолітичні ферменти, які синтезуються термофільними археями [34].
Здатність до синтезу термостабільної а-амі-лази виявлена у Thermomyces lanuginosus Ft. Молекулярна маса й ізоелектрична точка для цього ферменту становили відповідно 55 кДа і 4,0. Максимальну стабільність а-амі-лаза виявляла при рН 4,0 і зберігала > 80% активності за рН 5,0-6,0 протягом 24 год. Після інкубації при 90 0С упродовж 1 год а-амілаза зберігала лише 6% активності. Активність ферменту зростала у присутності Mn+2, Co+2, Cu+2, Zn+2 і Fe+2, але інгібувалася гуанідин-НСІ, сечовиною і ЕДТА. Цей фермент має такі параметри рН і термостабільності, які роблять його перспективним для промислового використання [35].
Таким чином, представники різних таксономічних груп мікроорганізмів здатні продукувати активні а-амілази, з різноманітними фізико-хімічними властивостями, що визначає практичне використання їх у різних сферах життєдіяльності людей.
Практичне застосування а-амілаз
Відомо, що а-амілазу Aspergillus вже протягом багатьох століть використовують у промисловому виробництві для виготовлення соєвих соусів і напою саке. Соєві соуси виготовляють із автоклавованих соєвих бобів, які інокулюють культурою Aspergillus, переважно А. flavus, після інтенсивного розвитку матеріал переносять у сольовий розчин, куди додають також дріжджі. Тут відбувається тривалий (приблизно рік) процес дозрівання, протягом якого продукт набуває специфічного смаку й аромату. Саке — напій, що містить від 12 до 15% алкоголю, виготовляють із рису. Рис спочатку автокла-вують, потім оцукрюють дією койї (койя — ферментативний препарат, що є продуктом сукупності декількох видів Aspergillus,
вирощених на пшеничних висівках і соєвих бобах, переважають А. flavus і А. оrуzае), після чого гідролізат зброджують, додаючи дріжджі [36].
На сьогодні за кордоном описано близько 200 поліферментних лікарських засобів, що їх застосовують для поліпшення травлення, зокрема при диспепсії, гастриті, діареї [37]. Разом із ліпазами і/або протеазами, амілази можуть бути використані для лікування травних розладів, при панкреатитах, цис-титних фіброзах, діабеті типу I і/або типу II.
Tак, у Латвії в 90-х роках минулого століття випускали препарат сомілаза, який містив ліполітичний і амілолітичний ферменти і використовувався для поліпшення травлення [38].
Кфективну лікувальну й лікувально-профілактичну дію справляють засоби, до складу яких входить амілаза і якими послуговуються у стоматології [39].
Два амілолітичні препарати: амілосуб-тилін Г3х-1 та амілосубтилін Г10х-1 застосовують у косметиці. Ці препарати одержують у вигляді порошків різного ступеня чистоти й активності під час глибинного культивування B. subtilis. Препарат типу Г3х-1 виробляють розпилювальним висушуванням упареного фільтрату культуральної рідини, а препарат Г10х-1 — осадженням упареного фільтрату культуральної рідини органічним розчинником (етиловий спирт). Препарати відрізняються за активністю: у амілосубтиліну Г3х-1 стандартна активність 600 Од/г за колориметричним методом, а в амілосубтиліну Г10х-1 — 3 000 Од/г. Оптимальні умови дії обох препаратів — рН 6 і температура 50—55 0С [40]. Зниженням у 1,5—2 рази в’язкості культуральної рідини під впливом глікозидази Г3х було поліпшено технологію виробництва ферментних препаратів а-амілази B. subtilis. У процесі одержання амілосубтилину Г3х ферментативне розрідження дозволило висушити культуральну рідину з підвищеним ступенем концентрування в 1,5—2,5 раза і збільшити продуктивність розпилювальної сушарки на 13%, а у виробництві амілосубтилину Г10х — збільшити швидкість фільтрації культу-ральної рідини в декілька разів і скоротити втрати амілолітичної активності на 10%. Оброблення культуральної рідини глікози-дазою не призводить до втрати амілолітич-ної активності, що дозволило інтенсифікувати технологічні процеси виділення а-амілази [41].
Амілази набули широкого біотехнологіч-ного застосування в таких галузях, як текс-
тильна, фармацевтична, харчова, у виробництві мийних засобів. Гідролітичні ферменти здатні до 100% -ї деградації, і тому ферментативні детергенти можуть забезпечити ефективне очищення в разі використання тільки теплої води.
Сучасна технологія виробництва глюкози, мальтози та інших вуглеводів, які використовують у харчовій біотехнології, базується на гідролізі крохмалевмісної сировини високоактивними ферментами а-амілази і глюкоамілази.
Для промислового одержання препаратів бактеріальної а-амілази, окрім В. sub-НШ, використовують також культури В. amyloliquefaciens і В. licheniformis. а-Амі-лазу В. amyloliquefaciens застосовують для гідролізу крохмалю при температурі до 90 0С. Однак галузь промисловості, де є переробка крохмалю, зацікавлена в підвищенні температури гідролізу. Це стало можливим після одержання а-амілази із В. licheniformis. Ця амілаза дозволяє проводити гідроліз крохмалю при температурі до 105-110 0С. В. amy-loliquefaciens у процесі культивування утворює, окрім а-амілази, нейтральну протеазу, а-глюканазу, геміцелюлазу. Під час гідролізу крохмалю присутність протеази небажана, оскільки деградація білкових фракцій крохмалю призводить до потемніння сиропу. З огляду на це для одержання більшості комерційних препаратів а-амілаз використовують штами, які не продукують протеазу. Винятком є а-амілази В. licheniformis. Їхня висока термостабільність дозволяє позбутися небажаних домішок протеази термічною інактивацією без значних втрат а-амілазної активності.
Бактеріальні а-амілази випускають переважно у вигляді рідких препаратів, що містять як консервант 20%-й розчин хлориду натрію, але бувають і тверді препарати.
На ринок окрім бактеріальних надходять також а-амілази грибного походження. Для їх одержання застосовують культури А. оrуzae і А. niger. Так, а-амілаза А. оrуzae є основним компонентом ферментного препарату така-діастаза, що є одним з найперших ферментних препаратів цієї групи, який почали виробляти. Оптимальне для дії цієї амілази значення рН лежить в інтервалі 4,8-5,8, а термостабільність її нижча, ніж у а-амілази В. amyloliquefaciens.
Властивості а-амілази А. niger мало чим відрізняються від властивостей а-амілази А. оrуzae. Деякі штами А. niger продукують амілазу, яка зберігає стабільність у ще кислішому середовищі (при рН < 2) і є більш
термостійкою. Однак препарати а-амілази
А. niger мають обмежене застосування через низьку амілазну активність і, отже, їхню високу вартість.
Препаратам а-амілази Aspergillus притаманна більша оцукрювальна здатність порівняно з препаратами а-амілази Bacillus: з їхньою допомогою можна досягти вищого виходу цукрів (50% -й вихід мальтози під час гідролізу крохмалю) [42].
У виробництві спирту як основний фер-ментовмісний матеріал раніше застосовували солод, який від початку виникнення спиртової промисловості використовували для оцукрювання крохмалю сировини і який з успіхом було замінено на культури мікро-міцетів з активним амілолітичним комплексом ферментів [43]. Застосування у процесі виробництва спирту грибної амілази замість солоду дозволяє: а) зекономити десятки тисяч тонн високоякісного зерна; б) підвищити вихід спирту; в) різко скоротити в часі процес одержання ферментного препарату. Як відомо, для одержання активного зернового солоду потрібно 7—8 діб, для вирощування ж культури гриба й отримання з неї препарату ферменту — кілька десятків годин; г) зменшити кількість виробничих площ, а також усіх видів енергії.
У пивоварінні амілази використовують замість зернового солоду. Смакові якості пива при цьому практично не змінюються. Для застосування у пивоварінні найбільш придатними є ферменти грибного походження (A.. oryzae), що дозволяє заощадити десятки тисяч тонн ячменю. Якщо у виробництві пива зменшити кількість солоду і збільшити кількість ферментного препарату до 4—5%, то можна взагалі обійтися без солоду і з не-солодженої сировини одержати сусло, яке майже не відрізнятиметься від сусла, виготовленого із солоду. Якщо затір у процесі такого способу виробництва піддати гідротермічній обробці певного режиму, то він набуває смаку й аромату солоду.
Амілолітичні ферменти також використовують у крохмале-патоковій промисловості для виготовлення глюкозної і мальтозної патоки [43]. У цьому разі застосування амілаз різноманітне. Насамперед, за їхньою участю може бути отримана розчинна форма крохмалю. За допомогою бактеріальних і рослинних амілаз вдається одержати мальтозну і глюкозну патоки, зокрема з кукурудзяного і маїсового борошна, а також чисту глюкозу. Різні види паток використовують головним чином у кондитерському виробництві, де вони перешкоджають кристалізації
сахарози і лактози, поліпшують консистенцію виробів і збільшують терміни їх зберігання, а також у виробництві морозива, консервованих фруктів і варення, безалкогольних напоїв, столових сиропів тощо.
У крохмале-патоковій промисловості ферментативний гідроліз має переваги перед кислотним завдяки ряду переваг, таких як специфічність реакції, стабільність продуктів, нижчі енергетичні потреби [44].
У хлібопекарській промисловості аміло-літичні ферментні препарати застосовують як біологічні поліпшувачі якості хліба: значно покращуються смак, аромат, забарвлення кірки, збільшується питомий об’єм, пористість, вміст цукру. Крім того, вони інтенсифікують біохімічні й мікробіологічні процеси, прискорюючи процес тістоведення. а-Амілазу А. оrуzae додають у разі недостатнього вмісту амілаз у борошні. Амілаза гідролізує крохмаль тіста, а утворювана при цьому мальтоза слугує субстратом для пекарських дріжджів у процесі заквашування. Низька термостійкість а-амілази А. оrуzae має позитивне значення, дозволяє уникнути деградації м’якуша у процесі випікання.
У виробництві різних виробів із круп’яних продуктів амілази застосовують для попереднього оброблення сировини, з якої виробляють харчовий продукт у вигляді пластівців чи зерен або круп’яних концентратів. Готові продукти після гідролізу набувають поліпшених смакових якостей, збагачуються розчинними цукрами, компоненти їх краще перетравлюються і засвоюються.
У виробництві овочепродуктів, зокрема пюре, супів, різних форм сушених овочів, крохмаль так само модифікують. Процес має ряд технологічних переваг: для супів і пюре — необхідне розрідження за збереження сухої речовини у продуктах; для сушених овочів — деяке прискорення процесу висушування. В усіх випадках повніше використовується сировина.
Відходи кондитерської промисловості часто містять значні кількості крохмалю, особливо це стосується відходів виробництва цукерок. За допомогою бактеріальних і грибних амілаз можна виділити з них цукри і використовувати їх.
Дитяча їжа. На сьогодні в деяких країнах налагоджено випуск нових харчових продуктів, які попередньо оброблені ферментами. Так, під час виготовлення дитячої їжі крохмаль чи білки частково гідролізу-ють амілолітичними чи протеолітичними ферментами. Це значно полегшує перетравлення і засвоєння зазначених цінних речо-
вин в організмі дитини і, крім того, поліпшує смакову якість їжі, що в даному разі також є дуже важливим.
Вироби із фруктів. У виробництві різної продукції з фруктів — соків, екстрактів, деяких сортів варення, фруктових пюре — застосовують грибні амілази для повного розщеплення в них крохмалю. Залишки крохмалю можуть призводити до поступового загусання продуктів, деякого помутніння соків, екстрактів, погіршення їхнього товарного вигляду.
Амілази можна широко використовувати і в легкій промисловості [45]. Так, у текстильному виробництві їх застосовують для розшліхтування рослинного волокна перед відбілюванням і фарбуванням. Вихідний продукт — сувора тканина — містить 5% крохмалю і чимало інших домішок, які треба видалити, зробивши тим самим тканину м’якою, здатною змочуватися, краще відбі-люватись і зафарбовуватись. Найпридатні-шими для цієї мети виявилися бактеріальні амілази. Для фарбування текстильних виробів, навпаки, необхідним є крохмаль. Його вводять у друкувальну фарбу у вигляді за-гущувача, для того щоб надати фарбі клейкості, пластичності й чіткості. Крохмаль, що його використовують у цьому разі, має бути розчинним. Для цього його деякою мірою гідролізують за допомогою амілолі-тичних ферментів (краще бактеріального походження, утім можна й рослинного).
У паперовій промисловості за допомогою амілаз одержують спеціальний крохмаль, який додають під час проклеювання паперу. Ця операція додає паперу пружності, щільності, глянцю, збільшує його міцність.
Амілази використовують і в промисловості очищення. За їх участю готують розчинний крохмаль, який застосовують для підкрохмалювання білизни. І навпаки, очищуючи білизну й одяг, можна легко розщепити крохмальний шар і швидко видалити його разом із плямами. Під час ремонтних робіт за допомогою амілаз знімають зі стін шпалери, що були приклеєні крохмальним клейстером.
Амілази, разом із протеазами й ліпазами, широко використовують у виробництві мийних засобів. Амілази полегшують видалення плям, які містять крохмальні речовини, наприклад, від макаронних виробів, картоплі, шоколаду, дитячої їжі. Крохмаль, що висихає, важко видаляється при середніх і низьких температурах прання, особливо в разі застосування мийних засобів середньої лужності. Крохмаль прилипає до поверхні тканини, відіграючи роль клею
для інших компонентів забруднень. Амілаза гідролізує крохмаль у декстрини і цукри, які легко розчиняються у мийному розчині.
Tаким чином, у поданому огляді систематизовано наявні на цей час дані щодо фізико-хімічних і каталітичних властивостей бактеріальних та грибних а-амілаз, наведено результати молекулярних досліджень структури білка та безпосередньо активного центру ферменту, що, у свою чергу, дозволяє досить повно визначити положення а-амілаз у сучасній класифікації глікозидгідролаз.
/ ЛІТЕРАТУРА ~7
1. Sivaramarkrishtan S., Gangadharan D,, Kesavan Madhavan Nampoothiri et al. а-Amylases from microbial sources an overview on recent developoments // Food Technol. Biothech-nol. — 2006. — V. 44, N 2. — P. 173—184.
2. Maarel M. J. E. C. van de, Veen B. van der, Uitdehaag J. C. M et al. Properties and applications of starch-converting enzymes of the а-amylase family//J. Biotechnol. — 2002. — V. 94.— P. 137—155.
3. Takata H., Kuriki T., Okada S. et al. Action of neopullulanase. Neopullulanase catalyzes both hydrolysis and transglycosylation at а-(1,4)- and а-(1,6)-glucosidic linkages // J. Biol. Chem. — 1992. — V. 267. — P. 18447—18452.
4. MacGregor E. A. An overview of clan GH — H and distantly-related families // Biologia (Bratislava). — 2005. — V. 60. — P. 5—12.
5. Kuriki T., Imanaka T. The concept of the а-amylase family: structural stability and common catalytic mechanism // J. Biosci. Bioeng. — 1999. — V. 87. — Р. 557—565.
6. Janesek S. How many conserved regions are there in the а-amylase family // Biologia (Bratislava). — 2002. — V. 11. — P. 29—41.
7. Matsuura Y. A possible mechanism of catalysis involving three essential residues in the enzymes of а-amylase family// Ibid. — 2002. — V. 11. — P. 21—27.
8. Reddy N. S., Nimmagadda A., Rao S. An overview of the microbial а-amylase fami-ly//African J. Biotechnology. — 2003. — V. 2, N 12. — P. 645—648.
9. Dickmanns A., Ballschmiter M., Liebl W., Ficher R. Structure of the novel а-amylase AmyC from Thermotoga maritima // Acta Cryst. — 2006. — V. 62. — P. 262—270.
10. Галич И. П. Xромaтогрaфическое исследование высокоочищенных препаратов микробных а-амилаз и некоторых других глобулярных белков: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 093. — К., 1978. — 27 с.
11. Квеситадзе Г. И,, Коконашвили Г. Н., Фениксо-ва Р. В. а-АмилaзaAspergillus oryzae // Ферменты. — Tбилиси.: Мецниереба, 1975. — 115 c.
12. Потехина Т. С. Сорбционная иммобилизация микробных амилаз на карбоксильных и углеродных сорбентах: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04. — Л., 1988. — 22 с.
13. Фролова Г. М., Сильченко А. С., Пивкин М. В. Амилолитические ферменты морского гриба Aspergillus flavipes // Биоактивные вещества из морских макроорганизмов и микроорганизмов и наземных растений Дальнего Востока: Материалы науч. конференции. — Владивосток, 2001. — С. 205-207.
14. Шкуматов В. М., Рудой А Л., Овсянко С. Л. и др. Химические проблемы создания новых материалов и технологий. — М., 1988. — С. 549-558.
15. Кичакова Н. А. Выделение и изучение свойств термостабильной альфа-амилазы Bacillus sp. 86: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 03.00.07. — К., 1991. — 16 с.
16. Damodara R., Purnima A., Ramesh D., Ayyanna
C. Purification of a-amylase from Bacillus licheniformis by chromatofocusing and gel filtration chromatography // World J. Microbiol. Bio-technol. — 2002. — V. 18, N 6. — P. 547-550.
17. Перевозченко И. И. Сравнительное исследование a-амилаз некоторых плесневых грибов: Автореф. дис. ... канд. биол. наук: 093. — К., 1981. — 24 с.
18. Фролова Г. М., Сильченко А. С., Пивкин М. В., Михайлов В. В. Амилазы гриба Aspergillus flavipes, ассоциированного с Fucus evanes-cens // Прикл. биохим. микробиол. — 2002. — Т. 38, № 2. — C. 155-160.
19. Mitidieri S., Martinelli A. H. S., Schrank A., Vainstein M. H. Enzymatic detergent formulation containing amylase from Aspergillus niger: A comparative study with commercial detergent formulations//Bioresource Technology. — 2006. — V. 97, N10. — P. 1117-1224.
20. Zeng G.-M., Shi J.-G., Yuan X.-Z., Liu J. Effects of Tween 80 and rhamnolipid on the extracellular enzymes of Penicillium simplicissium isolated from compost // Enzyme Microb. Tech-nol. — 2006. — V. 39, N 7. — P. 1451-1456.
21. Павлова И. Н., Кичакова Н. А, Захарова И. Я. Термостабильные амилазы штамма Bacillus sp. // Методы получения, анализа и применения ферментов. — Рига, 1990. — С. 34.
22. Saxena R. K., Dutt K., Agarwal L., Nayyar P. A highly thermostable and alkaline amylase from a Bacillis sp. PN5 // Bioresource Technology. — 2007. — V. 98, N 2. — P. 260-265.
23. Цурикова Н. В., Нефедова Л. И., Костилева Е.В. и др. Получение активного штамма Bacillus licheniformis — продуцента термостабильной a-амилазы // Приклад. биохим. мик-робиол. — 2002. — Т. 38, № 5. — C. 502-508.
24. Uyar F., Baysal Z., Dogru M. Purification and some characterization of an extracellular a-amylase from a thermotolerant Bacillus subtilis // Ann. Microbiol. — 2003. — V. 53, N 3. — P. 315-322.
25. Asgher M., Asad M. J., Rahman S. U., Legge R. L. A thermostable a-amylase from a moderately thermophilic Bacillus subtilis strain for stach processing // J. of Food Engineering. — 2007. — V. 79, N 3. — P. 950-955.
26. Castro G., Baigori M., Sinerir F. Studies on a-amylase production by Bac. licheniformis MIR-61 // Acta Biotechnol. — 1999. — V. 19, N 3. — P. 263-272.
27. Decklerck N., Machius M., Joyet Ph. et al. Engeneering the thermostability of B. liche-niformis a-amylase//Biologia (Bratislava). — 2002. — V.11. — P. 203-211.
28. SabouryA.A. Stability, activity and binding properties study of a-amylase upon interaction with Ca2+ and Co2+ //Ibid. — 2002. — V. 11. — P. 221-228.
29. Kumar J. P., Richa J., Jain P. C. Production of industrially important enzymes by some actinomycetes producing antifungal components // Hindustan Antibiot. Bull. — 2003-2004. — V. 45-46. — C. 29-33.
30. Sabathe F., Croux C., Comillot E., Soucaille P. AmyP, a receptor gene for study strain degeneration in Clostridium acetobutyricum ATCC 824//FEMS Microbiol. Letters. — 2002. — V. 210, N 2. — P. 93-98.
31. Poli A., Esposito E, Lama L., Orlando P. Anoxyba-cillus amyloliticus sp. novo., a thermophilic amylase producing bacterium isolated from mount Rittmann (Antarctica) // System. App. Microbiol. — 2006. — V. 29, N 4. — P. 300-307.
32. Ezeji T. C., Bahl H. Purification, characterization, and synergistic action of phytate-re-sistant a-amylase and a-glucosidase from Geobacillus thermodinitrificans HR010 // J. Biotechnol. — 2006. — V. 125, N 1. — P. 27-38.
33. Coronado M., Vargas C., Hofemeister J., Nieto J. Production and biochemical characterization of an a-amylase from the moderate halophile Halomonas meridiana // FEMS Microbiol. Lett. — 2000. — V. 183,N1. — P. 67-71.
34. Leveque E., Janecek S., Haye B., Belarbi A. Thermophilic archaeal amylolytic enzymes // Enzyme Microb. Technol. — 2000. — V. 26,N1. — P. 3-14.
35. Odibo F., Ulbrieh-Hofmann R. Thermostable a-amylase and glucoamylase from Thermo-myces lanuginosus F1 // Acta biotechnol. — 2001. — V. 21, N 2. — P. 141-153.
36. Пронин С. И. Амилолитические ферменты и их роль в пищевой промышленности. — М.: Гизлегпищепром, 1953. — С. 5-12.
37. Gupta R., Gigras P., Mohapatra H. et al. Microbial a-amylases. A biotechnological perspective // Process Biochem. — 2003. — V. 38. — P. 1599-1616.
38. Ортенберг Э. Ш., Парр Г. С., Столыпин О. С. и др. a-Амилаза медицинского назначения // Методы получения, анализа и применения ферментов. -Рига, 1990. — С. 171-177.
39. Лупова Л. М. Косметика — новая область использования ферментных препаратов. — М., 1977. — 36 с.
40. Авиженис В. Ю. Создание технологии производства новых ферментных препаратов для сельского хозяйства и пищевой промышленности: Автореф. дис. ... докт. техн. наук: 05.18.10. — М., 1992. — 70 с.
41. Устинников Б. А., Цурикова Н. В., Иванов
В. В., Воронцова Н. Н. Промышленное культивирование Bacillus subtilis-82 — продуцента a-амилазы и Asp. аwamori ВУДТ-2 — продуцента глюкоамилазы для применения в пищевой биотехнологии // Биосинтез ферментов микроорганизмами. — Ташкент: Фан, 1988. — С. 154.
42. Люджус Л. Л., Чекменева Т. М., Куниский Д. Г. Состояние производства и применение ферментов за рубежом. — М., 1986. — С. 6-8.
43. Рухлядева А. П., Полыгалина Г. В. Методы определения активности гидролитических ферментов. — М.: Легпищпром, 1981. — С. 34-43.
44. Satyanarayana N., Rao J., Ezhilvannan M.
a-Amylases // Enzyme Technology / Eds. A. Pandey, C. Webb, C. Soccol, C. Larroche. — New Delhi: Asiatech Publishers Inc.,
2005. — P. 189-220.
45. Riegal E. R., Bissinger H. G. Industrial fermentation: Principles, Processes and
Products // Riegal’s Handbook of Industrial Chemistry. — New York: Kluver Academic Publishres, 2002. — P. 963-1045.
МИКРОБНЫЕ a-АМИЛАЗЫ: ВЫДЕЛЕНИЕ, СВОЙСТВА, ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
Л. Д. Варбанец, Е. В. Авдиюк, Н. В. Борзова
Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев
E-mail: [email protected]
a-Амилазы представляют одно из наибольших семейств гликозидгидролаз, трансфераз и изомераз, входящих в клан GH-H. Ферменты этого семейства наряду a-1,4-, a-1,6-связями способны гидролизовать a-1,1-, a-1,2-, a-1,3, a-1,5-гликозидные связи, содержат 4 незаменимых остатка аминокислот (Asp204, Asp206, Glu230, Asp297) и характеризуются (P/a)8 или TIM-barrel каталитическим доменом. Обсуждаются вопросы, касающиеся методов выделения и очистки a-амилаз, которые включают осаждение органическими растворителями и нейтральными солями, диализ, ультрафильтрацию, гель-фильтрацию, хроматографию, электрофорез. Приведены современные данные относительно возможности продуцирования a-амилаз микроорганизмами разных таксономических групп, в частности бактерий, микромицетов. Детально обсуждаются физико-химические свойства a-амилаз, их рН- и термооптимумы, рН- и термостабильность, молекулярные массы, влияние ионов металлов и различных химических реагентов. Рассматривается возможность использования a-амилаз в разных отраслях промышленности (спиртовой, крахмально-патоко-вой, хлебопекарской, кондитерской, текстильной, бумажной и др.), а также в медицине.
Ключевые слова: микробные a-амилазы, физикохимические свойства, практическое использование.
MICROBIAL a-AMYLASES: ISOLATION, PURIFICATION AND PRACTICAL USAGE
L. D. Varbanets, K. V. Avdiyuk, N. V. Borzova
Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
E-mail: [email protected]
The a-amylase family is the largest family of glycoside hydrolases, transferases and isomeras-es, comprising in clan GH-H. The enzymes of this family, except of a-1,4-, a-1,6-bonds, are able to hydrolyse a-1,1-, a-1,2-, a-1,3-, a-1,5-glycosidic bonds, contain 4 conserved aminoacid residues (Asp204, Asp206, Glu230 h Asp297) and have (P/a)g or TIM barrel catalytic domain. The questions conserning methods of isolation and purification of a-amylases, which include the precipitation of organic solvents and neutral salts, dialysis, ultrafiltration, gel-filtration, chromatography, electrophoresis are discussed. The current data on possibility of a-amylases from different taxonomic groups of microorganisms, in particular, bacteria and micromycetes are given. Physico-chemical properties of a-amy-lases, its pH- and thermo-optimum, pH- and thermostability, molecular masses, influence of metal ions and different chemical reagents are discussed in detail. It’s shown the possibility of a-amylases usage in different branches of industry — food, detergent, paper, textile, pharmaceutical.
Кey words: microbial a-amylases, physico-chemical properties, practical usage.
