CC BY
71
УДК 577.151:544.023.223
ОКИСНЕННЯ ФЕНОЛУ КОВАЛЕНТНО ІММОБІЛІЗОВАНОЮ ПЕРОКСИДАЗОЮ ХРОНУ
І.І. Романовська1 О. В. Осійчук3 С. С. Декіна1 Ю. А. Шестеренко1 О. В. Севастьянов1 Т. Ю. Громовий2
1Фізико-хімічний інститут ім. О. В. Богатського НАН України, Одеса 2Інститут хімії поверхні ім. О. О. Чуйка НАН України, Київ 3Одеський національний медичний університет E-mail: romairina@gmail.com
Отримано 26.07.2011
За модифікованим методом Баха виділено частково очищений препарат пероксидази хрону (RZ = 1,0; активність 100 Од/мг протеїну). Молекулярну масу виділеної пероксидази хрону (42 972 Да) підтверджено методом мас-спектрометрії — матрично активованої лазерної десорбції/іонізації. Одержаний препарат був ковалентно іммобілізований шляхом періодатного окиснення полісахаридної мембрани «Діацел» з наступним відновленням боргідридом натрію у масовому відношенні ензим:носій 0,2:1. Отримано біокаталізатор з кількісним зв’язуванням протеїну, зі збереженням 88% активності (масове відношення ензим:носій 0,2:1), розширеними значеннями рН- і термооптимумів активності, збільшеною термостабільністю, стійкістю під час зберігання (8 міс). Кінетичні дослідження показали збільшення значень Км за пероксидом водню і пірогалолом, зменшення значень Ушах реакції, яка каталізується іммобілізованою пероксидазою хрону. Розроблений біокаталізатор у реакторі періодичної дії сприяв кількісному окисненню фенолу (1 мМ) упродовж 7 циклів використання та високому рівню його біокон-версії (95-50%) у наступні 15 циклів. Методом лазерної десорбціїї/іонізації вперше визначено молекулярну масу (близько 2 021 Да) нерозчинного у воді і більшості органічних розчинників полімерного продукту пероксидазного окиснення фенолу — поліоксифенілену (розмір частинок 15-75 мкм), що складається з 21 залишку.
Ключові слова: пероксидаза хрону, мембрана «Діацел», ковалентна іммобілізація, окиснення фенолу, поліоксифенілен.
Проблема очищення стічних вод від фенолу, одного з найпоширеніших полютантів, що надходять у поверхневі води зі стоками підприємств нафтопереробної, лісохімічної, сланцепереробної, коксохімічної, анілінофарбової, фармацевтичної промисловості, є надзвичайно важливою і важко вирішуваною. Різноманіття систем очищення за хімічним складом, умовами утворення й існування, використання дефіцитних і дорогих реагентів призводять до істотних економічних і ресурсних затрат, тому пошук нових ефективних методів очищення стічних вод від фенолів залишається актуальним. На особливу увагу заслуговує використання ензиматичних методів із застосуванням окис-нювально-відновлювальних ензимів, у тому числі пероксидази хрону (ПОХ) (КФ 1.11.1.7), завдяки утворенню нерозчинних продуктів окиснення, що легко відокремлю-
ються, можливістю функціонування ензиму в широких інтервалах рН, температури
і концентрації фенольних субстратів [1, 2]. Проте недоліком методу є висока вартість комерційної ПОХ і одноразовість використання ензиму.
З огляду на це важливим є закріплення ПОХ на носіях, пошук яких триває. При цьому слід враховувати можливість одержання біокаталізаторів з новими функціональними властивостями, багаторазового використання та підвищену стабільність під час зберігання.
Відомі методи іммобілізації пероксидази на носіях природного і синтетичного походження (адсорбція, включення в гелі, ковалентне зв’язування та ін.) [3-7] часто не дозволяють одержувати високоактивні, стабільні, з можливістю багаторазового використання препарати ензимів, нерідко є багатостадійними
і високовартісними у зв’язку з використанням комерційних препаратів ензиму. Перспективним носієм для іммобілізації ПОХ є гідратцелюлозна мембрана «Діацелл», яка характеризується відсутністю токсичності, можливістю модифікації, має механічну міцність у водних середовищах, стійкість до різних значень рН.
Метою дослідження було розроблення способу окиснення фенолу з водних розчинів за допомогою виділеної ПОХ, ковалентно іммобілізованої на гідратцелюлозній мембрані «Діацел».
Завдання дослідження: отримання частково очищеного препарату ПОХ, ковалентна іммобілізація препарату на полісахаридній мембрані з детальним вивченням фізико-хімічних характеристик зразків, розроблення способу окиснення фенолу та дослідження продуктів його біоконверсії.
Матеріали і методи
Пероксидазу виділяли з коренів хрону за модифікованим методом Баха [8]. В отриманому ензимному препараті визначали спектральний показник чистоти (RZ = А403/А278) та активність за пірогалолом [2].
Концентрацію пероксидази і пероксиду водню вираховували спектрофотометрично, використовуючи молярні коефіцієнти поглинання є = 102 000 М-1см-1 при 403 нм і є = 72,4 М-1см-1 при 230 нм, відповідно.
За одиницю пероксидазної активності приймали кількість ензиму, що каталізував утворення 1 мг пурпурогаліну з пірогалолу за 1 хв при рН 7,0 і 20 °С.
Як носій використовували гідратцелюлозну мембрану «Діацел» з розміром пор 0,04 мкм виробництва ВАТ «Гемопласт» (Україна). В основу іммобілізації пероксида-зи на гідратцелюлозній мембрані покладено метод [9]: у ємність, що містила 200 см3 0,25 М періодату натрію, вносили 2 г гідратцелюлозної мембрани і перемішували за кімнатної температури впродовж 2 год, після чого мембрану відокремлювали, промивали 500 см3 дистильованої води та інкубували в 200 см3 0,016 мМ Ыа-фосфатного буферного розчину (рН 7,0), що містив пероксидазу заданої активності. Після 20 год інкубації у колбу вносили 0,2 г боргідриду натрію і залишали на 12 год при 4 °С. Гідратцелюлозну мембрану з іммобілізованою на ній пероксидазою промивали дистильованою водою, висушували до постійної маси і зберігали при 4 °С.
Ступінь зв’язування пероксидази з носієм оцінювали за різницею вмісту протеїну у вільному та іммобілізованому ензимі, зас-
тосовуючи метод Лоурі в модифікації Хартрі [10]. Кількість вільних альдегідних груп носія визначали згідно з [9].
У діапазоні значень рН 3,0-12,0 з використанням відповідних буферних розчинів встановлювали рН-оптимум активності іммобілізованої пероксидази; термооптимум — в інтервалі температур 10-70 °С при рН 7,0 і концентраціях пірогалолу та пероксиду водню 1,0 мМ.
Кінетику окиснення пірогалолу (0,075-2,4 мМ) вільною та іммобілізованою ПОХ (0,003 мМ) у присутності пероксиду водню (0,01-0,3 мМ) при 20 °С у середовищі 0,016 М Na-фосфатного буферного розчину (рН 7,0) визначали за початковою швидкістю окиснення субстратів (фенольна сполука, пероксид водню) [11, 12].
Ступінь окиснення фенолу контролювали за його залишковою кількістю після проведення реакції 4-аміноантипіриновим методом [13] і виражали в %.
Кратність використання іммобілізованої пероксидази вивчали за реакцією окиснення фенолу, для цього іммобілізований препарат вносили в колбу, що містила 10 см3 буферного розчину з 1 мМ фенолу і 1 мМ пероксиду водню. Через 30 хв мембрану з препаратом ПОХ переносили у колбу з аналогічними розчинами. Кратність використання ензиму досліджували до моменту досягнення 50%-ї конверсії фенолу.
Мас-спектрометричні дослідження було виконано на приладі Autoflex II (Bruker Daltonics Inc). Застосовували методику матрично активованої лазерної десорбції/ іонізації (MALDI), а також лазерної десорбції/іонізації (LDI). Зразок, розчинений у метанолі, наносили на стандартну сталеву мішень та висушували за кімнатної температури. Отриманий мас-спектр є сумою окремих 100 спектрів. Спектри одержано в режимі рефлектрону.
Результати та обговорення
За модифікованим методом Баха отримали гетерогенний (SDS-електрофорез) зразок ПОХ (RZ = 1,0; активність 100 Од/мг протеїну), строк зберігання 5 міс [8]. Молекулярна маса виділеної ПОХ 42 972 Да підтверджена методом MALDI (рис. 1) і узгоджується з даними літератури [14].
Методом періодатного окиснення гідратцелюлозної мембрани і подальшої взаємодії альдегідних груп, що утворилися (кількісний вміст їх становив 36%, тобто 100% від теоретичного), з аміногрупами пероксидази і відновленням боргідридом натрію, було одержано іммобілізований зразок ПОХ (рис. 2).
Характеристики вільного та іммобілізованого зразків ПОХ
Рис. 1. Фрагмент МЛЬБІ-спектра виділеної ПОХ у діапазоні 3 000—8 000 маса/заряд
СН„ОН СН20Н
■° -О- ЫаЮ, ,А °чі-0-
-о-КОН
ОН
сн,он о
-о
'-оСснГ
Iе -"н,
СН20Н
\j-0- МаВН, ,/| °ч_о-
НО І он Е
Рис. 2. Схема процесу ковалентної іммобілізації виділеної ПОХ з використанням мембрани «Діацел» (Е — ензим)
У результаті ковалентної іммобілізації ПОХ отримано біокаталізатор з кількісним зв’язуванням протеїну, зі збереженням 88% активності (масове відношення ензим:носій
0,2:1), розширеними значеннями рН- і тер-мооптимумів активності, збільшеною термостабільністю, стійкістю під час зберігання (8 міс) (таблиця).
Стабілізаційні ефекти зумовлено утворенням міцного зв’язку ПОХ з мембраною, що зменшує конформаційну рухливість протеїну.
Проведені кінетичні дослідження показали збільшення значень Км іммобілізованої ПОХ за пероксидом водню і пірогалолом; зменшення значень Ушах реакції, яка каталізується іммобілізованим ензимом, що, можливо, зумовлено зменшенням спорідненості ензиму до субстрату, а також конфор-маційними змінами протеїнової молекули.
Розроблені умови (концентрація біока-талізатора 0,1 Од/см3, рН 7,0, 37 °С, т 1 год,
Властивості ензиму Вільна ПОХ Іммобілізована ПОХ
Активність, Од/мг протеїну 100 88
рН-оптимум 6,0-7,0 4,5-7,5
Термооптимум, °С 40 30-55
Термостабільність, Кін, с-1 1,4-10-4 9,110-6
Км Н202, ммоль 0,43 0,64
Км пірогалол, ммоль 2,30 3,16
Ушах, ммоль/мг-хв 0,09 0,057
Зберігання, міс 5 8
[фенол]:[Н2О2]=1:1) сприяли кількісному ступеню окиснення фенолу (0,25-1,0 мМ) з утворенням нерозчинних у воді й більшості органічних розчинників продуктів темнокоричневого кольору з розміром частинок 15-75 мкм — поліоксифеніленів.
На рис. 3 наведено ІЮІ-мас-спектр суміші продуктів окиснення фенолу за допомогою іммобілізованої пероксидази хрону.
а
' 8 5 ; * І 5 8 І • 8 : і
Рис. 3. ЬБІ-мас-спектр суміші продуктів перок-сидазного окиснення фенолу ([фенол] = 1,0 мМ, [Н2О2] = 1,0 мМ, активність іммобілізованої ПОХ 88 Од/мг протеїну, рН 7,0, і = 37 °С,
Т = 1 год) у діапазоні 200—2 000 маса/заряд
Спостерігається серія піків з послідовністю 92 маса/заряд, що є підтвердженням утворення поліоксифенілену (С6Н4О)П. Найбільше зафіксоване значення маса/заряд становить 2 021, тобто ланцюг поліоксифенілену складається з 21 залишку.
Встановлено, що отриманий біокаталізатор у реакторі періодичної дії сприяв кількісному
П
окисненню фенолу (1 мМ) протягом 7 циклів використання та високому рівню його біоконверсії (95-50%) у наступні 15 циклів (рис. 4) з утворенням нерозчинного продукту окиснення поліоксифенілену, тоді як вільна ПОХ каталізувала одноразове окис-нення фенолу в тих самих умовах з 80,3%-м рівнем біоконверсії.
Таким чином, результати роботи мають практичне значення. Створення біокаталіза-тора багаторазової дії, отриманого ковалентною іммобілізацією виділеного частково очищеного зразка ПОХ на мембрані «Діа-цел» дозволило розробити спосіб багаторазового окиснення фенолу у водних розчинах з утворенням нерозчинного продукту — поліоксифенілену.
Рис. 4. Багаторазове використання ковалентно іммобілізованої ПOX в реакції окиснення фенолу
ЛІТЕРАТУРА
1. Cooper V. A., Nicell J. A. Removal of phenols from a foundry wastewater using horseradish peroxidase // Water Res. — 1996. — V. 30. — P.954-961.
2. Wagner M, Nicell J. A. Detoxification of phenolic solutions with horseradish peroxidase and hydrogen peroxide // Ibid. — 2002. — V. 36. — P. 4041-4052.
3. Cheng J., Ming Yu. S., Zuo P. Horseradish peroxidase immobilized on aluminium-pillared inter-layered clay for the catalytic oxidation of phenolic wastewater // Ibid. — 2006. — V. 40, N 2. — Р. 283-290.
4. Alemzade I., Nejati S. Phenol removal by immobilized horseradish peroxidase // J. Hazard. Mater. — 2009. — V. 166, N 2-3. — P. 1082-1086.
5. Bayramoglu G., Arica Y. Enzymatic removal of phenol and p-chlorophenol in enzyme reactor: Horseradish peroxidase immobilized on magnetic beads // Ibid. — 2008. — V. 156, N 1-3. — P. 148-155.
6. Gomez J. L., Bodalo A., Gomez E. Immobilization of peroxidases on glass beads: an improved alternative for phenol removal // Enz. Microb. Technol. — 2006. — V. 39, N 2. — P. 1016-1022.
7. Magri M. L., De Las Nieves L. M., Miranda M. V. Immobilization of soybean seed coat peroxidase on its natural support for phenol removal from wastewater // Biocatal. Biotransform. — 2007. — V. 25, N 1. — P. 98-102.
8. Романовська І.І., Осійчук О. В., Декіна С. С. та ін. Дослідження пероксидазного окиснення фенольних сполук // Мед. хімія. — 2010. — Т. 12, № 4 (45). — С. 79-84.
9. Туркова Я. Аффинная хроматография. — М.: Мир, 1980. — 571 с.
10. Hartree E. E. Determination of protein: а modification of the Lowry method that gives a linear photometric response // Anal. Bio-chem. — 1972. — V. 48, N 1. — P. 422-427.
11. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. — М.: Мир, 1979. — 280 с.
12. Березин И. В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. — М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. — 320 с.
13. Коренман И. М. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений. — М.: Химия, 1975. — 360 с.
14. Veitch N. C. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme // Phytochemistry. — 2004. — V. 65. — P. 249-259.
ОКИСЛЕНИЕ ФЕНОЛА КОВАЛЕНТНО ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА
И. И. Романовская1 О. В. Осейчук3 С. С Декина1 Ю. А. Шестеренко1 О. В. Севастьянов1 Т. Ю. Громовой2
Физико-химический институт им. А. В. Богатского НАН Украины, Одесса 2Институт химии поверхности им. А. А. Чуйко НАН Украины, Киев 3Одесский национальный медицинский университет
E-mail: romairina@gmail.com
По модифицированному методу Баха выделен частично очищенный препарат пероксида-зы хрена (RZ = 1,0; активность 100 Ед/мг протеина). Молекулярная масса выделенной пероксидазы хрена (42 972 Да) подтверждена методом масс-спектрометрии — матрично активированной лазерной десорбции / ионизации. Полученный препарат был ковалентно иммобилизован путем перйодатного окисления полисахаридной мембраны «Диацелл» с последующим восстановлением боргидридом натрия в массовом отношении энзим: носитель 0,2:1. Получен биокатализатор с количественным связыванием протеина, с сохранением 88% активности (массовое отношение энзим: носитель 0,2:1), расширенными значениями рН- и термооптимумов активности, увеличенной термостабильностью, устойчивостью при хранении (8 мес). Кинетические исследования показали увеличение значений Км по пероксиду водорода и пирогаллолу; уменьшение значений Vmax реакции, которая катализируется иммобилизованной ПОХ. Разработанный биокатализатор в реакторе периодического действия способствовал количественному окислению фенола (1 мМ) в течение 7 циклов использования и высокому уровню его биоконверсии (95-50%) в последующие 15 циклов. Методом лазерной десорбции/ионизации впервые определена молекулярная масса (около
2 021 Да) нерастворимого в воде и большинстве органических растворителей полимерного продукта пероксидазного окисления фенола — полиоксифенилена (размер частиц 15-75 мкм), состоящего из 21 звена.
Ключевые слова: пероксидаза хрена, мембрана «Диацелл», ковалентная иммобилизация, окисление фенола, полиоксифенилен.
PHENOL OXIDATION USING COVALENTLY IMMOBILIZED HORSERADISH PEROXIDASE
I.I. Romanovska1 O. V. Oseychuk3
S. S. Dekina1 Y. A. Shesterenko1 O. V. Sevastyanov1 T. Yu. Gromovoy2
1Bogatsky’s Physico-Chemical Institute of National Academy of Sciences of Ukraine, Odesa
2Chuiko Institute of Surface Chemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv
3Odesa National Medical University
E-mail: romairina@gmail.com
According to modified Bakh’s method, partially purified horseradish peroxidase preparation (RZ = 1,0; activity 100 U/mg of protein) was isolated. Molecular mass of obtained HPR (42 972 Da) was confirmed by mass-spectrome-try: matrix activated laser desorption/ ionization. The enzyme was covalently immobilized by periodate oxidation of polysaccharide membrane «Diacell», followed by sodium borohydride reduction, at mass ratio enzyme: support 0.2:1. The biocatalyst with quantitative protein coupling, 88% of activity’s pH- and thermooptima, increased termostability, stable at storage (8 months) was obtained. Kinetic studies had shown the increasing of hydrogen peroxide and pyrogallol KM values and decreasing of Vmax values during immobilized HPR-catalyzed reactions. In the batch reactor the biocatalyst developed promoted the quantitative phenol oxidation (1 mmol/dm3) during 7 cycles of usage and high level of it’s bioconversion (95-50%) during the next 15 cycles.
Molecular weight (about 2021 Da) of polymer product, insoluble in water and most organic solvent, of peroxidase oxidation of phenol — poli-oxyfenilene (particle size is from 15 to 75 mm) consisting of 21 units was first determined by laser desorption/ionization.
Key words: horseradish peroxidase, Diacell membrane, covalent immobilization, phenol oxidation, polyhydroxyphenylene.
