CC BY
100
РАСТЕНИЕВОДСТВО
УДК 634.1:581.1.036; 633.161:631.52
Маркирование генов Ppd и Vrn у ячменя методами ПЦР-анализа
Алабушев Андрей Васильевич, член-корреспондент РАН, Донцова Александра Александровна, кандидат с.-х. наук, Потокина Елена Кирилловна,* доктор биол. наук
ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зерновъх культур имени И.Г. Калиненко», г. Зерноград, Ростовская область, Россия, *ФГБНУ «Всероссийский институт растениеводства имени Н.И. Вавилова», г. Санкт-Петербург, Россия
E-mail: doncova601@mail.ru; E-mail: e.potokina@vir.nw.ru
На протяжении последних 15 лет в России наблюдается тенденция повышения среднесуточной температуры (+1-2 С) к среднемноголетнему значению показателя, увеличения суховейных дней и уменьшения атмосферных осадков в весенне-летний период. Одним из способов повышения урожайности культуры ячменя является создание скороспелых сортов, у которых налив зерна проходит в более комфортных условиях по сравнению со средне- и позднеспелыми сортами. Вовлечение в скрещивания доноров раннеспелости позволит вести селекцию в этом направлении более целенаправленно. Для ячменя разработаны молекулярные маркеры, позволяющие идентифицировать аллели генов фотопериодической реакции Ppd (photoperiod response) и реакции на яровизацию Vrn (vernalization response). Гены Ppd определяют реакцию растений ячменя на длину дня и, как следствие, сроки зацветания и начала колошения растений в разных условиях возделывания. Гены Vrn определяют потребность растений в яровизации для перехода к колошению, тем самым также участвуют в регуляции скорости развития и выраженности структуры урожая ячменя. В настоящем исследовании с использованием аллель-специфичных молекулярных маркеров установлено, что раннеспелый сорт ячменя Мастер селекции ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зерновых культур имени И.Г. Калиненко» (ВНИИЗК) является носителем редкого доминантного аллеля гена фотопериодической чувствительности Ppd-H1. В селекционных программах на скороспелость рекомендуется использовать сорт Мастер в качестве донора раннеспелости. Кроме того, Мастер является двуручкой, о чем свидетельствует наличие у этого сорта рецессивного аллеля vrn-H2.
Ключевые слова: ячмень двуручка, засуха, скороспелость, ПЦР-анализ, Ppd-H1, Vrn-H2, молекулярные маркеры, донор
Результаты многолетнего мониторинга агроклиматических факторов на региональном уровне показали, что за последние 15 лет в Ростовской области увеличилось количество осадков, выпадающих в холодный период, и уменьшилось в основной период вегетации зерновых культур (май-июль) [1]. В засушливые годы раннеспелые сорта озимого ячменя формируют урожай в 2-3 раза выше, чем яровой, не уступая озимой пшенице [2].
С целью более быстрого создания раннеспелых сортов озимого ячменя необходим целенаправленный подбор родительских форм - доноров скороспелости, который возможен только при использовании современных методов молекулярной селекции.
В настоящее время с помощью молекулярных маркеров решается большое число
задач функциональной и структурной генетики и геномики растений, часть из которых нашли свое применение в практических областях [3].
Для ячменя разработаны молекулярные маркеры, позволяющие идентифицировать аллели генов фотопериодической реакции Ppd (photoperiod response) и реакции на яровизацию Vrn (vernalization response). Гены Ppd определяют реакцию растений ячменя на длину дня и, как следствие, сроки зацветания и начала колошения растений в разных условиях возделывания. Гены Vrn определяют потребность растений в яровизации для перехода к колошению, тем самым также участвуют в регуляции скорости развития и выраженности структуры урожая ячменя. Разнообразие комбинаций аллелей генов Ppd и Vrn, встречаю-
щихся у ячменя, возможно, обусловливает адаптацию растений к различным условиям окружающей среды [4].
Фотопериодическая чувствительность (ФПЧ) ячменя контролируется двумя генами: на длинном дне - геном Ppd-H1, расположенном на хромосоме 2Н, на коротком дне - геном Ppd-H2 (хромосома 1Н) [5]. Доминантный аллель Ppd-H1 определяет чувствительность растений ячменя к длинному фотопериоду и тем самым индуцирует раннее зацветание в условиях длинного дня. Задержка перехода к фазе колошения на длинном дне связана с наличием рецессивного аллеля (ppd-H1) [6].
Подразделение генотипов ячменя на озимые и яровые объясняется эпистатиче-ским взаимодействием локусов Vrn-H1 и Vrn-H2 [7]. В доминантном локусе Vrn-H2 присутствуют три гена (ZCCT-Ha, ZCCT-Hb и ZCCT-Hc) [8]. Один из них кодирует белковый фактор, который делает невозможным экспрессию гена Vrn-H1. Сочетание доминантного аллеля в локусе Vrn-H2 и рецессивного аллеля в локусе vrn-H1 приводит к озимому типу развития. Для сортов ячменя с доминантным аллелем Vrn-H2 характерно более позднее колошение [9].
Возможность идентифицировать ал-лельные варианты локуса Vrn-H2 является важной с точки зрения селекции, так как позволяет прогнозировать длину вегетационного периода ячменя и быстро определять в лабораторных условиях аллели этого локуса у гибридов между озимыми и яровыми сортами [10].
Цель исследований - выявление аллелей гена Ppd-H1 и Vrn-H2 у сортов ячменя селекции ВНИИЗК имени И.Г. Калиненко.
Материал и методы. Для молекуляр-но-генетического анализа аллелей гена Ppd-H1 геномную ДНК выделяли из проростков ячменя по стандартной методике c использованием СТАВ-буфера [11]. Маркирование аллелей генов Ppd-H1 и Vrn-H2 осуществляли с помощью ПЦР с использованием аллель-специфичных праймеров и рестрикцион-ного анализа [6, 8, 10, 12].
ПЦР проводили в термоциклере (Gene-Amp PCR system 9700). При выявлении аллелей гена Ppd-H1 в состав реакционной смеси объемом 20 мкл входили: 50-100 нг ДНК,
1 х буфер для Taq полимеразы (pH 8,6, 2,5 mM Mg2+) (Sileks), 200 мкмоль dNTPs, 0,25 мкмоль каждого праймера и 2,5 ед. Taq полимеразы (Dialat). Рестрикционный анализ проводили в общем объеме 15 мкл, содержащем 3 мкл продукта ПЦР, 1 х SEBuffer B (pH 7,6), 7,5 ед. активности эндонуклеазы Msp I.
Для выявления аллелей Vrn-H2 в состав реакционной смеси для ПЦР объемом 20 мкл входили: 50-100 нг ДНК, 1 х буфер для Taq полимеразы (pH 8,6, 2,5 mM Mg2+) (Sileks), 250 мкмоль dNTPs, 0,125 мкмоль каждого праймера и 2,5 ед. Taq полимеразы (Dialat).
Визуализацию продуктов ПЦР проводили с помощью электрофореза в 1,3% ага-розном геле в 0,5 х ТВЕ буфере (напряжение 100-120 V, 1,0-1,5 ч) с добавлением бромистого этидия.
Результаты и их обсуждение. Известно, что в случае яровых сортов, из-за делеции всех трех генов ZCCT в локусе vrn-H2 (рецессивный аллель), ген Vrn-Hl эффективно экспрессируется, что позволяет растению быстро перейти к колошению. Для сор-тов-двуручек также показано наличие рецессивного аллеля в локусе vrn-H2 [8].
Для выявления аллелей Vrn-H2 нами использовался протокол мультиплексной ПЦР, разработанный Zitzewitz et al. (2005) [8]. Мультиплексную ПЦР проводили с двумя парами праймеров (табл. 1). В случае доминантного аллеля синтезируется продукт размером 1513 пн, тогда как при наличии рецессивного аллеля этот ПЦР-продукт отсутствует, однако амплифицируется фрагмент гена Snf2P [13], который также располагается на хромосоме 4H и присутствует как у яровых, так и озимых генотипов. Наличие ПЦР-продукта гена Snf2P (375 пн) подтверждает успешную ПЦР и свидетельствует о присутствии рецессивного аллеля vrn-H2.
Амплификация ПЦР-продукта Snf2P (375 пн) у сортов Ратник, Мастер и Грис свидетельствует о присутствии у них рецессивного аллеля vrn-H2 и подтверждает их принадлежность к ячменям двуручкам (рис. 1).
В результате проведения ПЦР у сортов Грис и Мастер был амплифицирован фрагмент последовательности гена размером 620 п.н. (рис. 2 а), содержащий функцио-
нальную нуклеотидную замену (SNP15(C/T) [5]). После обработки ПЦР-продукта рест-риктазой MspI размеры ДНК-фрагмента
рецессивного аллеля ppd-H1 составили 276 + 339 п.н., для доминантного аллеля Ppd-H1 - 276 + 269 + 70 п.н. (рис. 2 б).
Рис. 1. Выявление рецессивного (375 пн) аллеля угп-И2 с помощью мультиплексной ПЦР у сортов ячменя: 1 - Ратник (яровой ячмень); 2 - Мастер (в яровом посеве); 3 - Грис (яровой ячмень); 4 - Мастер (в озимом посеве)
а)
б)
Рис. 2. Выявление рецессивного (276 + 339 п.н.) и доминантного (276 + 269 + 70 п.н.) аллелей гена Ppd-H1 с помощью CAPS маркера у сортов: 1 - Грис (яровой ячмень, ppd-H1); 2 - Мастер (ячмень двуручка в озимом посеве, Ppd-H1); а - продукт ПЦР с парой праймеров Jones5-F, Jones5-R; б - картина рестрикции продукта ПЦР с эндонуклеазой MspI
Ранее, при анализе аллельного состояния гена Ррё-И1 у 91 сорта ячменя отечественной селекции из коллекции ВИР, было показано, что сорта ячменя, имеющие доминантный аллель гена Ррё-И1, достоверно опережают другие генотипы по скорости развития (колошению) и являются более скороспелыми при возделывании в условиях длинного светового дня. Среди изученного в данном эксперименте отечественного сортимента ячменей носители доминантного аллеля Ррё-И1 составили всего 9 % [4].
В настоящем исследовании выявлено, что сорт ячменя двуручки Мастер селекции ВНИИЗК имени И.Г. Калиненко является носителем этого редкого доминантного алле-ля, что подтверждается результатами фенологических наблюдений - по длине вегетационного периода согласно Международному классификатору СЭВ рода Иогёеиш Ь. сорт Мастер относится к раннеспелой группе.
Молекулярно-генетический анализ показал, что сорт ярового ячменя Грис является носителем рецессивного аллеля гена Ррё-
Н1. Оценка по длине вегетационного периода в полевых условиях показала, что этот сорт является среднеспелым.
При вовлечении в скрещивания сорта раннеспелого ячменя двуручки Мастер был получен ряд перспективных линий, кото-
рые проходят изучение в питомнике конкурсного сортоиспытания. Так, сорт Тигр внесен в Государственный реестр селекционных достижений РФ с 2013 года. Сорт Виват в 2013 году передан на испытание в Госсортсети РФ (табл.).
Таблица
Хозяйственно-биологическая характеристика перспективных линий и сортов ячменей двуручек (2012-2014 гг.)
Линия/Сорт Родословная Тип развития Дата колошения Урожайность, т/га Масса 1000 зерен, г
Мастер, стандарт - Двуручка 9.05 5,8 42,3
Тигр Мастер х (Параллелум 934 х Монолит) Двуручка 7.05 6,3 42,1
Виват (Мастер х Параллелум 1416) х Хуторок Двуручка 12.05 7,0 40,3
Параллелум 191 7 Тигр х Мастер Двуручка 6.05 7,1 40,4
Параллелум 1930 Тигр х (Параллелум 1581 х Мастер) Двуручка 10.05 7,1 40,1
НСР05 0,3
Выводы. При создании раннеспелых сортов ячменя, не требующих яровизации (двуручки), рекомендуем использовать в качестве родительской формы сорт Мастер.
Список литературы
1. Савченко И.В., Прянишников А.И., Шабаев А.И Научное обеспечение устойчивого сельскохозяйственного производства в условиях нарастающей аридизации климата // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2014. № 6. С. 18-20.
2. Донцова А.А., Филиппов Е.Г. Новый перспективный сорт ячменя Тигр и оценка его комбинационной способности у гибридов Fi // Зерновое хозяйство России. 2013. № 5 (29). С. 40.
3. Леонова И.Н. Молекулярные маркеры: использование в селекции зерновых культур для идентификации, интрогрессии и пирамидирова-ния генов // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17. № 2. С. 314-315.
4. Злотина М.М., Ковалева О.Н., Лоскутов И.Г., Потокина Е.К. Использование аллель-специфичных маркеров генов Ppd и Vrn для прогнозирования продолжительности вегетационного периода сортов ячменя // Вавилов-ский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17. № 1. С. 50-62.
5. Turner A., Beales J., Faure S.The pseudo response regulator Ppd-H1 provides adaptation to
photoperiod in barley // Science. 2005. V. 310. P. 1031-1033.
6. Злотина М.М., Киселева А.А., Потокина Е.К. Использование аллель-специфичных маркеров генов VRN и PPD для экспресс-диагностики фотопериодической чувствительности и потребности в яровизации мягкой пшеницы и ячменя. Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 2012. 28 с.
7. Takahashi R., Yasuda S. Genetics of ear-liness and growth habit in barley // Barley Genetics II. Proc 2nd International Barley Genetics Symposium, Washington State University Press, 1971. P. 388-408.
8. Zitzewitz J., Szucs P., Dubcovsky J., et al. Molecular and structural characterization of barley vernalization genes // Plant Molecular Biology, 2005, V. 59, P. 449-467.
9. Trevaskis B., Bagnall D., Ellis M., et al. MADS box genes control vernalization-induced flowering in cereals // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, V. 100, P. 13099-13104.
10. Лебедева М.В., Теплякова С.Б. Молекулярное маркирование локуса VRN-H2 у ячменя с помощью мультиплексной ПЦР // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции, 2014. Т. 175. Вып. 4. С. 82-86.
11. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A. et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dy-
namics // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 8014-8018.
12. Jones H., Leigh F.J., Mackay I. et al. Population based resequencing reveals that the flowering time adaptation of cultivated barley originated east of the fertile crescent // Mol. Biol. Evol. 2008. V. 25. no. 10. P. 2211-2219.
13. GenBank: EU331957.1, URL: http: //www.ncbi.nlm.nih.gov / nuccore/ EU331957.1 [сайт] (дата обращения 19.12.2014)
14. Laurie D.A., Pratchett N., Bezant J.H. et al. RFLP mapping of five major genes and eight quantitative trait loci in a winter/spring barley (Hordeum vulgare L.) cross // Genome. 1995. V. 38. P. 575-585.
15. Casao M.C., Karsai I., Igartua E. et al. Adaptation of barley to mild winters: A role for PPDH2 // BMC Plant Biology. 2011. V. 11. P. 164-177.
Работа выполнена при финансовой поддержке межгосударственной целевой программы ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» №14.М04.12.0008.
Labelling of Ppd and Vrn genes in barley by means of PCR-analysis Alabushev A.V., correspondent member of RAS, Dontsova A.A., PhD in agriculture, Potokina E.K.,* DSc in biology All-Russian Scientific-research institute of Grain Crops after I. G. Kalinenko, Zernograd, Rostov region, Russia
*All-Russian N.I. Vavilov Institute of Plant Industry, St. Petersburg, Russia
During the last 15 years in Russia is observed the tendency of an increase in the average-daily temperature (+ 1-2°C) toward the average perennial value of index, increase in the arid days and decrease of atmospheric precipitations in the spring-summer period. One of the methods of increasing the yield of the crop of barley is the creation of precocious varieties whose pouring in of grain passes to more comfortable conditions in comparison with middle- and the late-maturing varieties. The involvement in the crossings of the donors of early maturity will make it possible to conduct breeding in this direction more goal-directed. For a barley molecular markers are worked out allowing to identify alleles of genes of photoperiodic reaction Ppd (photoperiod response) and reactions on the vernalization Vrn (vernalization response). The genes Ppd determine the reaction of plants of barley on length of day and, as a result, terms of efflorescing and beginning of earing of plants in the different growth conditions. The genes Vrn determine requirement of plants in a vernalization for passing to earing; thus participated in regulation of speed of development and expressed of yield structure in barley. In this study with help of an allele-specific molecular markers it is reveal that an early flowering barley variety Master bred in All-Russian Research Institute of Grain Crops carries the dominant Ppd-H1 allele that might explain its fast heading on the long photoperiod. It is recommended to use the Master variety as a donor of early maturing in breeding programs. Besides barley variety Master has winter-and-spring character which is testified by detection of recessive allele of vrn-H2 gene.
Key words: winter-and-spring barley, drought, precocity, PСR analysis, Ppd-H1, Vrn-H2, molecular markers, donor
References
1. Savchenko I.V., Pryanishnikov A.I., Shabaev A.I. Nauchnoe obespechenie ustoychi-vogo sel'skokhozyaystvennogo proizvodstva v usloviyakh naras-tayushchey aridizatsii klimata. [Scientific providing of sustainable agricultural industry under conditions of accruing climate aridization]. Doklady Rossiyskoy akademii sel'skokhozyay-stvennykh nauk. no. 6. 2014. pp. 18-20.
2. Dontsova A.A., Filippov E.G. Novyy perspektivnyy sort yachmenya Tigr i otsenka ego kombinatsionnoy sposobnosti u gibridov Fl. [A new perspective barley variety Tiger and an assess-
ment of his combinational ability at F1 hybrids].
Zernovoe khozyaystvo Rossii. 2013. no.5 (29). p. 40.
3. Leonova I.N. Molekulyarnye markery: ispol'zovanie v selektsii zernovykh kul'tur dlya identifikatsii, introgressii i piramidirovaniya genov. [Molecular markers: use in breeding of grain crops for identification, introgression and piramiding of genes]. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii, 2013. V. 17. no 2. pp. 314-315.
4. Zlotina M.M., Kovaleva O.N., Losku-tov I.G., Potokina E.K. Ispol'zovanie allel'-spetsi-fichnykh markerov genov Ppd i Vrn dlya progno-zirovaniya prodolzhitel'nosti vegetatsionnogo perioda sortov yachmenya. [Use of allele-specific
markers of genes Ppd and Vrn for forecasting of duration of the growth period in barley varieties]. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii. 2013. V. 17. no 1. pp. 50-62.
5. Turner A., Beales J., Faure S. The pseudo response regulator Ppd-H1 provides adaptation to photoperiod in barley. Science. 2005. V. 310. pp. 1031-1033.
6. Zlotina M.M., Kiseleva A.A., Potokina E.K. Ispol'zovanie allel'-spetsifichnykh markerov genov VRN i PPD dlya ekspress-diagnostiki fotoperio-dicheskoy chuvstvitel'nosti i potrebnosti v yarovi-zatsii myagkoy pshenitsy i yachmenya. [Use an al-lele-specific markers of genes VRN and PPD for express diagnostics of photoperiodic sensitivity and need for a vernalization of soft wheat and barley ]. Methodical recommendations. St. Petersburg, 2012. 28 p.
7. Takahashi R., Yasuda S. Genetics of ear-liness and growth habit in barley // Barley Genetics II. Proc 2nd International Barley Genetics Symposium, Washington State University Press, 1971. pp. 388-408.
8. Zitzewitz J., Szucs P., Dubcovsky J., et al. Molecular and structural characterization of barley vernalization genes. Plant Molecular Biology, 2005, V. 59. pp. 449-467.
9. Trevaskis B., Bagnall D., Ellis M., et al. MADS box genes control vernalization-induced
flowering in cereals. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, V. 100, pp. 13099-13104.
10. Lebedeva M.V., Teplyakova S.B. Mole-kulyarnoe markirovanie lokusa VRN-H2 u yachmenya s pomoshch'yu mul'tipleksnoy PTsR. [Molecular labelling of a locus of VRN-H2 at barley by means of multiplex PСR]. Trudy po prikladnoy botanike, genetike i selektsii, 2014. V. 175. Vyp. 4. pp. 82-86.
11. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A. et al. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. pp. 8014-8018.
12. Jones H., Leigh F.J., Mackay I. et al. Population based resequencing reveals that the flowering time adaptation of cultivated barley originated east of the fertile crescent // Mol. Biol. Evol. 2008. V. 25. no. 10. pp. 2211-2219.
13. GenBank: EU331957.1, URL: http: // www.ncbi.nlm.nih.gov /nuccore/EU331957.1 [сайт] (дата обращения 19.12.2014)
14. Laurie D.A., Pratchett N., Bezant J.H. et al. RFLP mapping of five major genes and eight quantitative trait loci in a winter/spring barley (Hordeum vulgare L.) cross. Genome. 1995. V. 38. pp. 575-585.
15. Casao M.C., Karsai I., Igartua E. et al. Adaptation of barley to mild winters: A role for PPDH2. BMC Plant Biology. 2011. V. 11. pp. 164-177.
УДК 633.13:631.527.5
Некоторые результаты и вопросы методологии селекции овса на устойчивость к эдафическому стрессу
Баталова Галина Аркадьевна, член-корреспондент РАН, зам. директора, Широких Ирина Геннадьевна, доктор биол. наук, зав. лабораторией, Тулякова Марина Валентиновна,* зав. лабораторией,
Шевченко Сергей Николаевич,** доктор с.-х. наук, директор, зав. лабораторией,
Русакова Ирина Ивановна, кандидат с.-х. наук, зав. лабораторией,
Абубакирова Роза Ильдусовна, мл. научный сотрудник,
Жуйкова Ольга Анатольевна, мл. научный сотрудник
ФГБНУ «НИИСХ Северо-Востока», г. Киров, Россия
* ФГБНУ «Фаленская селекционная станция», п. Фаленки, Россия
** ФГБНУ «Самарский НИИСХ», г. Безенчук, Россия
E-mail: g.batalova@mail.ru
Наиболее экономически важным экологическим стрессом Волго-Вятского региона является эдафический стресс, обусловленный ионной токсичностью водорода и алюминия дерново-подзолистых почв. В селекции устойчивых и толерантных к почвенной кислотности сортов овса пленчатого эффективно сочетание методов классической (гибридизация, скрининг) и клеточной селекции in vitro, окультуренного и естественно кислого (провокационного) почвенного фона, установок искусственного климата. Исследования проведены в Кировской и Самарской областях. Получены толерантные к почвенной кислотности сорта овса пленчатого 397h07 и 418h07 с урожайностью на окультуренных почвах 4,7-7,1 т/га и 2,7 т/га (на 0,4 т/га достоверно выше стандарта) в условиях почвенного стресса.
