CC BY
23
УДК 579.6:578.5
DOI 10.18286/1816-4501-2019-3-124-130
РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ДЕТЕКЦИИ HBL ENTEROTOXIN В ГЕНОМЕ БАКТЕРИОФАГОВ BACILLUS PUMILIS
Феоктистова Наталья Александровна, кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; 8(8422)55-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Ключевые слова: бактериофаг, Bacillus pumilis, HBL enterotoxin, система праймеров, геном В статье представлена молекулярно-генетическая характеристика бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА, подтверждена его оригинальность и вирулентная природа, что позволяет его использовать в составе биопрепарата для деконтаминации плодоовощной продукции и результаты разработки системы детекции HBL enterotoxin в геноме бактериофагов, специфичных для Bacillus pumilis. Для бактериофага FBm-8 УГСХА, трижды секвенированного, была составлена карта линейной ДНК c расшифровкой кодирующих областей генома. Проведено картирование генов, для которых были и не были определены гомологии. Установлено, что качественный состав протеинов изучаемого бактериофага соответствует таковым у аннотированных аналогов и имеет четкие гомологии нуклеотидного и аминокислотного наборов. Определено, что использование фенольно-хлороформной экстракции приводит к наилучшему выходу матричной ДНК FBm-8 УГСХА. На основании консервативных участков гена были подобраны праймеры для детекции гена HBL enterotoxin методом ПЦР, так как с позиции горизонтального переноса факторов патогенности у бактерий рода Bacillus одним из важных является данный энтеротоксин. Характеристика праймеров: прямой праймер (f) 5'-3' - GAGATGCAAAAATTAATGCGGCG; обратный праймер (r) 5'-3' - TGCGATTCCTAGCGGAGTTC; расчетная температура плавления прямого праймера - 60,0 °С; расчетная температура плавления обратного праймера - 59,9 °С; теоретическая специфичность - Bacillus pumilis; длина амплифицируемого участка (п.о.) - 366. В результате исследований была разработана ПЦР-система для индикации наличия фрагмента гена HBL enterotoxin, которая позволила определить отсутствие фрагментов вирулентного гена HBL enterotoxin бактерий Bacillus в геноме бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА, что свидетельствует о возможном его использовании в составе биопрепарата для обработки плодоовощной продукции.
Исследования проводятся в соответствии с Тематическим планом научно-исследовательских работ, выполняемых по заданию МСХ РФ в 2019 году.
Введение
Известно, что Bacillus spp. входят в группу почвенных сапрофитов и , таким образом, являются источником контаминации продуктов питания, включая овощи, специи и злаки [1-3]. Bacillus cereus является достаточно изученным бактериальным агентом, вызывающим пищевые отравления, вырабатывающим термостойкий рвотный токсин (cereulide), термочувствительные диарей-ные энтеротоксины (HBL, NHE и BcET) [4-6]. По литературным данным, продукция токсинов, аналогичных вышеназванным, была зафиксирована у других представителей рода Bacillus: B. mycoides, B. subtilis, B. pumilus, B. thuringiensis, B. licheniformis, B. circulans, B. lentus, которые относительно редко идентифицируются при пищевых отравлениях [78].
Bacillus pumilus - фитопатогенные бактерии, поражающие сельскохозяйственные культуры, такие как кукуруза, столовая свекла, плоды апельсина и абрикоса, цукини, тыква, клубни картофеля, семенники белокочанной капусты, технические культуры: хлопчатник и лен, что наносит экономи-
ческий ущерб сельскохозяйственным и перерабатывающим предприятиям [9]. Вышеназванные бактерии в ассоциации с Bacillus subtilis являются возбудителями «картофельной болезни хлеба», которая связана с разрушением структуры хлеба, изготовленного из пшеничной муки под действием протеолитических и амилолитических ферментов. Определенная роль отводится термофильным формам Bacillus pumilus при самосогревании зерна [10]. На основании проведенных филогенетических исследований, основанных на изучении последовательности 16S рРНК, Bacillus pumilus входит в «Bacillus subtilis group» [11]. Исследователи отмечают, что высокая генетическая гетерогенность характерна для многих представителей «Bacillus subtilis group», выделенных из одного источника [12].
В настоящее время метод обработки бактериофагами пищевого сырья и готовой продукции, способствующий увеличению сроков хранения (биопроцессинг), позволяет эффективно элиминировать микрофлору, контаминирующую пищевое сырье и продукты питания [13]. Установлено, что
fiНДТсвупкэгаяд 11Г npcilgn^Tigjг.t
ПИШИ ¡ЬдГийлУЫтЛГдп [rgfah
HWOSi ifWKT'Si nWJi
mm
■nyiJi FWM_55
dcL-^nudco^dc ironoahjuihfltG kiraL-c
ЯШПИ
__
гавгрпТ!
CMA po.l^iT^rqsv 111 ftJhMirtJ
lFlfft_371
бактериофаги являются агентами горизонтального переноса генов от бактерии к бактерии [14], поэтому есть необходимость изучения кандидатных бактериофагов, предназначенных для деконтаминации продуктов питания растительного происхождения, молекулярно-ге-нетическими методами для определения их потенциальной способности к переносу генов бактерий.
Цель исследований - дать молекулярно-генетическую характеристику бактериофагу Bacilluspumilis FBm-8 УГСХА для подтверждения его оригинальности и вирулентной природы, что позволит его использовать в составе биопрепарата для обработки плодоовощной продукции и разработать систему детекции HBL enterotoxin в геноме бактериофагов, специфичных для Bacillus pumilis.
Объекты и методы исследований
Бактериофаг Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА был выделен из пробы почвы и характеризовался следующими показателями: литическая активность - 4,0х109±0,3х109 БОЕ/мл по Грацио, диапазон литического действия - специфичен для 77,3 % бактериальных культур Bacillus pumilis из 22 музейных штаммов НИИЦМиБ ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ, не лизирует культуры гомологичного рода.
Методы выделения и изучения биологических свойств бактериофагов многократно были апробированы автором [15-17].
Для получения полноразмерных нуклео-тидных последовательностей генома FBm-8 УГ-СХА применяли метод полногеномного секвени-рования ДНК бактериофагов второго поколения (lonTorrent, ThermoFisherScientific, США).
Бактериофаг FBm-8 УГСХА был секвениро-ван трижды. Полученные результаты были подвергнуты биоинформационному анализу. Высокая достоверность при сборе генома бактериофага обеспечивалась фильтрацией качества прочтений (ридов). В экспериментах использовалась информация, полученная из международных баз данных GeneBank, DDBJ,EMBL. Сборка генома осуществлялась программным обеспечением Newbler (Roche/454 GS-FLX)
iFlMJ-76. iHhfOs.
BfJcnuJMiN
ядра .npöl
inm.il
iHMiZi
flOTGSi
frntc?'
ргдца
head mcrphcgBnaiii prutnin
= a Pf'pnc^e ^ i П -
sihCIa
flWLtS
IfWÜT*_
ptiagniinjr npjrahpjggneHS pfdhiiii
ЯП 431'
tu* m»nJIT pratnin
1 ctaTapjkc, trta-ft^iftj ^«sidai
HipfiM
Рис. 1 - Карта линейной ДНК бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА, где проведено дешифрование кодирующих областей генома
В исследованиях использовали спектрофотометр Nanodrop 2000/2000c (ThermoFisher), ам-плификатор («MaxyGene», AXYGEN Scientific, США). С целью оптимизации ПЦР-протокола, в реакциях с Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА применяли методику электрофореза в агарозном геле. Результаты исследований Нами был проведен спектр исследований, направленных на изучение молекулярно-генетиче-ской характеристики бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА: определялся размер фагового генома, рассматривался процент идентичности с максимально близкими с точки зрения таксономии бактериофагами, осуществлялось определение наличия в составе ДНК FBm-8 УГСХА гена, кодирующего HBL enterotoxin.
На рис. 1 собранный геном бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА сравнивали с ДНК бактериофагов, которые были депонированы в GenBank NCBI.
Далее были составлены карты линейных ДНК выделенного и селекционированного нами бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА. С учетом известных аналогов определялись продукты экспрессии его генов (рис. 2).
Установлено, что качественный состав белков бактериофага FBm-8 УГСХА аналогичен с аннотированными аналогами, имеет четкие гомологии аминокислотного и нуклеотидного наборов.
В структуре протеинов фага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА выявлена закономерность, которая присуща бактериофагам - это присутствие структурных и неструктурных компонентов. Установлены продукты генов, которые не имеют четко определенных функциональных характеристик.
Рис. 2 - Карта линейной ДНК фага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА (картирование генов, для которых: А) определены гомологии, Б) не определены гомологии)
Это так называемые «гипотетические белки», имеющие аналоги в аннотированных в базах данных (GeneBank, EMBL, DDBJ) в геномах бактериофагов, активных в отношении Bacillus pumilis.
Одним из основных критериев при отборе кандидатного бактериофага для целей био-процессинга является определение отсутствия в структуре его генома «островков патогенности». Если рассматривать горизонтальный перенос генов, кодирующих факторы патогенности, то у бактерий рода Bacillus одним из важных вирулентных факторов является энтеротоксин, входящий в HBL-комплекс, структура которого закодирована в гене HBL enterotoxin.
Первоначально был проанализирован ну-клеотидный состав и проведено выравнивание гена энтеротоксина с целью определения кон-
сервативных участков. Фрагменты исследований представлены на рис. 3.
С учетом полученной выше информации были подобраны праймеры для детекции гена HBL enterotoxin методом ПЦР. Его отсутствие будет свидетельствовать о перспективности применения изучаемого бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА при обработке плодоовощной продукции. Данные подбора представлены на рис. 4-5.
Для экстракции нуклеиновых кислот были использовано несколько различных технологий их очистки от протеинов и ферментов, которые усложняют постановку реакции, иногда ингибируют действие ДНК-полимеразы [18].
После экстрагирования ДНК мы осуществляли измерение оптической плотности при 260 нм, 280 нм и 230 нм. Использовали расчеты А260/А230, позволяющие вычесть примеси, которые не относятся к поглощению светового потока ДНК. Для определения чистоты нуклеиновых кислот применяли расчеты А260/А280 (чистой для использования в ПЦР, считалась ДНК при коэффициенте не менее 1,8).
При определении коэффициента чистоты ДНК установлено, что фенольно-хлороформная экстракция является эффективным методом для выделения и ее очистки.
Далее мы определили пару праймеров, которая отвечает следующим условиям: GC должно быть не более 60%, температура плавления составляет = 60°С, длина ампликона находится в диапазоне от 200 до 400 п.н., длина праймеров составляет от 18 до 24 п.н. (табл. 1).
После подбора праймерных систем к участку гена HBL enterotoxin - GAGATGCAAAAATTAATGCGGCG и TGCGATTCCTAGCGGAGTTC - определялась их работоспособность и специфичность, а также оптимизировались режимы постановки полимеразно-цепной реакции на пробах, содержащих экстрагированную ДНК музейных и полевых штаммов Bacillus pumilis. Для этого был проведен цикл исследований по постановке ПЦР с детекцией методом горизонтального электрофореза в агарозном геле. Температура отжига праймеров выбиралась эмпирически с учетом их расчетных температур плавления и необходимости создания универсального протокола ПЦР для индикации искомого ДНК.
Диапазон температур, с которым нам пришлось работать, был достаточно велик - 50-75°С. Определено, что температура отжига +60 °С является оптимальной для системы праймеров, применяемой для выявления гена, кодирующего HBL enterotoxin. В процессе исследований была определена оптимальная программа амплификации
Рис. 3 - Фрагмент выравнивание гена HBL enterotoxin
Рис. 4 - Подбор системы праймеров к участку гена HBL enterotoxin
ins
ks ¡в
Primer pair 1
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair2 Sequence <5'->3') GAGATG CAAAMTTAATG С G GC G TG CG ATTC CTAGCG GAGTTC 366 Template strand Plus Minus Length 23 20 Start 369 734 Stop 391 715 Tm 60.06 59.90 GC% 43.48 55.00 Self complementarity 6.00 4.00 Self 3" complementarity 3.00 2.00
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair3 Sequence (5"->3") ATG CAAAMTTMTG С G G С GTA CTGTC G С AAC AGATGMC CG 289 Template strand Plus Minus Length 22 20 Start 372 660 Stop 393 641 Tm 58.22 59.56 GC% 36.36 55.00 Self complementarity 6.00 8.00 Self 3" complementarity 3.00 2.00
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair4 Sequence (5'->3') AGATG CAAAMTTAATG С G GC GTA ATG CG ATTC CTAGCG GAGTT 366 Template strand Plus Minus Length 24 20 Start 370 735 Stop 393 716 Tm 60.44 59.25 GC% 37.50 50.00 Self complementarity 6.00 4.00 Self 3" complementarity 3.00 0.00
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair5 Sequence (5'->3") G CAAAAATTAATGC G GC GTATTG G AATGC GATTC CTAG CG GAGT 363 Template strand Plus Minus Length 24 20 Start 374 736 Stop 397 717 Tm 60.55 59.25 GC% 41.67 50.00 Self complementarity 7.00 4.00 Self 3" complementarity 3.00 2.00
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair6 Sequence <5'->3") CAAAMTTAATG С G G С GTATTG G С GATTC CTAG CG GAGTTCCT 358 Template strand Plus Minus Length 23 20 Start 375 732 Stop 397 713 Tm 57.94 58.97 GCW 39.13 55.00 Self complementarity 7.00 4.00 Self 3' complementarity 3.00 2.00
Forward primer Reverse primer Product length Primer pair7 Sequence (5'->3') AG AGATG С AAAMTTMTG С G G С G ATTG G GC CTAMG CTGTC GC 306 Template strand Plus Minus Length 24 20 Start 368 673 Stop 391 654 Tm 61.26 61.03 GC% 41.67 55.00 Self complementarity 6.00 6.00 Self 3" complementarity 3.00 2.00
Forward primer Reverse primer Product length
Sequence (5'->3")
TTAATG С G G С GTATTG GTTAMT GCAATTGGGCCTAAAGCTGTC
Template strand
Plus Minus
Start Stop Tm
GC%
34.78
Self complementarity
7.00
Рис. 5 - Подбор системы праймеров к участку гена HBL enterotoxin
Таблица 1
Характеристика системы праймеров к участку гена, кодирующего HBL enterotoxin
Self 3' complementarity
2.00 2.00
Таблица 2
Разработанный алгоритм амплификации
ДНК
Параметр Характеристика
участок гена HBL enterotoxin
Праймер1 А) 5'-3' GAGATGCAAAAATTAATGCGGCG
Праймер 2 (г) 5'-3' TGCGATTCCTAGCGGAGTTC
Расчетная температура плавления прямого праймера 60,0°С
Расчетная температура плавления обратного праймера 59,9°С
Размер ампликона, п.н. З66
Для амплификаторов с активным регулированием (по
раствору в пробирке): «Терцик» (НПО «ДНК-Техноло-
гия», Россия)
№ цикла Шаг Температура Длительность Количество повторов
1 1 95°С 1 мин 1
1 95°С 10 сек
2 2 600С 10 сек З0
З 72°С 20 сек
З 1 72°С 2 мин 1
Рис. 6 - Результаты амплификации фрагмента гена HBL enterotoxin электрофоретиче-ским методом: М - маркер молекулярного веса; 1,2 - положительный контроль; 3 - бактериофаг FBm - 8 УГСХА - Bacillus pumilus; 4 - отрицательный контроль
1! SEIS
ES SS
»1
¡с Si
M
ü ш са i H ü Si
(табл. 2), которая позволила добиться определенной специфичности для подобранной системы праймеров, позволяющей осуществлять идентификацию гена, кодирующего HBL enterotoxin в ДНК штаммов Bacillus pumilis.
Методом подбора была установлена концентрация для каждого из праймеров, которая составила 10 pmol на реакцию в объеме 25 мкл.
Для визуализации результатов полимераз-но-цепной реакции применяли метод электрофореза (рис. 6).
В результате исследований нами была разработана ПЦР-система для индикации наличия фрагмента гена HBL enterotoxin. Ее применение позволило определить, что фрагментов вышеназванного гена в геноме бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА обнаружено не было, что свидетельствует о возможности его использовании в составе биопрепарата, разрабатываемого для деконтами-нации плодоовощной продукции.
Выводы
Результаты секвенирования генома бакте-
риофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА, подвергнутые биоинформационному анализу, позволили установить, что качественный состав белков фага аналогичен с аннотированными аналогами и имеет четкие гомологии аминокислотного и нукле-отидного наборов. В структуре протеинов FBm-8 УГСХА выявлена закономерность, которая присуща бактериофагам - это присутствие структурных и неструктурных компонентов. Установлены продукты генов, которые не имеют четко определенных функциональных характеристик. Это так называемые «гипотетические белки», имеющие аналоги в аннотированных в базах данных (GeneBank, EMBL, DDBJ) в геномах бактериофагов, специфичных для Bacillus pumilis.
Определено, что фенольно-хлороформная экстракция является эффективным методом для очистки ДНК бактериофага FBm-8 УГСХА.
Разработана система молекулярно-гене-тической детекции (постановка ПЦР) фрагмента гена HBL enterotoxin в геноме фагов, специфичных для Bacillus pumilis, которые являются кандидат-ными для средства деконтаминации плодоовощной продукции. Система праймеров для индикации участков гена HBL enterotoxin в геноме фагов Bacillus pumilis включает прямой праймер (f) 5'-3'
- GAGATGCAAAAATTAATGCGGCG и обратный праймер (r) 5'-3' - TGCGATTCCTAGCGGAGTTC, имеет расчетную температуру плавления прямого праймера
- +60,0 °С и обратного праймера - +59,9 °С, длина амплифицируемого участка составляет 366 п.о. Специфического фрагмента гена HBL enterotoxin в геноме бактериофага Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА, поиск которого проводили с применением разработанной системы молекулярно-генетической детекции, выявлено не было.
Полученные в результате экспериментов данные позволяют рекомендовать бактериофаг Bacillus pumilis FBm-8 УГСХА для конструирования нового высокоэффективного фагового биопрепарата.
Библиографический список
1. Griffiths, M.W. Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp. present in milk / M.W. Griffiths // Journal of Food Protection. - 1990. - № 53.
- P. 790-792.
2. Incidence of Bacillus cereus and Bacillus subtilis in foods in The Netherlands / M.C. Te Giffel, R.R. Beumer, S. Leijendekkers, F.M. Rombouts // Food Microbiol. - 1996. - Vol. 13. - P. 53-58.
3. Beattie, S.H. Detection of toxigenic strains of Bacillus cereus and other Bacillus spp. with an improved cytotoxicity assay / S.H. Beattie, A.G. Williams // Lett.
Appl. Microbiol. - 1999. - Vol. 28. - P. 221-225.
4. Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolated in a gastroenteritis outbreak investigation / S.G. Jackson, R.B. Goodbrand, R. Ahemd, S. Kasatiya // Lett. Appl. Microbiol. - 1995. - Vol. 21. - P. 103-105.
5. Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning / M.S. Salkinoja-Salonen, R. Vuorio, M.A. Andersson, P. Ka'mpfer, M.C. Andersson, T. Honkanen-Buzalski, A.C. Scoging // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. - P. 4637-4645.
6. Production of diarrheal enterotoxins and other potential virulence factors by veterinary isolates of bacillus species associated with nongastrointestinal infections / N.J. Rowan, G. Caldow, C.G. Gemmell, I.S. Hunter // Applied and environmental microbiology. -2003. - Vol. 69, № 4. - P. 2372-2376.
7. McKillip, J. L. Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review / J.L. McKillip // Antonie Leeuwenhoek. - 2000. - Vol. 77. - P. 393-399.
8. Putative virulence factor expression by clinical and food isolates of Bacillus spp. after growth in reconstituted infant milk formulae / N.J. Rowan, K. Deans, J.G. Anderson, C.G. Gemmell, I.S. Hunter, T. Chaithong // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67. - № 9. - P. 3873-3881.
9. Асколонов, С.П. Пищевые заболевания, вызываемые спорообразующими бактериями Bacillus subtilis и Bacillus mesentericus / С.П. Аско-лонов, А.И. Ильченко // Вопросы питания. - Киев: Госмедиздат УССР, 1962. - С.226-229.
10. Гигиеническая оценка контаминации муки возбудителями картофельной болезни / О.В. Пельц, Е.Я. Долгушина, Н.Н. Аксенова, [и др.] // Медицина в Кузбассе: спецвыпуск. - 2003. - № 5. - С. 74-75.
11. Distinct differentiation of closely related species of Bacillus subtilis group with industrial importance / K. Jeyaram, W. Romi, T.A. Sing, G.A. Adewumi, K. Basanti, F.A. Oguntoyinbo // Journal of Microbiological Methods. - 2011. - Vol. 87. - P. 161164.
12. Sicuia, O.A. Biodiversity of Bacillus subtilis group and beneficial traits of Bacillus species useful in plant protection / O.A. Sicuia, F. Constantinscu, C.C. Petru^a // Romanian Biotechnological Letters. - 2015. - Vol. 20, № 5. - P. 10737- 10750.
13. Инновационные направления использования бактериофагов в сфере санитарно-эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации / А.В. Алешкин, Э.А.Светоч, Н.В. Воло-жанцев, И.А.Киселева, Е.О. Рубальский, О.Н. Ершова, Л.И. Новикова // Бактериология. - 2016. - Том 1, № 1. - С. 22-32.
1!
£ & ES SS »1
Si
р и ш Sä ;ii H ■ i
са s!
14. Крылов, В.М. Роль горизонтального переноса генов бактериофагами в возникновении патогенных бактерий / В.М. Крылов // Генетика. -2003. - Том 39, № 5. - C. 595-620.
15. Методы выделения бактериофагов бактерий Bacillus / М.А. Юдина, Н.А. Феоктистова, В.А. Макеев [и др.] // Вестник Ветеринарии. - 2011.- № 4. - С.88-89.
16. Белова, К.В. Бактериофаги Bacillus coagulans: способ выделения и параметры культивирования / К.В. Белова, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной
сельскохозяйственной академии. - 2016. - № 2 (34). - С. 80-86.
17. Выделение бактериофагов, специфичных к Bacillus anthracis / Е.И. Климушкин, Н.А. Феоктистова, Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, А.В. Алеш-кин, К.В. Белова // Биокиров - 2015. Материалы III Международного форума. - Киров, 2015 - С. 10-12.
18. Аукенов, Н.Е. Выделение и очистка нуклеиновых кислот. Состояние проблемы на современном этапе / Н.Е. Аукенов, М.Р. Масабаева, У.У. Хасанова // Наука и здравоохранение. - 2014. - № 1. - С.51-53.
DEVELOPMENT OF HBL ENTEROTOXIN DETECTION SYSTEM IN BACTERIOPHAGE GENOME BACILLUS PUMILIS
Feoktistova N.A.
FSBEI HE Ulyanovsk State Agricultural Academy 432017, Ulyanovsk, Novy Venets boulevard, 1; 8 (842255-95-47 e-mail: feokna@yandex.ru
Key words: bacteriophage, Bacillus pumilis, HBL enterotoxin, primer system, genome
The article presents results of studies on the molecular genetic characteristics of Bacillus pumilis FBm-8 UGSkHA bacteriophage in order to confirm its originality, virulent nature to determine the appropriateness of its use as part of a biological product that will potentially be used in treatment of fruit and vegetable products and to develop a HBL enterotoxin detection system in the genome of bacteriophages specific for Bacillus pumilis. A linear DNA map was compiled for a three times sequenced bacteriophage, with a decoding of the coding regions of the genome. Mapping was performed for genes for which homology was determined and not defined. It was established that the qualitative composition of the proteins of the studied bacteriophage corresponds to those of annotated analogues and has clear homology of the nucleotide and amino acid sets. It was determined that the use of phenol-chloroform extraction leads to the best yield of template DNA. Based on the conserved regions of the gene, primers were selected for detection of the HBL enterotoxin gene by PCR, since the position of horizontal transfer of pathogenicity factors in bacteria of Bacillus genus is one of the most important enterotoxin. Primer characteristics: direct primer (f) 5'-3 '- GAGATGCAAAAATTAATGCGGCG; reverse primer (r) 5'-3 '- TGCGATTCCTAGCGGAGTTC; the calculated melting temperature of the direct primer is 60.0 ° C; the estimated melting temperature of the reverse primer is 59.9 ° C; theoretical specificity - Bacillus pumilis; the length of the amplified part (bp) is 366. As a result of the studies, we developed a PCR system to indicate the presence of the HBL gene fragment enterotoxin, which allowed us to determine that the fragments of the virulent HBL gene enterotoxin of Bacillus bacteria in the genome of Bacillus pumilis FBm-8 UGSKhA bacteriophage was not found, which indicates its possible use as part of a biological product developed for treatment of fruits and vegetables.
Bibliography
1. Griffiths, M. W. Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp. present in milk / M.W. Griffiths // Journal of Food Protection. -1990. - № 53. - pp. 790-792.
2. Incidence of Bacillus cereus and Bacillus subtilis in foods in The Netherlands/M.C. Te Giffel, R. R. Beumer, S. Leijendekkers, F. M. Rombouts // Food Microbiol. -1996. - Vol. 13. - pp. 53-58.
3. Beattie, S.H. Detection of toxigenic strains of Bacillus cereus and other Bacillus spp. with an improved cytotoxicity assay / S.H. Beattie, A.G. Williams // Lett. Appl. Microbiol. -1999. - Vol. 28. - pp. 221-225.
4. Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis isolated in a gastroenteritis outbreak investigation /S.G. Jackson, R.B. Goodbrand, R. Ahemd, S. Kasatiya/Lett. Appl. Microbiol. -1995. - Vol. 21. - pp. 103-105.
5. Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning / M.S. Salkinoja-Salonen, R. Vuorio, M.A. Andersson, P.Ka'mpfer, M.C. Andersson, T. Honkanen-Buzalski, A. C. Scoging //Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. - pp. 4637-4645.
6. Production of diarrheal enterotoxins and other potential virulence factors by veterinary isolates of bacillus species associated with nongastrointestinal infections/N.J. Rowan, G. Caldow, C. G. Gemmell, I.S. Hunter//Applied and environmental microbiology. - 2003. - Vol. 69, № 4. - pp. 2372-2376.
7. McKillip, J. L. Prevalence and expression of enterotoxins in Bacillus cereus and other Bacillus spp., a literature review / J. L. McKillip // Antonie Leeuwenhoek.
- 2000. - Vol. 77. - pp. 393-399.
8. Putative virulence factor expression by clinical and food isolates of Bacillus spp. after growth in reconstituted infant milk formulae / N.J. Rowan, K. Deans, J.G. Anderson, C.G. Gemmell, I.S. Hunter, T. Chaithong //Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol. 67. - № 9. - pp. 3873-3881.
9. Askolonov, S.P. Nutritive diseases caused by spore-forming Bacillus subtilis and Bacillus mesentericus bacteria /S.P. Askolonov, A.I. Ilchenko //Nutrition issues. - Kiev: State Medical Publishing House of the Ukrainian SSR, 1962 - P.226-229.
10. Peltz, O.V. Hygienic evaluation of flour contamination with pathogens of potato disease / O.V. Peltz, E.Ya. Dolgushina, N.N. Aksenova, [et al.] // Medicine in Kuzbass, special issue. 2003, No. 5. P. 74-75.
11 Distinct differentiation of closely related species of Bacillus subtilis group with industrial importance / K. Jeyaram, W. Romi, T.A. Sing, G.A. Adewumi, K. Basanti, F.A. Oguntoyinbo//Journal of Microbiological Methods. - 2011. - Vol. 87. - pp.161-164.
12. Sicuia, O.A. Biodiversity of Bacillus subtilis group and beneficial traits of Bacillus species useful in plant protection / O.A. Sicuia, F. Constantinscu, C.C. Petrufa // Romanian Biotechnological Letters. - 2015. - Vol. 20. - № 5. - pp. 10737-10750.
13. Aleshkin, A.V. Innovative directions for of bacteriophage usage in the field of sanitary and epidemiological welfare of the population of the Russian Federation/A.V. Aleshkin, E.A. Svetoch, N.V. Volozhantsev, I.A. Kiseleva, E.O. Rubalskiy, O.N. Ershova, L.I. Novikova//Bacteriology. - 2016. - V. 1. - No. 1. - P. 22-32.
14. Krylov, V.M. The role of horizontal gene transfer by bacteriophages in case of occurrence of pathogenic bacteria / V.M. Krylov // Genetics. - 2003. - V 39.
- No. 5. - P. 595-620.
15. Methods for isolation of Bacillus bacteria bacteriophages / M.A. Yudina, N.A. Feoktistova, V.A. Makeev [et al.] // Vestnik of Veterinary Medicine. - 2011.-No. 4. - P. 88-89.
16. Belova, K.V. Bacteriophages of Bacillus coagulans: isolation method and cultivation parameters / K.V. Belova, N.A. Feoktistova D.A. Vasiliev // Vestnik of Ulyanovsk State Agricultural Academy. - 2016. - No. 2 (34). - P. 80-86.
17. Isolation of bacteriophages specific for Bacillus anthracis // E.I. Klimushkin, N.A. Feoktistova D.A. Vasiliev, S.N. Zolotukhin, A.V. Aleshkin, K.V. Belova // Biokirov - 2015: proceedings of the III International Forum. - 2015 - P. 10-12.
18. Aukenov, N.E. Isolation and purification of nucleic acids. The state of the problem at the present stage / N.E. Aukenov, M.R. Masabaeva, Yu. Yu. Khasanova //Science and Health. - 2014. - No. 1. - P.51-53.
