CC BY
94
УДК 619:616.98:578.831.1:615.371/372
ЛИПОСОМЫ - ТРАНСПОРТЕРЫ ВАКЦИНЫ ПАРАГРИППА-3
Магдеева Э.А. - аспирант; Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой; *Гумеров В.Г. - к.в.н., ведущий научный сотрудник Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана * Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности,
г. Казань, тел.: 89656024924
Ключевые слова: парагрипп-3, липосомы, антиген, вакцина. Кеу words: parainfluenza-3, liposome, antigen, vaccine.
На сегодняшний день липосомы представляются наиболее
многообещающими по сравнению с другими возможными переносчиками не только потому, что они биодеградируемы, а также из-за уникальных веществ, позволяющих включать в их внутреннее водное пространство водорастворимые, а в липидный бислой - водонерастворимые препараты, целенаправленно доставлять их в нужные области организма, снижать их токсичность и продлевать действие, предохраняя препараты от воздействия агрессивной физиологической среды [1]. Липосомы - универсальны. Они не вызывают защитные и аллергические реакции организма, могут переносить широкий круг фармакологически активных веществ: противоопухолевые и
противомикробные препараты, гормоны, ферменты, вакцины, а также дополнительные источники энергии для клетки, генетический материал [2]. Липосомы нетоксичны, сами липиды не обладают иммуногенностью, включенные в липосомы вещества не вызывают пирогенные, токсические, аллергические реакции организма. Все эти особенности липосом могут быть весьма эффективно реализованы в вакцинных препаратах [3].
Вакцинопрофилактика рассматривается как одно из ведущих массовых эффективных средств борьбы с инфекциями. Разработка эффективных носителей антигена, обеспечивающих формирование выраженного и длительного сохраняющегося иммунитета, является одной из сложнейших задач в производстве вакцинных препаратов [4].
Целью данной работы было изучение эффективности сочетанного применения ассоциированной инактивированной
вакцины против парагриппа-3 на основе липосомальных структур.
Материалы и методы. Работа выполнена на кафедре микробиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» и в отделе вирусологии ФГБУ «Федерального центра
токсикологической, радиационной и биологической безопасности».
В качестве основного компонента для построения липосом, использовали лецитин, который выделили из яичного желтка. Для этого в пробирку поместили 0,5 г сухого измельченного яичного желтка и добавили к нему 3 мл этилового спирта. Отфильтровав жидкость в сухую пробирку, добавили несколько капель ацетона. Появившаяся муть свидетельствовала об осаждении лецитина. Образовавшуюся суспензию перелили в центрифужные пробирки и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 3-4 минут. Надосадочную жидкость сливали, а осадок подвергали лиофильному высушиванию.
Были изготовлены три варианта экспериментальных липосомальных
вакцин:
1 вариант. Яичный лецитин растворили в 1,0 мл 96% этанола, и впрыснули при помощи шприца (игла 0,4x30,0 мм) в 15 мл 0,01М фосфатного буфера (рН 7,5), в котором предварительно растворили 1 мл антигена парагриппа-3 с гемагглютинирующим титром 1:128.
2 вариант. Лецитин растворили в 3 мл эфира, и внесли в круглодонную колбу роторного испарителя объемом 100 см3. 1 мл антигена парагриппа-3 (титр 1:128) растворили в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,5) и добавили к раствору фосфолипидов. Затем обработали
ультразвуком 22 кГц мощностью 200Вт в течении 8-10 минут до тех пор, пока не образовалась эмульсия. После полного растворения липидов колбу с эмульсией присоединили к роторному испарителю и на водяной бане при температуре +40 оС и пониженном давлении, создаваемым водоструйным насосом (4+2 мм рт.ст.), провели выпаривание эфира. После окончательного выпаривания растворителя в колбу добавили 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,5) и встряхивали до образования гомогенной структуры липосом.
В 3 варианте вакцины использовалась та же методика выделения и смешивания липосом, что в предыдущем методе, отличие только в этапе добавления антигена парагриппа-3. Фосфолипиды растворили в эфире и добавили 0,01 М фосфатный буфер (рН 7,5). Раствор обработали ультразвуком 22 кГц и роторным испарителем, постоянно понижая давление, чтобы эмульсия не вскипела. В конце к раствору добавили 5 мл 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,5) и 1 мл антигена парагриппа-3, встряхивая до образования гомогенной структуры липосом.
Обрабатывая технологические стадии получения липосомальных композиций, выбрали оптимальное соотношение лецитина и антигена и в качестве раствора для регидратации липидной пленки - 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,5.
Было сформировано четыре группы лабораторных мышей, 3 опытных и 1 контрольная, по 10 мышей в каждой группе. Мышам вводили подкожно экспериментальные вакцины в дозе 0,1 мл. Контрольной группе ввели
инактивированную ГОА вакцину против парагриппа-3, изготовленную в ФГБУ «ФЦТРБ» по общепринятой технологии. Взятие крови для серологической реакции проводили: до вакцинации через 14 дней (ревакцинация) и через 28 дней после первого введения вакцины.
Результаты исследований.
Гемагглютинины к вирусу парагриппа-3 в сыворотке крови мышей определяли в реакции торможения гемагглютинации с использованием диагностического набора ФГУ Курской биофабрики - фирмы «БИОК».
В реакции торможения
гемагглютинации использовали рабочее разведение антигена, содержащее в 0,25 мл 4 АЕ. В 10 пробирок с 0,2 мл физиологического раствора добавили по 0,05 мл сыворотки крови, взятой из 8 мышей (по 2 мыши из каждой группы), 9 и 10 пробирки - контрольные. Все пробирки поместили в водяную баню на 30 минут при 56 оС. В лунки планшета налили по 0,025 мл физ. раствора и 0,025 мл сыворотки, которые титровали до 7-го ряда с последующим внесением 0,025 мл антигена во все лунки кроме последнего 8-го, и выдержали при комнатной температуре в течении одного часа. Затем во все лунки добавили по 0,05 мл эритроцитов. Результаты реакции учитывали по характеру осаждения эритроцитов на дно лунки.
Результаты исследований (таблица 1) показали, что у всех мышей до вакцинации отсутствовали специфические антитела к вирусу ПГ-3. При исследовании сывороток крови на 14 день после вакцинации был выявлен одинаковый рост антител к вирусу ПГ-3 во всех группах. При этом средний титр специфических антител в группах составил 1: 40.
Исследования, проведенные на 28 день после вакцинации, во 2,3 и контрольных группах животных, выявили антитела в титрах 1:160, в 1-ой группе они были ниже и равны к 1:80, что указывает на иммунологическую перестройку организма лабораторных животных. При этом отмечено, что в группах с липосомальными вакцинами титры антител были на порядок выше.
Таблица 1 - Результаты серологических исследований
№ группы мыши вакцина Сроки исследования
липосомальная вакцина 1-й день (вакцинация) 14 день 28 день
Титры антител в РТГА на ПГ-3
1 1 метод «инжекции» 0 1:40 1:120
2 0 1:20 1:80
2 1 метод «выпаривания и обращения фаз» 0 1:40 1:320
2 0 1:40 1:320
3 1 Метод «выпаривания и обращения фаз с добавлением АГ после гомогенизации и испорения» 0 1:40 1:320
2 0 1:40 1:320
4 1 Инактивированная вакцина против ПГ-3 0 1:40 1:160
2 0 1:40 1:160
Заключение. Таким образом, соответствующих индексу защиты от
экспериментальные серии вакцин, парамиксовирусной инфекции крупного
способствовали выработке специфических рогатого скота.
антител к вирусу парагриппа-3 в титрах,
ЛИТЕРАТУРА: 1. Грегориадис Г., Аллисон Л. и др.// Липосомы в биологических системах. - М.: Медицина.-1983.-С.36-39. 2. Бабицкая С.В., Жукова М.В., Кисель М.А. и др.// Химико-фарм. журнал, 2006.- №3.-С.36-38. 3. Научные ведомости Белгородского государственного университета / Г.И. Борщевский., Т.Г. Ярных// Научный журнал.- 2014.-№11.-С.247-249. 4. Медуницын Н.В. «Вакцинология». Изд. 2-е, перераб. и доп.— М.: Триада-Х, 2004. — 448 с.
ЛИПОСОМЫ - ТРАНСПОРТЕРЫ ВАКЦИНЫ ПАРАГРИППА-3
Магдеева Э.А, Галиуллин А.К, Гумеров В.Г.
Резюме
В статье представлены результаты сочетанного применения инактивированной вакцины против парагриппа-3 с липосомами. Экспериментальные серии вакцин способствовали выработке специфических антител к вирусу парагриппа-3 в титрах, соответствующих индексу защиты от парамиксовирусной инфекции крупного рогатого скота.
LIPOSOMY- CONVEYORS VACCINE PARAINFLUENZA -3
Magdeeva E.A , Galiullin A.K , Gumerov V.G.
Summary
The article presents the results of combined use of an inactivated vaccine against parainfluenza -3 with liposomes. Experimental vaccine series , promoted the production of specific antibodies to parainfluenza -3 in the credits of the relevant index of protection against paramyxovirus infection in cattle.
