CC BY
0
ЛОКАЛИЗАЦИЯ ГЕНОВ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ WRKY У ГРУШИ ОБЫКНОВЕННОЙ И РАЗРАБОТКА ПРАЙМЕРОВ IN SILICO
С.А. Вишняков, студент
Волгоградский государственный университет (Россия, г. Волгоград)
DOI:10.24412/2500-1000-2024-4-4-13-15
Аннотация. В ходе данного исследования были идентифицированы гены транскрипционных факторов WRKY57, WRKY32, WRKY3 в геноме груши обыкновенной. Также были разработаны наборы праймеров для анализа ПЦР в реальном времени. Проведённый био-информатический анализ обеспечил основу для дальнейшего функционального анализа и молекулярной эволюции генов WRKYу груши. Это особенно актуально для повышения засухоустойчивости груши путем манипулирования генами WRKY и молекулярной селекции.
Ключевые слова: засухоустойчивость, WRKY, транскрипционный фактор, груша обыкновенная, ПЦР in silico.
Транскрипционная регуляция экспрессии генов опосредуется факторами транскрипции, которые являются важнейшими регуляторными механизмами. Семейство WRKY является одним из ключевых семейств транскрипционных факторов у высших растений. Белки WRKY можно классифицировать по количеству доменов WRKY и особенностям их мотива цинковых пальцев. Белки WRKY связываются с ДНК мотивом T(T)TGAC(C/T), известным как W box, через консервативный мотив WRKYGQK на N-конце и мотив цинкового пальца C2H2 или C2HC на C-конце [1].
Экспрессия транскрипционных факторов WRKY индуцируется, когда растения подвергаются различным стрессовым воздействиям или защитным сигналам, таким как салициловая и жасмоновые кислоты. Кроме того, экспрессия WRKY является быстрой и обладает тканеспецифично-стью. Белки WRKY играют разнообразные функции в защите растений от различных стрессовых факторов, включая засуху, тепловой стресс, стресс от холода, повышенная засоленность почвы и различные инфекции. Изменение темпов роста и развития растений, метаболизм, трихомный и эмбриональный морфогенез, старение, биосинтез и регуляция гормональных сигналов не обходится без участия семейства белков WRKY [2, 3]. Растущие данные о секвенировании геномов различных видов растений предоставляют отличную плат-
форму для общегеномного анализа генов семейства WRKY.
Груша (Pyrus communis.) - одна из важнейших плодовых культур, широко употребляемый в свежем и переработанном виде, например, в виде пюре, джемов, сухофруктов и т.д. Существует большое разнообразие сортов груши, поскольку она коммерчески выращивается в многих странах по всему миру. В России, в соответствии с указом Президента Российской Федерации от 21.01.2020 г. № 20, груша входит в перечень видов сельскохозяйственных культур, выращивание которых направлено на обеспечение продовольственной безопасности РФ.
В полевых условиях груша часто испытывает абиотические стрессы, такие как засуха, засоленность почвы или повышенная температура воздуха, которые являются ключевым фактором, влияющим на рост, развитие и урожайность растения.
Целью данного исследования было идентифицировать хромосомное расположение генов транскрипционных факторов WRKY57, WRKY32, WRKY3 положительно регулирующих ответную реакцию на засуху у растений [4, 5, 6]. А также разработать наборы праймеров для ПЦР в реальном времени для возможности дальнейшей идентификации и оценки экспрессии генов у груши обыкновенной в экспериментальных условиях.
Материалы и методы
Для обнаружения последовательности генов в геноме груши, были поэтапно использованы сервисы HMMER, BLASTP и InterProScan. Первым этапом производился поиск предсказанных белков, содержащих домен WRKY Pfam PF03106. Далее был проведён бласт анализ, при помощи которого в дальнейшем удалось обнаружить хромосомное расположение искомых последовательностей.
В качестве референсного генома груши был взят Genome assembly ASM3717761v1 reference из базы данных NCBI Genome. Результаты и их обсуждение С помощью методов биоинформатиче-ского анализа было обнаружено хромосомное расположение трёх генов транскрипционных факторов, принимающих участие в ответе растения на стресс от засухи (табл. 1).
Таблица 1. Г редсказанные гены WR Y
Probable Gene Gene ID Evalue Chromosome Start End Len
WRKY 57 CM073990.1 0.0 16 3670088 3672696 2611
WRKY 32 CM073989.1 0.0 15 9673592 9675706 2115
WRKY 3 CM073983.1 4e-135 9 2895883 2898643 2760
Используя предсказанные последовательности были смоделированы 3 набора праймеров и зондов к участкам, которые предположительно являются кодирующими (табл. 2). Такой подход позволит в бу-
дущем оценивать экспрессию транскрипционных факторов WRKY груши для изучения резистентности растения на влияние абиотических факторов.
Таблица 2. Наборы праймеров для WRKY57, WRKY32 и WRKY3
Набор праймеров для WRKY57
№ Последовательность Tm, °C GC, % Самокомплиментарность Длина продукта, нк
Forward TCGTAGACGCGGACTGATTG 59.90 55.00 4.00
1 Reverse AGTACCACCCACGACAGAGA 59.89 55.00 4.00 259
Internal oligo CGATGGGGTCGAGGCAGGGG 61.02 75.00
Forward ACTTCATCGGGTTTGGAGGC 60.32 55.00 3.00
2 Reverse CCACGACAGAGACAGCAACA 60.25 55.00 3.00 75
Internal oligo TCCGGGTTGAAGTTCCAGCCGA 60.11 59.09
Forward CAGCCGAAGTCGCTGAGTAT 59.90 55.00 6.00
3 Reverse GCTCCGACAGCGTCTACTTC 60.52 60.00 4.00 70
Internal oligo TGCTGTCTCTGTCGTGGGTGGT 59.79 59.09
Набор праймеров для WRKY32
1 Forward CTTCGAGAACCTTGAGGGCT 59.39 55.00 4.00
Reverse TGGCAAGTGCAATGAACCAAG 59.93 47.62 5.00 238
Internal oligo CCGCCAGTTGTAACCATCTGAAGCA 59.50 52.00
Forward TCCGCCAGTTGTAACCATCT 59.02 50.00 4.00
2 Reverse TTGGCAAGTGCAATGAACCA 58.88 45.00 5.00 196
Internal oligo TGGGCTTGGAGCAGATGAAATGGATTG 59.59 48.15
Forward TTTCCGCCAGTTGTAACCATCT 60.22 45.45 4.00
3 Reverse GGCAAGTGCAATGAACCAAGATA 59.81 43.48 5.00 196
Internal oligo TGGGCTTGGAGCAGATGAAATGGATTG 59.59 48.15
Набор праймеров для WRKY3
Forward GAGATGCCTCTGGGGATTGC 60.54 60.00 6.00
1 Reverse CCTTGGCACAGGTTACTGCT 60.25 55.00 5.00 202
Internal oligo GTGGCTCTGTCGGGGCTGCT 61.16 70.00
Forward TGCCCATATTTCCGCCAGTT 60.03 50.00 4.00
2 Reverse CAATCCCCAGAGGCATCTCA 59.16 55.00 6.00 95
Internal oligo TGCAGGCCTATCAGTGGATGAAGGT 59.48 52.00
Forward GGTTGGGGGACTTCATGGTT 59.89 55.00 4.00
3 Reverse CCCCAGAGGCATCTCATTCT 58.86 55.00 6.00 241
Internal oligo CCAGCTTCTGCCCATATTTCCGCC 60.17 58.33
Библиографический список
1. Eulgem T., Rushton P. J., Robatzek S., Somssich I. E. The WRKY superfamily of plant transcription factors // Trends in plant science. - 2000. - Т. 5, № 5. - С. 199-206.
2. Chen X., Li, C., Wang H., Guo Z. WRKY transcription factors: evolution, binding, and action // Phytopathology Research. - 2019. - Т. 1, № 1. - С. 1-15.
3. Phukan U. J., Jeena G. S., Shukla R. K. WRKY transcription factors: molecular regulation and stress responses in plants // Frontiers in plant science. - 2016. - Т. 7. - С. 760.
4. Jiang Y., Qiu Y., Hu Y., Yu D. Heterologous expression of AtWRKY57 confers drought tolerance in Oryza sativa // Frontiers in Plant Science. - 2016. - Т. 7. - С. 145.
5. Zhang J., Huang D., Zhao X. et al. Drought-responsive WRKY transcription factor genes IgWRKY50 and IgWRKY32 from Iris germanica enhance drought resistance in transgenic Ara-bidopsis // Frontiers in Plant Science. - 2022. - Т. 13. - С. 983600.
6. Khoso M. A., Hussain A., Ritonga F. N. et al. WRKY transcription factors (TFs): Molecular switches to regulate drought, temperature, and salinity stresses in plants // Frontiers in plant science. - 2022. - Т. 13. - С. 1039329.
LOCALIZATION OF WRKY TRANSCRIPTION FACTOR GENES IN COMMON PEAR AND PRIMER DESIGN IN SILICO
S.A Vishnyackov, Student Volgograd State University (Russia, Volgograd)
Abstract. In this study, WRKY57, WRKY32, WRKY3 transcription factor genes were identified in the genome of Pyrus communis. Primer sets for real-time PCR analysis were also designed. The analysis provided a basis for further functional analysis and molecular evolution of WRKY genes in pear. This is particularly relevant for improving drought tolerance in pear by manipulating WRKY genes.
Keywords: drought tolerance, WRKY, transcription factor, common pear, in silico PCR..
