CC BY
1
doi:10.18286/1816-4501-2024-1-125-132 УДК 602.3:579.6
Оценка потенциала фага FBC - 216 УлГАУ для биоконтроля Bacillus cereus
Е. В. Сульдинан, старший преподаватель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза
Н. А. Феоктистова, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
А. В. Мастиленко, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза»
П. С. Майоров, кандидат биологических наук, доцент кафедры «Микробиология, эпизоотология и ветеринарно-санитарная экспертиза» ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ 432017. г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; He.suldina2006@yandex.ru
Резюме. В статье представлены результаты разработки мультиплексной системы на основе метода полимераз-ной цепной реакции в режиме реального времени для детекции специфичных фрагментов генов гемолизина Н1у, энтеротоксина HBL/NHE и цитотоксина CytK2 в геноме бактериофага FBc 216 УлГАУ, активного в отношении бактерий вида Bacillus cereus. Бактериофаг FBc 216 УлГАУ выделен из пробы почвы сельскохозяйственного назначения и селектирован с конечной концентрацией 11,36±0,02 lg БОЕ/мл, имеет строгую специфичность в отношении бактерий вида Bacillus cereus, широкий диапазон литической активности - 89 % и высокую устойчивость к воздействию факторов внешней среды (температура, кислотность). Фаг FBc 216 УлГАУ показал высокую стабильность при хранении в температурном диапазоне от -20°С до 22°С в течение 6 мес. как в жидкой форме, так и в лиофиль-новысушенном состоянии и продемонстрировал бактерицидный эффект in vitro в отношении Bacillus cereus при множественности инфекции (MOI) 0,01. В системе NCBI были определены полные нуклеотидные последовательности генов гемолизина (Н1у), энтеротоксина (HBL/NHE) и цитотоксина (CytK2). На консервативные участки указанных генов были подобраны праймеры и зонды, проведен синтез и оптимизация праймеров в мультиплексной системе ПЦР в реальном времени. В результате экспериментов в селектированном бактериофаге FBc 216 УлГАУ специфичных фрагментов, кодирующих основные факторы патогенности Bacillus cereus гемолизин (Hly), энтеро-токсин (HBL/NHE) и цитотоксин (CytK2), не выявлено. Полученные данные свидетельствуют о высоком потенциале фага FBc 216 УлГАУ для использования его в составе биопрепарата для биоконтроля Bacillus cereus. Ключевые слова: Bacillus pumilus, Bacillus cereus, бактериофаги, поливалентный биопрепарат, дезинфекция, биологическая дезинфекция, пищевой патоген, фаг, бактерии.
Для цитирования: Сульдина Е. В., Феоктистова Н. А., Мастиленко А. В., Майоров П. С. Оценка потенциала фага FBC - 216 УлГАУ для биоконтроля Bacillus cereus // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. 2024. № 1. (65). С. 125-132. doi:10.18286/1816-4501-2024-l-125-132_
Assessment of FBC - 216 ULGAU phage potential for biocontrol of Bacillus cereus
E. V. SuldinaH, N. A. Feoktistova, A. V. Mastilenko, P. S. Mayorov
FSBEI HE Ulyanovsk State Agrarian University 432017 Ulyanovsk, Novyi Venets Boulevard 1 He.suldina2006@yandex.ru
Abstract. The article presents results of the development of a multiplex system based on the polymerase chain reaction method in real time for detection of specific fragments of Hly hemolysin, HBL/NHE enterotoxin and CytK2 cytotoxin genes in the genome of FBc 216 UIGAU bacteriophage, active against bacteria of Bacillus cereus species. FBc 216 UIGAU bacteriophage was isolated from an agricultural soil sample and selected with a final concentration of 11.3610.02 lg PFU/ml, it has strict specificity for bacteria of Bacillus cereus species, a wide range of lytic activity - 89% and high resistance to environmental external factors (temperature, acidity). FBc 216 UIGAU phage showed high stability when stored in the temperature range from -20"C to 22"C for 6 months, both in liquid form and in a freeze-dried state and demonstrated a bactericidal effect in vitro against Bacillus cereus at infection multiplicity of (MOI) 0.01. The complete nucleotide sequences of the hemolysin (Hly), enterotoxin (HBL/NHE) and cytotoxin (CytK2) genes were determined in the NCBI system. Primers and probes were selected for conservative regions of these genes, and primers were synthesized and optimized in a multiplex real-time PCR system. As a result of experiments in the selected FBc 216 UIGAU bacteriophage, specific fragments encoding the main pathogenicity factors of Bacillus cereus hemolysin (Hly), enterotoxin
, вирусология, , вирусология, , вирусология,
(HBL/NHE) and cytotoxin (CytK2) were not identified. The data obtained indicate the high potential of FBc 216 UISAU phage for its use as part of a biological product for biocontrol of Bacillus cereus.
Keywords: Bacillus pumilus, Bacillus cereus, bacteriophages, polyvalent biological product, disinfection, biological disinfection, food pathogen, phage, bacteria.
For citation: Suldina E. V., Feoktistova N. A., Mastilenko A. V., Mayorov P. S. Assessment of FBC - 216 ULGAU phage potential for biocontrol of Bacillus cereus // Vestnik of Ulyanovsk state agricultural academy. 2024;1(65): 125-132 doi:10.18286/1816-4501-2024-1-125-132_
Исследования проводятся в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ,
выполняемых по заданию МСХ РФ в 2023 году
Введение
Безопасность пищевых продуктов, особенно связанная с действием микроорганизмов, является важной проблемой общественного здравоохранения, которую нельзя игнорировать [1]. Среди различных микробных агентов Bacillus cereus считается важным патогеном пищевого происхождения. Это грамположительная бактерия с высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям окружающей среды благодаря своей способности к споруляции [2]. В благоприятных условиях из споры прорастает вегетативная форма клетки, способная вызывать болезни пищевого происхождения [3]. Бактерии вида Bacillus cereus вызывают особую озабоченность из-за производимых ими энтеротоксинов и других факторов вирулентности, которые способствуют вспышкам пищевых отравлений [4]. Из-за своего повсеместного распространения, B. cereus может загрязнять различные пищевые продукты, включая пастеризованное молоко [5, 6], готовые к употреблению пищевые продукты [7], морепродукты [8] и овощи [9-11].
Пищевая промышленность обычно борется с B. cereus физическими и химическими методами, однако применение традиционных методов часто непомерно увеличивает затраты, влияет на наличие остаточных загрязняющих веществ, которые снижают качества конечного продукта [12], в том числе сенсорные, может влиять на здоровье человека и загрязнение окружающей среды. Таким образом, необходимы новые эффективные стратегии борьбы с контаминацией, вызванной B. cereus.
В последние годы бактериофаги снова приобрели популярность как эффективное средство контроля патогенов и борьбы с ними [13]. Фаги - это вирусы, способные инфицировать и элиминировать бактерии, что может использоваться для борьбы с инфекциями и бактериальными загрязнениями. Фаги размножаются в организме хозяина, что значительно снижает стоимость их применения. В настоящее время выделено и эффективно используется в пищевых продуктах множество бактериофагов, которые специфически воздействуют на патогены пищевого происхождения, такие как Cronobacter [14] и Salmonella [15]. Однако, до недавнего времени ученые не проявляли значительного интереса к фагам, активным в отношении B. cereus [16]. В настоящее время только несколько таких фагов тщательно
изучены, следовательно, есть необходимость в поиске новых штаммов фагов B. cereus и оценке их потенциала в качестве средства биоконтроля патогена в пищевых продуктах и на поверхностях, контактирующих с ними.
Одним из ключевых моментов в оценке производственно-перспективных фагов после изучения их биологических свойств является поиск в геноме фагов специфических фрагментов, кодирующих факторы патогенности. Основные факторы патогенно-сти Bacillus cereus связаны с гемолизином [14], энте-ротоксином (HBL/NHE) и цитотоксином [18].
Цель исследования - разработка мультиплексной системы ПЦР-РВ для детекции специфичных фрагментов генов гемолизина Hly, энтеротоксина HBL/NHE и цитотоксина CytK2 в геноме бактериофага FBc 216 УлГАУ, активного в отношении бактерий вида Bacillus cereus и являющегося кандидат-ным для включения в состав комбинированного средства.
Материалы и методы
Объектом исследования стал выделенный и охарактеризованный по биологическим свойствам бактериофаг FBc 216 УлГАУ, строго специфичный в отношении бактерий вида Bacillus cereus. Фаг был выделен из пробы почвы сельскохозяйственного назначения и селектирован с конечной концентрацией 11,36±0,02 lg БОЕ/мл. Литическая активность бактериофага оставалась стабильной в широких диапазонах температуры (4...90°C). Бактериофаг FBc 216 УлГАУ показал высокую стабильность при хранении в температурном диапазоне от -20°C до 22°C в течение 6 мес. как в жидкой форме, так и в лиофиль-новысушенном состоянии. Фаг продемонстрировал бактерицидный эффект in vitro в отношении Bacillus cereus при множественности инфекции (MOI) 0,01.
Полные нуклеотидные последовательности генов гемолизина Hly, энтеротоксина HBL/NHE и цитотоксина CytK2 определяли в системе NCBI. Множественное выравнивание генов проводили в Multiple Sequence Alignment Viewer 1.22.1 и UGENA 44.0.
Праймеры и пробы были сконструированы в системе Primer Blast NCBI.
Выделение ДНК осуществляли с помощью набора реагентов «РеалБест УниМаг» (Вектор Бест, Россия).
>NZ_CPül7060.1:c53277S7-5327140 Bacillus cereus strain F0RC_Ü47 chromosome, complete genome
ATGMTfiCTTATGTMGGGfiJiCCÄGTTAACGCfiTTTfiCTCaCTTAGOTGG&GCGATbTTfiTC&TTTbTTG CCTTATTAGCTATGCTTGTGAAAGTTTCTATTMGATrc^
GTTTGOTATTGGMTGaTGGTCCTTTATACGGCGTCaGCTGTGTATCATaGTGTTGTGGCCAATGMCGT
GTTATTTACTTCrTTAGGAAGCTAGATCATTCTATGATTTTTATATT^
TTTGCTTGATTACATTAAATTCAGCAAGTGGTrTACTATTATTT^^^
TGGCATTGTATTTAAMTGTTTTGGTTTMTTGTCCfiAG&TGGTTATCGfiCAGCAATTTATATTACGATG GGTTGGTTAATTGTTrTATTCTTTGCACCGTTAGCTGAGA^^
TACTTGGAGGCATTrrTTArACAATTGGTGGArTTATTTATGGAACAAAGCCAAAATGGTTAGAATTTAA ATATATGGGGCATCATGAMTTTTTCATGTTTTTGTATTATTAGGTAGTCTTGCGCATTTTCTMGTGTA TATTGTTACGTAATTTAA
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность гена гемолизина Bacillus cereus
— Graphical view of primer pairs
NZ_CP017060.1 • |5.327,asa ]Б327.1Ве( Find: 1 [ж О <3. ZS3SS30 JS.327,280 |5.327,2Se (5,327,300 ¡5.327.358 ^ J ¡5.327.400 jS.327.450 15,327.580 <Ü Tracks* : - |5.327.809 |5.327.8S0
[5.327.558 [5.327.600 15.327.658 |S.327.708 |5,327.750
Genes LfaLj LÜJ в О X
F0fiC4?^S£9145 ur-je 10997581
(Ü) Primer pairs fo job XlSM.FhCVfhywsXKvKfh9bK8SMefr-vang Об X
r '-'
_Л
г r~ f
15.327.050 16,327.100 15,327,150 15.327,200 [5,327,250 (5,327,380 £,327.350 (5.327.406 ¡5.327,450 [5.327,500 [5,327,550 [S.327.600 [S.327,650 [5.327,700 J5,327,7S0 |S,327.000 [5.327,050
NZ_CP0l7060,1: 5.3M..5.3M (642 nt) 0 Tracks shown: 3/8
Рис. 2. Система олигонуклеотидов для детекции гена гемолизина Bacillus cereus (схема фланкирования специфичных участков)
Primer pair 1
Sequence (5'->3") Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3' complementarity
Forward primer ACAATGCCACAAATCGCAGT Plus 20 5327429 5327448 59.04 45.00 3.00 2.00
Reverse primer TACGGCGTCAGCTGTGTATC Minus 20 5327620 5327601 59.90 55.00 6.00 0.00
Internal oligo ACACGTTCATTGGCCACAACACT Plus 23 5327576 5327598 57.67 47.83
Product length 192 Products on intended targets
>CP130491.1 Bacillus cereus strain T chromosome, complete genome
product length = 192
Forward primer 1 ACAATGCCACAAATCGCAGT 20
Template 5270225 ........................................5270244
Reverse primer 1 TACGGCGTCAGCTGTGTATC 20
Template 5270416 ........................................5270397
>CP135060.1 Bacillus cereus strain B126_1 chromosome, complete genome
Рис. 3. Система олигонуклеотидов для детекции гена гемолизина Bacillus cereus
>HZ_CP017060.1:1781359-1762936 Bacillus cereus strain F0KC_Ü47 chromosome, complete genome
ATGCbGAAAAGTTTTTATAAAAAATGTCriTTAGCGGTAATGATTGCTGGGGTGGCbACGAGTAACGCAT TCCCTTTACATCCTTTTGCAGCAGaACAAAATGTAAAGGTGCTACAAGAAAATGTGbAAAACTATTCTCT TGGACCAGCTGGATTCCAAGATGTMTGGCACAMCAACATCAAGTATATTTGCAATGGÄTTCATATGCA AAATTAATTCAAAATCAACAAGAGaCGGATTTAAGTAAAATAAGTTCGATTAATAGTGaATTTAAAGGGA ATATGATTCAGCATCAAAGAGATGCAAAAGTTAATGCAGCbTATTGGTTAAATAATATGAAGCCTCAAAT TATGbAAACGGATCAAAATATTATTAATTACAATAATACTTTCCAATCXTATTATAATGaCATGTTAATA GCGATTGbTCAAMGGATAGCGGAAAATTAAAAGCGGATTTAGAAAAGTTGTATGCGGATATTGTAAAGA ATCAAAATGbi^AGbTGGATTATTAGGaAATTTGAAAGCTTTTCGCGATAGAATGGCGAAAGATACAAA TAGTTTCAAAGAGG ATACbAATCAGTTAACAGCGbTATTGGCAAGTACGAATGCTGGTAT TCCAGC ГСТА GbGCAACAAATAAATACATATAACGATTCAATTAAAAAGAGTAATGATATGGTCATTGCTGGTGGCGTAC TTTGCGTAGCGCTAATAACATGTCTTGCrGGCGGGCCGATGATTGCGGTTGCGAAAAAAGATATCGCbAA TGCAGAAAGbGAAATCGCCAATTTAAAAGbTAGÜATTTCÜGGÜGCACAAGCAGAAGTCTTjyiTriTGbCT G&TGTAAAAAATAAAACAACAAACATGACAGAAACAATTG&TGCAGCAATTACAGCACTACAAAACATAT CAAATCAATGGTATACAGTAGGTGCAAAATATAATAATTTACTACAAAACGTAAAAGGaATTACTCCAGA AGAGTTTACGTTTATAAAAGAAGATTTACATACAGCGAAAGATAGCTGGAAAGATGTAAAGGATTATACA GAAAAATTACATGAAGGTGTGGCAAAGTAA
Рис. 4. Нуклеотидная последовательность гена энтеротоксина HBL/NHE Bacillus cereus
Для постановки ПЦР применяли реакционную смесь «БиоМастер» (Биолампикс, Россия) и стандартный набор лабораторного оборудования и расходных материалов.
Результаты
В системе NCBI была определена последовательность гена гемолизина (Hly) для Bacillus cereus (рис. 1).
Выявили, что последовательность гена, кодирующего гемолизин Bacillus cereus как фактор патоген-ности имеет полную гомологию с участком, кодирующим аналогичный фактор патогенности в геноме Bacillus thuringensis. Таким образом, определена вероятность горизонтального переноса данной последовательности между этими видами.
В системе NCBI Primer Blast была сконструирована система олигонуклеотидов (праймеров и зонда) (рис. 2, 3) для детекции специфической последовательности, характерной для гена
гемолизина. В качестве флуоресцентной метки зонда TaqMan для ПЦР в реальном времени был использован краситель FAM с гасителем BHQ-1.
Относительно гена энтеротоксина Bacillus cereus в системе NCBI была определена его нуклеотид-ная последовательность (рис. 4).
При множественном выравнивании было выявлено, что последовательность гена, кодирующего энтеротоксин Bacillus cereus, имеет 97 % совпадения с аналогичной последовательностью в геноме Bacillus thuringensis. Это объясняется тем, что последний входит в группу близкородственных видов под общим наименованием «cereus group».
Были сконструированы праймеры (рис. 5, 6) и зонд для детекции специфической последовательности, характерной для гена энтеротоксина HBL/NHE. В качестве флуоресцентной метки зонда TaqMan для ПЦР в реальном времени был использован краситель VIC с гасителем BHQ-2.
Рис. 5. Система олигонуклеотидов для детекции гена энтеротоксина HBL/NHE Bacillus cereus (схема фланкирования специфичных участков)
Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop Tm GC% Self complementarity Self 3 complementarity
Forward primer GCAACGAGTAACGCATTCCC Plus 20 1781913 1781932 59.90 55.00 5.00 3.00
Reverse primer TACGCAAAGTACGCCACCAG Minus 20 1782566 1782547 60.67 55.00 4 00 1.00
Internal oligo AGCTTTTCGCGATAGAATGGCGA Plus 23 1782386 1782408 57.28 47.83
Product length 654
Products on intended targets
>CPQ17060,1 Bacillus cereus strain FORCJJ47. complete genome product length = 654
Forward primer 1 GCAACGAGTAAlGlATTCCC 20
Template 1731913 .................... 1731932
Reverse primer 1 TACGCAAAGTAL GLC ACC AG 20
Template 1732566 .................... 17S2547
>CP011153.1 Bacillus cereus strain CMCO P0D11, complete genome
Рис. 6. Система олигонуклеотидов для детекции гена энтеротоксина HBL/NHE Bacillus cereus
>NZ_GPül7ücü.1:clG95 B75-1Q94B65 Bacillus сессия strain F0RC_Ü47 chromosome, coif'lete genome
bTG^TCGTrCTfiAMCbTÜTTTÜÜMTG^TbSCbTTbTCCGCTGrTTrTGCrbGrbGCSCTGTMCTC TTTC&ACACCTGCTGCnTACGCTCAAACGACGTCAC&AGTTGTMC^
ACÄTACGAGCTATAATACÄTTTAATAATGATCüAGCTGfi.TAATATGACAJiTGrCTTTAAAGOTAACTTTT ATCGÄTGA€€€AAGCGCrGÄTAÄÄ€AGaTTG€€GTTATTAATACÄÄCTGOTAGrTTTCTAAAÄGCAAÜTC CrACTATAAGTGATGCACCTATTGATAÜCTACCCAATCCCTGGCGCTAGTGCAACATTACGTTATCCTTC ACAATATGATGTTGCATTTAACCTTCAAGATAACAGC GCTCCTTTCTTTAACGTAJGCACC TACAAATGCT GrAGAAGAAACGACTGrAACATCTAGCGTATCTTATCAACTTGGTGSCTCTGTTAAGGCTTCTGrAAGGC! CTAATGGACCCAGCGGTGAAGCTGGIGCAACTGGrCAAGICACTTGGICGGaCTCTGrAAGCTATAAACA AACTAGTTATAAAACAAATTTAATTGACCAAACAAACAAAAACGTAAAATGGAACGTATTCTTTAACGGA TATMCAATCAAAACTGGGGTATTTACACACGTGATTCTTATCATTCTTTATATGGAAACCAACTGTTCA TGrACTCTCGCACATACCTATATGAATCTGATGCAAAAGGTAATTTAATACCGATGGATCAACTTCCAGC ACrAA€AAATAGCGGTTTCTCT€CTGGTATGATCGCTGTTGTTATCTCTGAAAAAAATA€AGAT€AATCT AACTTACAAGTCGCTTATACAAAAGAGGGCGACG1AGTACGAACTTCGTCCAGGCTACACATTTGGAACTG CAAACTGGGTTGGAAACAACGTAAAAGACGTTGATCAAAAAACATTTAATAAATTGTTCACACTAGATTG GAAGAATAAGAAATTAGTAGAGAAAAAATAA
Рис. 7. Нуклеотидная последовательность гена CytK2 Bacillus cereus
— Graphical view of primer pairs
, ri Query_l • ■ 1 Rnd: Q - Ф Ф a. I : St í Tools- О - -
150 . . lie? . |150 zee ¡ |£58 . ш ¡ |зш 350 ¡ ¡ [400 *se ¡ ¡ pe |sse ¡ ¡ ¡see [sie |7i m ¡7se ¡si [■0 |8S0 ¡900 050 ^^^М
{Ü) Primer pairs for job 0TPnS6xSo£qGxKTBqaGA8S06kcH-qir<
Primer 7 l^fe— Prisser 3|S¡¡?—
159....., Ц59
|858 |3W.....|358
|4S& . |58@
1658 1788 |7Se
Query_l; l,.1.0K(i,0il nt)
|858 . |959 l.WI|
Ф Tracks shown: 2/3
Рис. 8. Система олигонуклеотидов для детекции гена CytK2 Bacillus cereus (схема фланкирования специфичных участков)
Primer pair 1
Sequence (5'->3') Template strand Length Start Stop Tm Self complementarity Self 3' complementarity
Forwaid primer GGCGCTAGTGCAACATTACG Plus 20 322 341 59.57 55.00 6.00 3.00
Reverse primer GCTGGGTCCATTAGGCGTTA Minus 20 504 485 59.82 55.00 4.00 2.00
Internai oligo GCGCTCGTTTCTTTAACGTAGCACC Plus 25 386 410 59.20 52.00
Products on intended targets
>CPQ17060.1 Bacillus cereus strain F0RC_047. complete genome
product length = 183 Forward primer 1 Template 1095554
GGCGCTAGTGCflACATTACG 20
Reverse primer Template
1 GCTGGGTCCATTAGGCGTTA 20 1095372 .................... 1095391
Рис. 9. Система олигонуклеотидов для детекции гена CytK2 Bacillus cereus
При множественном выравнивании гена цито-токсина CytK2 для Bacillus cereus установлено, что его последовательность (рис. 7) имеет 96,4% сродство с последовательностью гена цитотоксина бактерий группы «cereus».
Для детекции специфической последовательности, характерной для гена CytK2 в системе NCBI Primer Blast, была сконструирована система олигонуклеотидов (праймеров и зонда) (рис. 8, 9) с флуоресцентной меткой зонда TaqMan использован краситель ROX с гасителем BHQ-2.
После синтеза и оптимизации праймеров в мультиплексной системе ПЦР в реальном времени проведены эксперименты по детекции специфичных фрагментов генов гемолизина (Hly), энтеротоксина (HBL/NHE) и цитотоксина (CytK2) в геноме изолированного бактериофага FBc 216 УлГАУ (табл. 1, рис. 10-12), специфичного в отношении Bacillus cereus и являющегося кандидатным для включения в состав комбинированного фагового препарата для биологической дезинфекции.
Были подобраны оптимальные показатели цикла для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с флуоресцентным зондом:
1. Предварительная денатурация - 950C - 5 минут - 1 цикл
2. Денатурация - 950C в течение 5 сек. Отжиг-60 0C в течении 15 сек - 40 циклов.
Таблица 1. Результаты амплификации при детекции консервативных участков генов гемолизина Hly (FAM), энтеротоксина HBL/NHE (HEX/VIC), цитотоксина CytK2 (ROX) в ДНК бактериофага FBc 216 УлГАУ, специфичного в отношении Bacillus cereus
Номер Идентификатор про- Cp, Cp, Cp,
лунки бирки Fam Hex Rox
1. Al FBc 216 УлГАУ
2. A2 FBc 216 УлГАУ
3. A3 FBc 216 УлГАУ
4. B9 Bacillus cereus (+) 24,0 24,8 25,5
5. C9 Bacillus cereus (+) 24,1 22,8
6. G8 Bacillus cereus (+) 28,3 28,8
О 300
о ф
200
m
100
----
16 21 26 Номер цикла
--
36
/ /
/ /
/
у Л
Рис. 10. Результаты амплификации при детекции консервативного участка гена гемолизина Hly (FAM), в ДНК бактериофага FBc 216 УлГАУ, специфичного в отношении Bacillus cereus
6
il
100
90
80
70
u
s
3 T 60
(1)
3 ti 50
в)
œ о 40
^
L, e 30
20
10
0
11
I
16
I
21
I
26
I
31
I
36
Номер цикла
Рис. 11. Результаты амплификации при детекции консервативного участка гена энтеротоксина HBL/NHE (HEX/VIC) в ДНК бактериофага FBc 216 УлГАУ, специфичного в отношении Bacillus cereus
100
80
I
Ф ^
и ф
а.
о ^
е
60
31
36
1 6 11 16 21 26 Номер цикла
Рис.12. Результаты амплификации при детекции консервативного участка гена цитотоксина CytK2 (ROX) в ДНК бактериофага FBc 216 УлГАУ, специфичного в отношении Bacillus cereus
В результате проведенных экспериментов в геноме бактериофага FBc 216 УлГАУ специфичных фрагментов генов гемолизина, энтеротоксина HBL/NHE и цитотоксина CytK2, кодирующих основные факторы патогенности бактерий вида Bacillus cereus, не выявлено.
Обсуждение
Бактериофаги признаны перспективным средством для формирования биологической антимикробной стратегией при контроле патогенов в пищевом производстве [19]. Всё чаще появляются новые варианты применения фагов для контроля патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах и производственных средах. Описан бактериофаг FBc 216 УлГАУ, активный в отношении Bacillus cereus. При изучении биологических свойств фага FBc 216 УлГАУ установили, что фаг обладает высокой литической активностью 11,36±0,02 lg БОЕ/мл, значительной устойчивостью к воздействию факторов окружающей среды и стабильностью при хранении, что свидетельствует о его потенциале для достижения прогнозируемого антимикробногоо эффекта. В ранее проведенных исследованиях большинство фагов Bacillus имели узкий диапазон литической активности и были способны воздействовать только на ограниченное число штаммов [16, 20]. Однако, фаг FBc 216 УлГАУ обладает широким спектром действия и способен инфицировать 89 % бактериальных штаммов.
Фаги часто несут интегразы, гены устойчивости к антибиотикам или гены вирулентности, но в проведенном исследовании генов, кодирующих основные факторы патогенности бактерий вида Bacillus cereus в геноме бактериофага FBc 216 УлГАУ, не выявлено.
Фаг FBc 216 УлГАУ может быть использован для биологической дезинфекции в пищевой промышленности и биоконтроля Bacillus cereus в пищевых продуктах как самостоятельно, так и в составе комбинированного средства для более эффективного удаления патогенов на производственных линиях [21].
Заключение
В результате проведенных исследований по детекции специфичных фрагментов генов гемолизина (Hly), энтеротоксина (HBL/NHE) и цитотоксина (CytK2), кодирующих основные факторы патогенно-сти бактерий вида Bacillus cereus в геноме бактериофага FBc 216 УлГАУ с помощью мультиплексной системы ПЦР-РВ, таковых не выявлено. Полученные данные подтверждают высокий потенциал фага FBc 216 УлГАУ для использования его в составе биопрепарата для биоконтроля Bacillus cereus.
40
Литература
1. Food safety considerations and research priorities for the cultured meat and seafood industry / K. J. Ong, J. Johnston, I. Datar et al. / Comprehensive reviews in food science and food safety. 2021. Т. 20. №. 6. С. 5421-5448. doi: 10.1111/1541-4337.12853.
2. Huang Y., Flint S. H., Palmer J. S. Bacillus cereus spores and toxins-The potential role of biofilms // Food microbiology. 2020. Vol. 90. P. 103493. doi: 10.1016/j.fm.2020.103493.
3. Assessing the toxic potential of enteropathogenic Bacillus cereus / N. Jessberger, M. Kranzler, C. Da Riol et al. // Food microbiology. 2019. Vol. 84. P. 103276. doi:10.1016/j.fm.2019.103276.
4. Bacillus cereus: epidemiology, virulence factors, and host-pathogen interactions / D. E. Tuipulotu, A. Mathur, C. Ngo et al. //Trends in Microbiology. 2021. Vol. 29. No. 5. P. 458-471. doi: 10.1016/j.tim.2020.09.003.
5. Prevalence, virulence genes, antimicrobial susceptibility, and genetic diversity of Bacillus cereus isolated from pasteurized milk in China / T. Gao,T. Gao, Y. Ding, Q.Wu et al. // Frontiers in Microbiology. 2018. Vol. 9. P. 533. doi 10.3389/fmicb.2018.00533
6. Characterization of Bacillus cereus in dairy products in China // X. Y. Liu, Q. Hu, F. Hu et al. // Toxins. 2020. Vol. 12. No. 7. P. 454. doi: 10.3390/toxins12070454
7. Prevalence and antimicrobial-resistant characterization of Bacillus cereus isolated from ready-to-eat rice products in Eastern China // J. Chen J. Zhang, L. Zhan et al. // Frontiers in microbiology. 2022. Vol. 13. P. 964823. doi: 10.3389/fmicb.2022.964823
8. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data / C. Chen et al. // Molecular plant. 2020. Vol. 13. No. 8. P. 1194-1202.
9. Bacillus cereus isolated from vegetables in China: incidence, genetic diversity, virulence genes, and antimicrobial resistance / P. Yu et al. // Frontiers in microbiology. 2019. Vol. 10. P. 948. doi:10.3389/fmicb.2019.00948.
10. Olaimat A. N., Holley R. A. Factors influencing the microbial safety of fresh produce: a review // Food microbiology. 2012. .Vol. 32. No. 1. P. 1-19. doi: 10.1016/j.fm.2012.04.016.
11. Food of plant origin: production methods and microbiological hazards linked to food-borne disease. Reference: CFT/EFSA/BI0HAZ/2012/01 Lot 1 (Food of plant origin with high water content such as fruits, vegetables, juices and herbs) / E. Hackl et al. // EFSA Supporting Publications. 2013. Vol. 10. No. 4. P. 402E. doi: 10.2903/sp.efsa.2013.EN-402
12. Emerging chemical and physical disinfection technologies of fruits and vegetables: a comprehensive review / L. Z. Deng et al. // Critical reviews in food science and nutrition. 2020. Vol. 60. No. 15. P. 2481-2508. doi: 10.1080/10408398.2019.1649633.
13. Kakasis A., Panitsa G. Bacteriophage therapy as an alternative treatment for human infections. A comprehensive review //International journal of antimicrobial agents. 2019. Vol 53. No. 1. P. 16-21. doi:10.1016/j.ijantimi-cag.2018.09.004.
14. Novel phage vB_CtuP_B1 for controlling Cronobacter malonaticus and Cronobacter turicensis in ready-to-eat lettuce and powered infant formula / H. Zeng et al. // Food Research International. 2021. Vol. 143. P. 110255. doi:10.1016/j.foodres.2021.110255.
15. Application of a novel phage vB_SalS-LPSTLL for the biological control of Salmonella in foods / Y. Guo et al. // Food Research International. 2021. Vol 147. P. 110492. doi:10.1016/j.foodres.2021.110492/
16. A novel Bacillus cereus bacteriophage DLn1 and its endolysin as biocontrol agents against Bacillus cereus in milk / N. Li et al. // International Journal of Food Microbiology. 2022. Vol. 369. P. 109615. doi:10.1016/j.ijfoodmi-cro.2022.109615.
17. A new Bacillus cereus DNA-binding protein, HlyIIR, negatively regulates expression of B. cereus haemolysin II / Z. I. Budarina et al. // Microbiology. 2004. Vol. 150. No. 11. P. 3691-3701. doi 10.1099/mic.0.27142-0
18. Phelps R. J., McKillip J. L. Enterotoxin production in natural isolates of Bacillaceae outside the Bacillus cereus group //Applied and Environmental Microbiology. 2002. Vol. 68. No. 6. P. 3147-3151. doi 10.1128/AEM.68.6.3147-3151.2002.
19. Endersen L., Coffey A. The use of bacteriophages for food safety //Current Opinion in Food Science. 2020. Vol. 36. P. 1-8. doi 10.1016/j.cofs.2020.10.006.
20. Characterization of Bacillus cereus in dairy products in China / X. Y. Liu et al. //Toxins. 2020. Vol. 12. No. 7. P. 454. doi 10.3390/toxins12070454.
21. Understanding and exploiting phage-host interactions / E. Stone, K. Campbell, I. Grant et al. // Viruses. 2019. Vol. 11. P. 567. doi 10.3390/v11060567.
References
1. Food safety considerations and research priorities for the cultured meat and seafood industry / K. J. Ong, J. Johnston, I. Datar et al. / Comprehensive reviews in food science and food safety. 2021. T. 20. №. 6. C. 5421-5448. doi: 10.1111/1541-4337.12853.
2. Huang Y., Flint S. H., Palmer J. S. Bacillus cereus spores and toxins-The potential role of biofilms // Food microbiology. 2020. Vol. 90. P. 103493. doi: 10.1016/j.fm.2020.103493.
3. Assessing the toxic potential of enteropathogenic Bacillus cereus / N. Jessberger, M. Kranzler, C. Da Riol et al. // Food microbiology. 2019. Vol. 84. P. 103276. doi:10.1016/j.fm.2019.103276.
4. Bacillus cereus: epidemiology, virulence factors, and host-pathogen interactions / D. E. Tuipulotu, A. Mathur, C. Ngo et al. //Trends in Microbiology. 2021. Vol. 29. No. 5. P. 458-471. doi: 10.1016/j.tim.2020.09.003.
5. Prevalence, virulence genes, antimicrobial susceptibility, and genetic diversity of Bacillus cereus isolated from pasteurized milk in China / T. Gao,T. Gao, Y. Ding, Q.Wu et al. // Frontiers in Microbiology. 2018. Vol. 9. P. 533. doi 10.3389/fmicb.2018.00533
6. Characterization of Bacillus cereus in dairy products in China // X. Y. Liu, Q. Hu, F. Hu et al. // Toxins. 2020. Vol. 12. No. 7. P. 454. doi: 10.3390/toxins12070454
7. Prevalence and antimicrobial-resistant characterization of Bacillus cereus isolated from ready-to-eat rice products in Eastern China // J. Chen J. Zhang, L. Zhan et al. // Frontiers in microbiology. 2022. Vol. 13. P. 964823. doi: 10.3389/fmicb.2022.964823
8. TBtools: an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data / C. Chen et al. // Molecular plant. 2020. Vol. 13. No. 8. P. 1194-1202.
9. Bacillus cereus isolated from vegetables in China: incidence, genetic diversity, virulence genes, and antimicrobial resistance / P. Yu et al. // Frontiers in microbiology. 2019. Vol. 10. P. 948. doi:10.3389/fmicb.2019.00948.
10. Olaimat A. N., Holley R. A. Factors influencing the microbial safety of fresh produce: a review // Food microbiology. 2012. .Vol. 32. No. 1. P. 1-19. doi: 10.1016/j.fm.2012.04.016.
11. Food of plant origin: production methods and microbiological hazards linked to food-borne disease. Reference: CFT/EFSA/BIOHAZ/2012/01 Lot 1 (Food of plant origin with high water content such as fruits, vegetables, juices and herbs) / E. Hackl et al. // EFSA Supporting Publications. 2013. Vol. 10. No. 4. P. 402E. doi: 10.2903/sp.efsa.2013.EN-402
12. Emerging chemical and physical disinfection technologies of fruits and vegetables: a comprehensive review / L. Z. Deng et al. // Critical reviews in food science and nutrition. 2020. Vol. 60. No. 15. P. 2481-2508. doi: 10.1080/10408398.2019.1649633.
13. Kakasis A., Panitsa G. Bacteriophage therapy as an alternative treatment for human infections. A comprehensive review //International journal of antimicrobial agents. 2019. Vol 53. No. 1. P. 16-21. doi:10.1016/j.ijantimi-cag.2018.09.004.
14. Novel phage vB_CtuP_B1 for controlling Cronobacter malonaticus and Cronobacter turicensis in ready-to-eat lettuce and powered infant formula / H. Zeng et al. // Food Research International. 2021. Vol. 143. P. 110255. doi:10.1016/j.foodres.2021.110255.
15. Application of a novel phage vB_SalS-LPSTLL for the biological control of Salmonella in foods / Y. Guo et al. // Food Research International. 2021. Vol 147. P. 110492. doi:10.1016/j.foodres.2021.110492/
16. A novel Bacillus cereus bacteriophage DLn1 and its endolysin as biocontrol agents against Bacillus cereus in milk / N. Li et al. // International Journal of Food Microbiology. 2022. Vol. 369. P. 109615. doi:10.1016/j.ijfoodmi-cro.2022.109615.
17. A new Bacillus cereus DNA-binding protein, HlyIIR, negatively regulates expression of B. cereus haemolysin II / Z. I. Budarina et al. // Microbiology. 2004. Vol. 150. No. 11. P. 3691-3701. doi 10.1099/mic.0.27142-0
18. Phelps R. J., McKillip J. L. Enterotoxin production in natural isolates of Bacillaceae outside the Bacillus cereus group //Applied and Environmental Microbiology. 2002. Vol. 68. No. 6. P. 3147-3151. doi 10.1128/AEM.68.6.3147-3151.2002.
19. Endersen L., Coffey A. The use of bacteriophages for food safety //Current Opinion in Food Science. 2020. Vol. 36. P. 1-8. doi 10.1016/j.cofs.2020.10.006.
20. Characterization of Bacillus cereus in dairy products in China / X. Y. Liu et al. //Toxins. 2020. Vol. 12. No. 7. P. 454. doi 10.3390/toxins12070454.
21. Understanding and exploiting phage-host interactions / E. Stone, K. Campbell, I. Grant et al. // Viruses. 2019. Vol. 11. P. 567. doi 10.3390/v11060567.
