CC BY
28
is^^T/ребёнка
КёУчна пед1атр1я / Clinical Pediatrics
УДК 616.379-008.64-053.2-08:612.017.1 ПОПОВА В.В.
ДУ «1нститут ендокринологн та обмну речовин ¡м. В.П. Комсаренка НАМН Укра'/ни», м. Ки>в
ЛЕЙКОЦИТАРНИЙ СКЛАД ТА ¡МУНОФЕНОТИП AiMOOUMTiB ПЕРИФЕРИЧНОТ KPOBi У ДААт-ПОЗИТИВНИХ i ДААт-НЕГАТИВНИХ ЩОДО BMiCTy ^АБЕТАСОЦМОВАНИХ АBTOАНTИTiЛ ДiTЕЙ ТА ПiДЛiTKiB НА ДОКЛ^ЧЫЙ ТА PАННiЙ KЛiНiЧНiЙ СТАЛЯХ POЗBИTKУ ЦУKPOBOГO ДiАБЕTУ 1-го ТИПУ
Резюме. У cmammi проаналЗоват дат щодо особливостей лейкоцитарного складу та iмунофенотиnу лiмфоцитiв периферичноi кровi (ПК) у 94 ДААт-позитивних i 272 ДААт-негативних щодо eMicmy дiа-бетасоцшованих автоантитл (ДААт) дтей та тдлтшв, 49ДААт-позитивних пацieнmiв i3 дебютом цукрового дiабеmy 1-го типу (ЦД1) та 84 дтей конmрольно'i групи на доклШчнт та раннш клжчнт стадиях розвитку ЦД1. Визначення вмсту й аналiз розподлу лiмфоциmiв рiзного iмyнологiчного фенотипу здшснювали методом проточноi цитометрп, а визначення ДААт — радiоiмyнологiчним методом. Встановлено, що найбльш значт змши адаптивного та природного iмyнimеmy вiдбyваюmься на доклшч-нш стадп розвитку захворювання, що обумовлено найактивншою фазою перебщ авmоiмyнного проце-су. У доклгмчний перюдрозвитку ЦД1 у ДААт-позитивних дтей рееструвалося збльшення абсолютно'1' ^b^^iмоноциmiв та зниження ^b^^i природних клimин-кiлерiв (CD56+ лiмфоциmiв/великих гра-нуловмсних лейкоциmiв) у ПК, що свiдчило про патогенетично значуще ослабления вродженого iмyнi-тету на цьому етат формування захворювання. Латентний, до^шчний перюд розвитку ЦД1 у дтей з тдвищеними титрами ДААт до осmрiвцевих антигешв порiвняно з маркер-негативними патентами щодо наявносmiДААт iздоровими дтьми з групи контролюхарактеризувався порушеннями адаптивного iмyнimеmy — зниженняму циркулящ загально'1'^b^^i CD3+, CD4+, CD8+ Т-клтин, що е маmерi-альним субстратом деmермiнованоi авmоiмyнноi агресп на до^шчнт стадп розвитку ЦД1. Ключовi слова: цукровий дiабеm 1-го типу, дiабеmасоцiйованi автоантитла, iмyнimеm.
Цукровий дiабет 1-го типу (ЦД1) сьогодш за-раховують до найактуальшших як медичних, так i сощальних проблем, що потребують домшант-но! уваги нащональних програм охорони здоров'я практично вах кра!н свиу. Актуальшсть проблеми зумовлена ростом захворюваносп на ЦД1, ранньою швалщизащею хворих та високою смертшстю [10, 27]. Незважаючи на те, що юльюсть хворих на ЦД1 становить тшьки приблизно 5—10 % вщ загально-го числа хворих на цукровий дiабет, тенденцiя до рiзкого зростання частоти захворюваносп на ЦД1, особливо в дитячому ввд, невпинно прогресуе [13]. Ешдемюлопчш дослщження, що були виконаш в рiзних кра!нах свггу, свщчать про збшьшення захворюваносп на ЦД1 серед дггей та пщлитав протя-гом останнього десятирiччя [11]. Так, загальна кшь-
KicTb хворих на ЦД1 у США досягла 1 % населения, а в кра'шах бвропи юльюсть дггей i3 ЦД1 щорiчно зростае на 4 % [30]. Захворювашсть на ЦД1 в Укра-!ш також динамiчно прогресуе [4].
На сьогодш загальновизнано, що центральна роль у патогенезi ЦД1 належить Т-клггинам iMy^ но1 системи, що розтзнають антигени острiвцевих клггин специфiчними клггинними рецепторами. Ашгамунний процес, що призводить до загибелi
Адреса для листування з автором:
Попова Вжтор1я Васмвна
E-mail: [email protected]
© Попова В.В., 2015 © «Здоров'я дитини», 2015 © Заславський О.Ю., 2015
KAiHiHHa пед1атр1я / Clinical Pediatrics
ß-клиин, дуже складний i багатоступiнчастий. Дея-Ki його етапи до цього часу ще не 30BciM зрозумш, i ix значення в автоiмунному процесi дискутабельне. Вiдсутнi також даш щодо показникiв природного й адаптивного iмунiтету в доклiнiчний латентний перюд, що передуе клiнiчнiй машфестацп захво-рювання. Не дослiдженi функцп рiзниx видiв лей-коцитiв периферично^ кровi (ПК) на доклiнiчнiй i раннш клiнiчнiй стадiяx розвитку ЦД1: лiмфоцитiв, природних клiтин-кiлерiв (ПКК), великих грану-ловмiсниx лейкоцитiв (ВГЛ), моноцитiв. yci вище-перераxованi прогалини обумовлюють складшсть дано^ проблеми та актуальнiсть подальшого ви-вчення меxанiзмiв розвитку ЦД1 у дггей та пiдлiткiв.
Мета дослвдження. Вивчення стану iмунiтету в доклшчнш стадп розвитку ЦД1 на пiдставi ви-значення лейкоцитарного складу кровi й Гмунофе-нотипу лiмфоцитiв, що вiдображае функцiю цих клгган, у дiтей, позитивних щодо дГабетасоцшо-ваних автоантитiл (ДААт-позитивнi), порiвняно з негативними щодо дiабетасоцiйованиx автоанти-тГл (ДААт-негативнi), ДААт-позитивними пащен-тами, у яких манiфестував клiнiчний дебют ЦД1, а також iз контрольною групою практично здорових нормоглiкемiчниx дiтей без обтяжено^ спадковостi щодо ЦД1.
MaTepiaAM та методи дocлiджeння
Протягом 12 рокiв у рамках Державное програми «Цукровий дГабет» обстежено 450 дггей i пiдлiткiв обох статей у вжовому дiапазонi вщ 7 до 15 роив (середнш вж — 12,34 ± 0,82 року). Серед обстеже-них 366 (81,3 %) оаб становили основну групу — дГти та пщлГтки з нормоглiкемiею, яю мали родичГв, хворих на ЦД1, першого ступеня родинност (батьки, брат або сестра). Ця група дггей за результатами виконаного радюГмунолопчного дослщження на наявнiсть одночасно тдвищеного титру дГабетасо-цiйованиx автоантитГл (ДААт), а саме: автоантитiл до шсулшу (IAA), автоантитш до протешу тирозин-фосфатази (IA-2A) i автоантитш до декарбоксилази глутамшово^ кислоти (GADA) — була подГлена на двГ великi пщгрупи. ДААт-позитивну становили 94 (25,7 %) дитини, необxiдним критерГем включення до групи була обов'язкова наявшсть за дворазово-го визначення одночасно пiдвищеного титру не менше двох ввддв ДААт, переважно GADA i IA-2A. ДААт-негативну групу становили 272 (74,3 %) па-щенти з нормальним рiвнем глжемп i з вщсутшстю одночасно пiдвищеного титру ДААт (ДААт-нега-тивш). Ще одна група з'явилася як лопчне хроно-логiчне завершення автоiмунного процесу в груш ДААт-позитивних дiтей — група дггей Гз дебютом ЦД1 — 49 дггей (52,1 %), яю поступово впродовж вгд 6 мгс. до 10 роив (у середньому 30,9 ± 3,2 мгс.) змшили свш нормоглжемГчний ДААт-позитивний статус практично здорових дггей на статус пащен-тГв Гз клжчним дебютом ЦД1. 84 практично здо-ровГ нормоглжемГчш дитини (18,7 %) становили контрольну групу. РГвень глюкози в плазмГ веноз-
ное кровГ вимГрювали глюкозооксидазним методом. Меж1 рГвня глюкози в кровГ натще за щею методикою становили 3,6—5,5 ммоль/л. З метою виявлення автоГмунного процесу в шдшлунковш залозГ використовували радюГмунолопчний метод визначення ДААт: GADA, ^-2А i IAA. Кшькгсне визначення концентрацш дослщжуваних ДААт у кровГ виконували, керуючись шструкщею вироб-ника з використанням наборГв для встановлення ЗСх вмгсту (Immunotech, ЧехГя, i CIS Bio International, ФранцГя) на у-лГчильнику Beckman Gamma 5500B (США). Нормальний рГвень автоантитш GADА i IA-2A був меншим за 1 од/мл, а рГвень автоантитш — 1АА був меншим за 5,5 од/мл. Загальну кшькгсть лейкоцитГв i лейкоцитарну формулу ви-значали у венознш гепаришзованш периферичнш кровГ за допомогою загальноприйнятого методу. Мазки кровГ забарвлювали за Папенгеймом при рН буферного розчину 6,9. Диференцшований пщра-хунок рГзних титв лейкоцитГв здшснювали на 200 клгганах, видГляючи окремо велик грануловмгсш лГмфоцити. Визначення вмгсту й аналГз розподГлу лГмфоципв рГзного Гмунолопчного фенотипу здш-снювали за допомогою методу проточное цитоме-трп з використанням лазерного цитофлуориметра FACStar plus (фГрми Becton Dickinson, США). Мо-нонуклеари видГляли з кровГ диференцшованим центрифугуванням у градГенп щшьносп фжол-уротраст. ПоверхневГ антигени лГмфоципв мнили моноклональними антитГлами, яю для вГзуалГзацп були кон'юговаш Гз FITC. Використовували моно-клональш антитГла фГрми Becton Dickinson (США) та Dako (ДанГя) для щентифжацп поверхневих ан-тигешв: CD3; CD4 (Т-шдуктори/хелпери); CD8 (Т-супресори/кГлери); CD20 (В-лГмфоцити) i CD56 (ПКК). Статистичний аналГз даних виконували на пщставГ пакетГв прикладних програм Microsoft Excel та SPSS 11 (SPSS Inc., США) з використанням параметричних методГв статистичного аналь зу, що були наведен у виглядГ середшх значень та ^х стандартное помилки (M ± m). Для порГвняння двох груп за кшькгсними нормально розподГлени-ми ознаками застосовувався t-критерш Стьюдента. ВГропдними вважали вщмшносп при рГвш р < 0,05. Вс статистичш розрахунки виконували при рГвш значущост 95 %, р = 0,05.
Загальна юльюсть лейкоцит'в i лейкоцитарний склад кровi при цукровому дiабетi 1-го типу
У результат проведених дослщжень не було виявлено вГрогГдних змГн загально^ кглькостГ лей-коцитГв у ПК як у доклшчну фазу розвитку за-хворювання, що встановлено на пщставГ виявлення одночасно пщвищених титрГв двох видГв ДААт (IAA, GADA i IA-2A), так i у вперше виявлених хворих на ЦД1. Як видно з табл. 1, у ДААт-позитивних i ДААт-негативних дггей не було виявлено статис-тично вГрогГдних змГн загально^ кГлькостГ лейкоци-тГв у ПК порГвняно з ДААт-позитивними дГтьми, у
KAiHi4Ha пeдiaтpiя / Clinical Pediatrics
яких згодом розвинувся ЦД1, i диъми контрольно! групи. При дослiдженнi лейкоцитарного складу ПК у ДААт-позитивних дггей вiдмiчалось невели-ке, але статистично вiрогiдне зниження вщносно! й абсолютно! кглькосп лiмфоцитiв порiвняно з вмгстом вiдносного й абсолютного числа лiмфоци-тiв у ДААт-негативних дiтей i в дiтей контрольно! групи. При аналiзi вмiсту ВГЛ, що е гомологами ПКК, нами було виявлено у ДААт-позитивних дь тей статистично вiрогiдне рiзке зниження вщнос-ного й абсолютного числа лiмфоцитiв порiвняно з умiстом вiдносного й абсолютного числа лiмфоци-тiв у ДААт-негативних дггей та у дiтей контрольно! групи. Помiрна лiмфоцитопенiя може бути пояснена одночасним зниженням кглькосп Т-лiмфоцитiв i ПКК (ВГЛ) у ПК. У той же час вщносна й абсолютна кгльюсть моноципв у ДААт-позитивних дь тей з обтяженою спадковiстю щодо ЦД1 була статистично вiрогiдно пщвищена стосовно вмiсту як вiдносного, так i абсолютного числа лiмфоцитiв у ДААт-негативних дней i у дней контрольно! групи (табл. 1). При розвитку клiнiчного дебюту ЦД1 спо-стерiгалась також невелика лiмфоцитопенiя, але не настгльки значна, як у ДААт-позитивних дней. Так, у груш дггей iз дебютом ЦД1 виявлялося невелике, але статистично вiрогiдне зниження вщносного й абсолютного числа лiмфоцитiв порiвняно з вмгс-том вщносного та абсолютного числа лiмфоцитiв у ДААт-позитивних дггей, у ДААт-негативних дггей та у дiтей контрольно! групи. При вивченш вмiсту ВГЛ у груш ДААт-позитивних дггей, у яких згодом розвинувся клшчний дебют ЦД1, ми виявили також статистично вiрогiдне зниження вiдносного й абсолютного числа лiмфоцитiв порiвняно з вмгс-том вщносного та абсолютного числа лiмфоцитiв у
ДААт-позитивних дiтей, у ДААт-негативних дггей та в дггей контрольно! групи.
При аналiзi вмгсту моноцитiв у групi дiтей iз дебютом ЦД1 також виявлявся моноцитоз, але не настгльки виражений, як у груш ДААт-позитивних дггей. При дослщженш отриманих результапв ми виявили статистично вiрогiдне зменшення вщнос-ного й абсолютного числа лiмфоцитiв у груш дггей iз дебютом ЦД1 порiвняно з вмiстом вiдносного й абсолютного числа лiмфоцитiв у ДААт-позитив-них дiтей. Незначний моноцитоз, як вщносний, так i абсолютний, був виявлений у групi ДААт-не-гативних дггей порiвняно з умiстом вщносного та абсолютного числа моноципв у дней контрольно! групи. Треба вщзначити, що помiрний моноцитоз i лiмфоцитопенiя у дiтей iз клшчним дебютом ЦД1, що вже машфестував, вiдмiчалися й iншими авторами [3, 5, 18, 29]. Вщносний i абсолютний вмiст нейтрофiлiв у ПК ДААт-позитивних, ДААт-негативних i у дггей iз дебютом ЦД1 порiвняно з контролем вiрогiдно не був змшений (табл. 1). З боку лейкоцитарного складу ПК у хворих на ЦД1 найчастше вiдмiчалася, як уже вказувалося раш-ше, помiрна лiмфоцитопенiя, яка при подальшому перебпу захворювання могла мати тенденцiю до ще бiльшого зниження, хоча е окремi повщомлен-ня [14, 20] щодо нормального рiвня лiмфоцитiв у ПК хворих на ЦД1. Нами також було показано, що у хворих з уперше виявленим ЦД1 до початку шсулшотерапп вiдмiчалося зниження вщносного й абсолютного числа великих грануловмгсних лiм-фоципв у ПК, яю вважаються морфологiчним гомологом природних клiтин-кiлерiв. Можливо, лiм-фоцитопенiя, що спостерiгалася у низки хворих на ЦД1, й обумовлена зниженням саме кглькосп цих
Таблиця 1. Загальна кльксть лейкоцит1в iлейкоцитарна формула в здорових, ДААт-негативних, ДААт-позитивних, а також дтей, хворих на цукровий д1абет 1-го типу (М ± т)
Типи лейкоцилв Здоровi дiти, n = 84 ДААт-негативш дiти, n = 272 ДААт-позитивн дiти, n = 94 Дiти з ЦД1, n = 49
Кшьшсть лейкоци^в, • 109/л 5,61 ± 0,17 5,47 ± 0,21 5,42 ± 0,20 5,92 ± 0,28
Нейтрофти (паличкоядернО, % 2,27 ± 0,20 2,36 ± 0,29 2,58 ± 0,25 2,82 ± 0,38
Нейтрофiли (паличкоядернi), • 109/л 0,12 ± 0,01 0,13 ± 0,02 0,14 ± 0,01 0,16 ± 0,02
Базофiли, % 0,25 ± 0,06 0,13 ± 0,04 0,47 ± 0,09 0,27 ± 0,09
Базофiли, • 109/л 0,01 ± 0,00 0,01 ± 0,00 0,02 ± 0,01 0,02 ± 0,01
Еозинофiли, % 3,00 ± 0,29 3,39 ± 0,40 3,72 ± 0,40 2,98 ± 0,38
Еозинофiли, • 109/л 0,16 ± 0,01 0,18 ± 0,02 0,20 ± 0,03 0,16 ± 0,02
Моноцити, % 5,27 ± 0,25 6,95 ± 0,48b 10,61 ± 0,55b' c 7,59 ± 0,63a
Моноцити, • 109/л 0,28 ± 0,01 0,38 ± 0,03a 0,56 ± 0,03b' d 0,44 ± 0,03a
Лiмфоцити, % 34,88 ± 1,26 35,18 ± 1,50 28,36 ± 1,10b' d 32,53 ± 1,63
Лiмфоцити, • 109/л 1,94 ± 0,09 1,89 ± 0,08 1,52 ± 0,08b' d 1,85 ± 0,11
ВГЛ, % 2,15 ± 0,19 1,82 ± 0,32 0,80 ± 0,17b' d 1,41 ± 0,20b
ВГЛ, • 109/л 0,12 ± 0,01 0,09 ± 0,02b 0,05 ± 0,01b 0,08 ± 0,01b
Примтки:a — p1 < 0,05;b — p1 < 0,001 порiвняно ¡з здоровими дтьми;c — p2 < 0,05;d — p2 < 0,001 для ДААт-позитивних пор1вняно ¡з ДААт-негативними дтьми.
КлШчна пед1атр1я / С!1п1са! Pediаtrics
клгган, а також зменшенням вмiсту Т^мфоципв у ПК. Як видно з табл. 1, особливо значне зниження вщносно! й абсолютно! кiлькостi лiмфоцитiв у ПК нами було виявлене у ДААт-позитивних дiтей з об-тяженою спадковiстю, тобто в доклшчний перiод розвитку захворювання, коли автоiмунний про-цес уже почався i прогресуе, але деструкцп зазнала лише частина маси р-клгган i, отже, секрецiя шсу-лiну хоча i знижена, але все ж таки ще протективно достатня для тдтримки нормального рiвня глжемп й запобпання клiнiчному дебюту ЦД1. У ДААт-по-зитивних дiтей, як i в тих, у кого розвинувся кль шчний дебют ЦД1, вiдмiчалося значне зниження вщносно! та абсолютно! кглькосп ВГЛ порiвняно з нормою i ДААт-негативними дiтьми (табл. 1), що пщтверджуеться одночасним визначенням у цих пащенпв зниження вмiсту лiмфоцитiв, що екс-пресують СБ56-антиген (табл. 1). З боку моноци-тiв описана як вщсутшсть !х змiни в ПК [21], так i помiрний моноцитоз [3, 5], що найбгльш вираже-ний у доклiнiчну стадш розвитку захворювання (табл. 1). Вщносний та абсолютний вмiст нейтро-фшв (як сегментоядерних, так i паличкоядерних) у ПК ДААт-позитивних, ДААт-негативних i у дiтей iз дебютом ЦД1 порiвняно з контролем вiрогiдно не змшився (табл. 1).
1мунофенотип л^мфоцит'т у доклнчну ! клн'чну стадп розвитку цукрового диабету 1-го типу
Головною особливютю нашого дослiдження субпопуляцшного складу лiмфоцитiв у ПК у докль нiчнiй стад!! ЦД1 було те, що воно було виконане в практично ще здорових клшчно, але ДААт-по-зитивних iмунологiчно дггей. Даних щодо рiвня СБ3+ клгган у ПК в доклiнiчний перюд розвитку ЦД1 у ДААт-позитивних дггей у доступнш лггера-турi ми не знайшли. У наших проспективних до-слiдженнях iмунофенотипу лiмфоцитiв було ви-
явлено нижчий вщносний та абсолютний вмют загально! кiлькостi Т^мфоципв (СБ3+ клiтин) у ДААт-позитивних дггей у ПК, нгж у ДААт-нега-тивних i здорових дiтей контрольно! групи, а також у груш ДААт-позитивних дггей, у яких виник ЦД1 (табл. 2). Як видно з табл. 2, абсолютна кгльюсть СБ3+ клгган у ПК в ДААт-негативних дггей по-рiвняно з такими у здорових дггей була в середньо-му зниженою на 12,2 %, у ДААт-позитивних — на 43,2 % (р < 0,05). У той же час абсолютна кгльюсть СБ3+ клгган у ДААт-негативних дггей порiвняно з ДААт-позитивними диъми була меншою на 35,3 % (р2 < 0,001).
При FACS-аналiзi лiмфоцитiв рiзного iмунофе-нотипу в ПК хворих на ЦД1 пильшша увага в ль тературi придiляеться дослiдженню вмiсту одше! з популяцш СБ3+ Т-клiтин-Т-хелперiв-/iндукторiв (СБ4+ Т-клгган) i !х субпопуляцп, що мають iму-норегуляторнi властивостi.
У наших дослщженнях iмунофенотипу лiмфо-цитiв у дггей, яю знаходяться на iмунологiчно пщ-твердженiй доклiнiчнiй стадп розвитку ЦД1, ви-конаних у ДААт-позитивних дггей, було показано, що зменшення у них вмюту СБ3+ Т-клгган у ПК значною мiрою обумовлене, як видно з табл. 2, зни-женням рiвня в циркуляцп абсолютно! кiлькостi Т-хелперiв/супресорiв, тобто СБ4+ Т-клiтин. Се-реднi показники абсолютно! кглькосп цiеi субпо-пуляцГ! лiмфоцитiв у ПК в ДААт-негативних дггей порiвняно з такими у здорових дггей були знижеш на 11,2 % (р > 0,05), у ДААт-позитивних дггей — на 46,9 % (р < 0,001) i у ДААт-позитивних дггей iз кль шчним дебютом ЦД1 — на 28,6 % (р < 0,05). У той же час абсолютне число СБ4+ клгган у ДААт-пози-тивних дггей на 40,2 % (р < 0,001) було нижчим, нгж у ДААт-негативних.
Отримаш нами результати узгоджуються з роботами ряду дослщниюв, що виявили зниження рiвня СБ4+ клiтин у ПК при ЦД1 i пiдтверджують зна-
Таблиця 2. Вдносний (%) i абсолютний (• 109/л) вмст л1мфоцит1в р'зного ¡мунофенотипу в ПК дтей: здорових, ДААт-негативних, ДААт-позитивних iхворих на цукровий дiабет 1-го типу (М ± т)
Субпопуляцм лiмфоцитiв Здоровi дiти, п = 84 ДААт-негативнi дгги, п = 272 ДААт-позитивнi дiти, п = 94 Дiти з ЦД1, п = 49
003+ ^тини, % 65,57 ± 1,72 63,26 ± 0,95 50,47 ± 0,85ь' с 56,33 ± 1,47а
003+ ^тини, • 109/л 1,39 ± 0,09 1,22 ± 0,06 0,79 ± 0,05ь' d 1,07 ± 0,06а
004+ клiтини, % 42,13 ± 1,30 36,29 ± 0,89а 32,86 ± 1,07ь' с 37,03 ± 1,04а
004+ ^тини, • 109/л 0,98 ± 0,05 0,87 ± 0,04 0,52 ± 0,03ь' d 0,70 ± 0,04а
С08+ клiтини, % 22,03 ± 1,00 20,70 ± 0,52 19,39 ± 0,46 21,23 ± 0,90
008+ ^тини, • 109/л 0,48 ± 0,04 0,40 ± 0,02 0,30 ± 0,02а' с 0,41 ± 0,03а
0020+ клiтини, % 10,06 ± 0,65 10,21 ± 0,57 10,21 ± 0,37 9,65 ± 0,62
0020+ клiтини, • 109/л 0,25 ± 0,02 0,22 ± 0,02 0,16 ± 0,01а' с 0,18 ± 0,01а
0056+ клiтини, % 14,03 ± 0,88 11,41 ± 1,22 9,92 ± 0,68а 10,74 ± 0,93а
0056+ клiтини, • 109/л 0,29 ± 0,02 0,24 ± 0,04 0,18 ± 0,02а 0,20 ± 0,02а
1ндекс С04+/008+ 1,98 ± 0,12 1,82 ± 0,04 1,70 ± 0,06а 1,73 ± 0,049а
Примтки:а — р1 < 0,05,ь — р1 < 0,001 порiвняно ¡з здоровими дтьми;с — р2 < 0,05;" — р2 < 0,001 для ДААт-позитивних порiвняно ¡з ДААт-негативними дтьми.
KëiHi4Ha neAiorpifl / Clinical Pediatrics
чну роль цих клiтин у naToreHe3i захворювання [12, 16]. Необхiдно особливо пщкреслити, що отриманi нами даш вказують на те, що змша цieï популяцИ Т-клiтин вщбуваеться задовго, школи за декiлька рокiв, до розвитку клiшчноï машфестацИ захворю-вання.
У той же час необхщно зазначити, що, як видно з табл. 2, у ДААт-негативних дггей також було вь рогщне зниження вщносного й абсолютного вмгс-ту CD3+ i CD4+ Т-клiтин, хоча й не настгльки ви-раженим. Це можна, мабуть, пояснити тим, що ця група дггей все ж мае обтяжену спадковгсть, хоча i е ДААт-негативною, при цьому не можна виклю-чати й того, що нормальний титр у деяких Гз цих дггей надалГ може тдвищуватися, оскгльки е даш про те, що титр GADA i IA-2A в окремих оаб мае транзиторний характер, тобто може або зовам ш-коли зникати, або, навпаки, значно пщвищувати-ся [24, 25].
1нформацгя щодо змш рГвня CD8+ Т-клггин у ПК в доклтчний перюд розвитку ЦД1 незначна, неоднозначна i отримана на дуже незначному кль шчному матерiалi (всього декглька оаб у групах). Так, за даними C.L. Hitchock та ствавт. [19], вщ-соток CD8+ клггин у ПК в ICA-позитивних сиб-с1в гстотно вiдрiзняеться вщ ICA-негативних, а за даними D. Faustman та спiвавт. [9], «недГабетич-ш» сибси при предiабетi мають знижену кгльюсть CD8+ Т-клггин у ПК. У виконаному дослщженш Гмунофенотипу лГмфоципв у ПК обстежуваних груп дней не було виявлено, як видно з табл. 2, вь рогщних змш вщносного вмгсту CD8+ Т-клггин у ДААт-негативних, ДААт-позитивних i дггей Гз кл1-шчним дебютом ЦД1 порГвняно з контролем. Проте при обчисленш абсолютних чисел CD8+ Т-клггин у ПК спостерГгалося значне статистично вГрогщне зниження кглькосТ цих клггин у ДААт-позитивних дгтей порГвняно з1 здоровими дггьми, ДААт-не-гативними дггьми та в ДААт-позитивних дггей Гз ЦД1. Вiрогiдноï рГзниш мгж середньою кгльюстю CD8+ Т-клггин у ДААт-позитивних i ДААт-не-гативних пашенпв виявлено не було (р2 > 0,05). У ДААт-позитивних дггей спостерГгалося статистично вГрогщне (р < 0,01) зниження абсолютноï кгль-косТ Т-кглерГв/супресорГв (CD8+ клггин) у ПК як щодо контрольноï групи дггей, так i ДААт-негатив-них дггей (табл. 2). ВГрогщна рГзниця (р < 0,05) була також мгж групами ДААт-позитивних i ДААт-не-гативних дггей. ВГрогщне зниження (р < 0,05) вщ-сотка CD8+ клггин у ПК рееструвалося лише при порГвнянш середшх величин здорових i ДААт-по-зитивних дггей. У пашенпв Гз клшчним дебютом ЦД1 мало мгсце подГбно доклшГчнш латентнш ста-дiï ЦД1 вГрогщне зниження вiдносноï (р = 0,05) й абсолютноï (р < 0,05) кглькосп CD8+ клггин, але воно було менш виражене (табл. 2). Сшввщношен-ня мгж кгльюстю CD4+ i CD8+ Т-клггин, тобто ш-декс CD4+/CD8+, було порГвняно з контролем вь рогщно (р < 0,05) зниженим як у ДААт-позитивних дггей, так i у ДААт-позитивних дггей Гз машфесто-
ваним ЦД1, що узгоджуеться з даними переважно! бгльшост авторГв [9, 16, 18, 19].
Дослщженню при ЦД1 гуморального Гмунгге-ту, тобто вмгсту В-лГмфоципв (CD19+, CD20+ i CD21+ клггин), присвячена значно менша кгль-юсть робгг, нгж аналГзу кглькосп Т-лГмфоципв у ПК. Згщно з наявними даними, вмгст В-лГмфоципв у ПК дггей з уперше виявленим ЦД1 знаходиться, на думку одних авторГв, у межах нормальних по-казниюв або дещо знижений [3, 8, 15, 22], на думку шших — дещо пщвищений [2, 6, 7]. У наших про-спективних клшко-Гмунолопчних дослщженнях при визначенш В-лГмфоципв (CD20+ клггин), як видно з табл. 2, не було виявлено вiрогiдноï змши вщносного к вмгсту в ПК ДААт-негативних дггей, ДААт-позитивних дггей та ДААт-позитивних дь тей Гз ЦД1 порГвняно з контролем. Але абсолютне число CD20+ клггин у ПК було дещо зниженим як у ДААт-позитивних, так i ДААт-негативних дггей, а також у груш ДААт-позитивних дггей Гз дебютом ЦД1 порГвняно з вмгстом абсолютного числа CD20+ клггин у ПК здорових дггей.
Украй обмежена також наявна лггература щодо змш при ЦД1 вмгсту третьоï (разом з Т- i В-клггинами), головноï популяцИ лГмфоципв — природних клггин-кглерГв, що становить 10—15 % уах лГмфоципв. Ушкальна особливгсть ПКК — к здатшсть спонтанно (тобто без попередньоï сен-сибшзацИ антигеном) знищувати вГрусшфжова-ш, пухлинш й 1нш1 види трансформованих клггин. 1мунолопчно й морфолопчно ПКК вщрГзняються в1д Т- i В-лГмфоципв. Вони експресують на свош поверхш низку характерних маркерГв. Найбгльш специфГчш з них — CD16- i CD56-антигени. У той же час вони не експресують характерний для Т-клггин CD3-антиген [1, 3]. ЩкавГ даш ми отри-мали при дослщженш цГех найменш вивченоï суб-популяцИ лГмфоципв — природних клггин-кглерГв. Як видно з табл. 2, у ДААт-позитивних дггей i у ДААт-позитивних дггей з уперше виявленим ЦД1 спостерпалося статистично вГрогщне зниження в ПК вщносного та абсолютного порГвняно з групою здорових дггей числа лГмфоципв, що експресують СD56-антиген, який вважаеться найбгльш специ-фГчним ГмунологГчним маркером ПКК. Причому стутнь зниження CD56+ клггин у ДААт-пози-тивних дГтей був бгльшим, нгж пГсля виникнення захворювання. ПодГбш змГни в обстежених були також виявленг г при цитологгчному визначеннг ПКК у мазках ПК на пщстав! пщрахунку ВГЛ, що вважаються, як уже вказувалося, морфологгчним гомологом ПКК. Це пщтверджуе вГрогГднГсть отри-маних нами даних щодо змш вмгсту цГех субпопу-ляцlï лГмфоципв на докл1н1чн1й i на раншх кл1н1ч-них стадгях ЦД1. У доклжчну стадГю розвитку ЦД1 у доступнш нам лГтературГ вдалося виявити лише одну роботу [28], присвячену дослщженню вмгсту ПКК у найбгльш раннш фазГ виникнення цього захворювання. У нш показано, що в ICA-позитивних дггей, так само як у дггей Гз ЦД1, е зниження кгль-
кост ПКК порiвняно з контролем. У наших досль дженнях, як видно з табл. 2, вмют ПКК у доклшч-ний перiод ЦД1, тобто в ДААт-позитивних дiтей, як i в ДААт-позитивних пацiентiв, у яких уже кль нiчно машфестував ЦД1, порiвняно з групою практично здорових дггей спостерiгалося значне ста-тистично вiрогiдне зниження в ПК вщносного та абсолютного порiвняно з групою контролю числа лiмфоцитiв, що експресують СБ56-антиген, тобто найбгльш специфiчного iмунологiчного маркера ПКК. При дослщженш стану ПКК при ЦД1 нами була виявлена також дуже цiкава закономiрнiсть. У бiльшостi хворих дггей iз найнижчим вмiстом СБ56+ клiтин i ВГЛ у ПК в одного з батьюв дггей iз ЦД1 так само було зниження кглькосп ПКК у ПК. Отримаш данi дозволяють зробити висновок, що, можливо, зниження числа ПКК у ПК частини дь тей з ЦД1 обумовлене генетичним дефектом систе-ми клiтин-кiлерiв. Ослаблення природно! iмунноi системи органiзму, зокрема зниження секрецп по-тужного антивiрусного цитокшу 1ФН-у — головного продукту секрецп ПКК [23], може сприяти агресившшому перебiгу вiрусних захворювань (вь рус Коксакi, герпес, краснуха, виряна вiспа й iн.), будучи одшею з причин ушкодження р-клгтин — тобто зниження числа циркулюючих ПКК е не на-слщком ЦД1, а передуе його розвитку. На користь такого припущення свщчить низка фактiв, у тому чи^ й данi про те, що юнуе асоцiацiя мгж епще-мiологiчними сезонними (осiнньо-зимовий час) спалахами вiрусних захворювань i частотою виник-нення ЦД1 у дiтей [17, 26].
Висновки
1. Показано, що найбгльш вираженi змiни адаптивного (Т-клгганного) i природного iмунiтету (ПКК) вщбуваються на доклiнiчнiй стади розвитку захворювання, що обумовлено найактивнiшою фазою переб^ автоiмунного процесу. Шсля того, як бiльшiсть р-клгтин антигенного матерiального субстрату автоiмунноi агресп зруйнована, автоiмунний процес поступово стихае, що i призводить до певно! нормалiзацli iмунних показникiв.
2. У доклшчний перiод розвитку ЦД1 в ДААт-позитивних дггей рееструвалося збгльшення абсолютно! кглькосп моноцитiв та зниження кглькосп природних клiтин-кiлерiв (СБ56+ лiмфоцитiв/ ВГЛ) у периферичнiй кров^ що свiдчило про пато-генетично значуще ослаблення вродженого iмунi-тету на цьому етат формування захворювання.
3. Латентний, доклiнiчний перiод розвитку ЦД1 у дггей iз пщвищеними титрами ДААт до ос^в-цевих антигешв порiвняно з маркер-негативними пащентами щодо наявностi ДААт до острiвцевих антигенiв i здоровими дiтьми контролю характе-ризувався порушеннями адаптивного iмунiтету — зниженням у циркуляцп загально! кiлькостi СБ3+, СБ4+, СБ8+ Т-клгган, що е матерiальним субстратом детермшовано! автоiмунноi агресп на доклтч-нiй стад!! розвитку ЦД1.
Список л^ератури
1. Возианов А.Ф. Цитокины. Биологические и противоопухолевые свойства/А.Ф. Возианов, А.К. Бутенко, К.П. Зак. — К.: Наукова думка, 1998. — 315 с.
2. Динамика содержания аутоантител к островковым клеткам поджелудочной железы у родственников больных сахарным диабетом типа 1 / Н.Л. Вартанян, А.А. Соминина, В.В. Зарубаев [и др.]//Пробл. эндокринологии. — 2001. — Т. 47, № 4. — С. 27-30.
3. Зак К.П. Иммунитет у детей, больных сахарным диабетом / К.П. Зак, Т.Н. Малиновская, Н.Д. Тронько. — К.: Книга плюс, 2002. — 111 с.
4. Зак К.П. Сахарный диабет. Иммунитет. Цитокины / К.П. Зак, Н.Д. Тронько, В.В. Попова, А.К. Бутенко. — К.: Книга плюс, 2015. — 488 с.
5. Особенности иммунитета у детей и подростков с различной продолжительностью сахарного диабета типа 1 /Е.В. Крюкова, А.А. Савченко, В.Т. Манчук, И.В. Осокина // Пробл. эндокринологии. — 2000. — Т. 46, № 3. — С. 7-10.
6. Особенности клеточного иммунитета у больных с впервые выявленным инсулинзависимым сахарным диабетом / И.И. Дедов, Л.А. Чугунова, О.М. Смирнова [и др.]// Пробл. эндокринологии. — 1994. — Т. 40, № 1. — С. 17-20.
7. Потемкин В.В. Динамика ряда показателей клеточного и гуморального иммунитета у больных сахарным диабетом 1 типа/В.В. Потемкин, Т.В. Никонова, С.В. Брыкова//Пробл. эндокринологии. — 1994. — Т. 40, № 6. — С. 5-7.
8. Ультраструктура и функция лимфоцитов крови у детей с впервые выявленным нелеченным сахарным диабетом 1-го типа / К.П. Зак, М.А. Грузов, В.В. Афанасьева [и др.]// Пробл. эндокринологии. — 2005. — Т. 51, № 5. — С. 8-13.
9. Abnormal T-lymphocyte subsets in type 1 diabetes / D. Faust-man, G. Eisenbarth, J. Dales, J. Breitmeyer// Diabetes. — 1989. — Vol. 38, № 11. — P. 1462-1468.
10. Atkinson M.A. Type 1 diabetes. Type 1 diabetes/M.A. Atkinson, G.S. Eisenbarth, A.W Michels//Lancet. — 2014. — Vol. 383, № 9911. — P. 69-82.
11. Battaglia M. The streetlight effect in Type 1 diabetes [Text]/ M. Battaglia, M.A. Atkinson // Diabetes. — 2015. — Vol. 64. — P. 1081-1090.
12. Effects of cyclosporin A upon humoral and cellular immune parameters in insulin dependent diabetes mellitus type 1: a long-term follow-up study / C. Muller, C.C. Zielinski, W. Kaliniwski [et al.]// J. Endocrinol. — 1989. — Vol. 121, № 1. — P. 177-183.
13. Hansen M.P., Matheis N., Kahaly G.J. Type 1 diabetes and polyglandular autoimmune syndrome: A review / Hansen M.P., Matheis N, Kahaly G.J. // World J. Diabetes. — 2015. — Vol. 6, № 1. — P. 67-79.
14. Higher percentages of T regulatory cells in children at risk for developing type 1 diabetes mellitus / W. Luczynski, A. Stasiak-Barmuta, M. Mysliwiec [et al.] // Pediatr. Endocrinol. Diabetes Metab. — 2010. — Vol. 16, № 1. — P. 7-10.
15. Hyoty H. Flow-cytometric analysis of lymphocyte subsets in relation to virus infections at the onset of type 1 (insulin-dependent) diabetes//APMIS. — 1988. — Vol. 96, № 8. — P. 741-748.
16. Increase in simultaneous coexpression of naive and memory lymphocyte markers at diagnosis oflDDM/R.A. Smerdon, M. Peak-man, M. Hussain [et al.] // Diabetes. — 1993. — Vol. 42, № 1. — P. 127-133.
17. Innate immunity and human insulitis during beta cell coxsa-ckie B4 infection /F. Dotta, V. Bonato, R. Gallo [et al.]//Diabetolo-gia. — 2008. — Vol. 51, Suppl. 1. — P. S234-459.
18. Lymphocyte subset abnormalities, autoantibodies and their relationship with HLADR types in children with type 1(insulin-depen-dent) diabetes and their first degree relatives/M. Peakman, T. Warnock, A. Vats [et al.] // Diabetologia. — 1994. — Vol. 37, № 2. — P. 155-165.
19. Lymphocyte subsets and activation in prediabetes/ C.L. Hitchcock, W.J. Riley, A. Alamo [et al.]// Diabetes. — 1986. — Vol. 35, № 12. — P. 1416-1422.
20. Lower percentages of T regulatory cells in children with type 1 diabetes — preliminary report / W. Luczynski, A. Stasiak-Barmuta,
R. Urban [et al.]// Pediatr. Endocrinol. Diabetes Metab. — 2009. — Vol. 15, № 1. — P. 34-38.
21. Monocyte function in IDDM patients and healthy individuals / J. Molvig, F. Pociot, L. Baek [et al.]// Scand. J. Immunol. — 1990. — Vol. 32, № 3. — P. 297-311.
22. Multiparametr immunologic studies in patients with newly diagnosed type1 insulin—dependent diabetes mellitus / S. Gupta, M.A. Charles, N. Waldecr [et al.]//Diabetes Res. — 1986. — Vol. 3, № 5. — P. 225-229.
23. Natural killer cells from children with type 1 diabetes have defects in NKG2D—dependent function and signaling / H. Qin, I.-F. Lee, C. Panagiotopoulos [et al.] // Diabetes. — 2011. — Vol. 60, № 3. — P. 857-866.
24. Prediction of autoantibody positivity and progression to type 1 diabetes: Diabetes Autoimmunity Study in the Young (DAISY) / J.M. Barker, K.J. Barriga, L. Yu [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. — 2004. — Vol. 89, № 8. — P. 3896-3902.
25. Progression to type 1 diabetes and autoantibody positivity in relation to HLA risk genotypes in children participating in the ABIS
study / C. Gullstrand, J. Wahlberg, J. Ilonen [et al.] // Diabetolo-gia. - 2006. - Vol. 49, Suppl. 1. - P. 179-180.
26. Seasonal variation of type 1 diabetes incidence in childhood in Germany / J. Rosenbauer, C. Bochle, A. Stahl [et al.]// Diabetolo-gia. - 2010. - Vol. 53, Suppl. 1 (A-924).
27. Standards of medical care in diabetes - 2015 // Diabetes care. - 2015. - Vol. 38, Suppl. 1. - S1-S90.
28. T-lymphocytes subsets disturbances in the blood of subjects at high-risk of insulin-dependent diabetes / A. Kretowski, M. Szelochowska, M. Pietercz.uk, J. Kinolska // Diabetologia. -1996. - Vol. 39, Suppl. 1. - P. 356 (A-95).
29. Two-color flow cytometry analysis of activated T—lymphocyte subsets in type 1 diabetes mellitus / C. M. Legendre, A.. Schiffirin, G. Weitzner[et al.]//Diabetes. -1988. - Vol. 37, № 6. - P. 792-795.
30. Zhang L. Prediction and prevention of Type 1 diabetes mellitus/L. Zhang, G.S. Eisenbarth //Diabetes. - 2011. - Vol. 3, Suppl. 1. - P. 48-57. doi: 10.1111/j.1753-0407.2010.00102.
OTpuMaHO 21.12.14 ■
Попова В.В.
ГУ «Институт эндокринологии и обмена веществ им. В.П. Комиссаренко НАМН Украины», г. Киев
ЛЕЙКОЦИТАРНЫЙ СОСТАВ И ИММУНОФЕНОТИП ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ДААт-ПОЗИТИВНЫХ И ДААт-НЕГАТИВНЫХ ПО СОДЕРЖАНИЮ ДИАБЕТАССОЦИИРОВАННЫХ АУТОАНТИТЕЛ ДЕТЕЙ И ПОДРОСТКОВ НА ДОКЛИНИЧЕСКОЙ И РАННЕЙ КЛИНИЧЕСКОЙ СТАДИЯХ РАЗВИТИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА 1-го ТИПА
Резюме. В статье проанализированы данные об особенностях лейкоцитарного состава и иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови (ПК) у 94 ДААт-по-зитивных и 272 ДААт-негативных по наличию диабетас-социированных аутоантител (ДААт) детей и подростков, 49 ДААт-позитивных пациентов с дебютом сахарного диабета 1-го типа (СД1) и 84 детей контрольной группы. Определение содержания и анализ распределения лимфоцитов различного иммунологического фенотипа осуществляли с помощью метода проточной цитометрии, а определение уровней ДААт — радиоиммунологическим методом. Установлено, что наиболее выраженные изменения адаптивного и врожденного иммунитета происходят на доклинической стадии развития заболевания, что обусловлено наиболее активной фазой течения аутоиммунного процесса. В доклинический период развития СД1 у ДААт-позитивных детей регистрировалось увеличение абсолютного количества моноцитов и уменьшение содержания природных клеток-киллеров (СБ56+ лимфоцитов/ больших гранулосодержащих лимфоцитов) в ПК, что свидетельствовало о патогенетически значимом ослаблении врожденного иммунитета на данном этапе формирования заболевания. Латентный, доклинический период развития СД1 у детей с повышенными титрами ДААт к остров-ковым антигенам в сравнении с маркер-негативными пациентами по наличию ДААт и здоровыми детьми из группы контроля характеризовался нарушениями адаптивного иммунитета — снижением в циркуляции общего количества СБ3+, СБ4+, СБ8+ Т-клеток, что является материальным субстратом детерминированной аутоиммунной агрессии на доклинической стадии развития СД1.
Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, диабетассо-циированные аутоантитела, иммунитет.
Popova V.V.
State Institution «Institute of Endocrinology and Metabolism named after V.P. Komisarenko of National Academy of Medical Sciences of Ukraine», Kyiv, Ukraine
LEUKOCYTE COMPOSITION AND IMMUNOPHENOTYPE OF PERIPHERAL BLOOD LYMPHOCYTES IN CHILDREN AND ADOLESCENTS, WHO ARE DAAB-POSITIVE AND DAAB-NEGATIVE IN TERMS OF DIABETES-ASSOCIATED AUTOANTIBODIES, ON THE PRECLINICAL AND EARLY CLINICAL STAGES OF TYPE 1 DIABETES MELLITUS
Summary. The article analyzed the data about the features of leukocyte composition and immunophenotype of peripheral blood (PB) lymphocytes in children and adolescents: 94 DAAb-positive and 272 DAAb-negative in terms of diabetes-associated autoantibodies (DAAbs) content, 49 DAAb-positive patients with newly diagnosed diabetes mellitus type 1 (DM1) and 84 children from the control group, on the preclinical and early clinical stages of DM1. Evaluation of the content and analysis of distribution of lymphocytes with different immuno-phenotype was performed by flow cytometry method, and determination of DAAbs — using radioimmunoassay technique. It is found that the most significant changes in adaptive and natural immunity occur on the preclinical stage of the disease, which is caused by the most active phase of the autoimmune process. In preclinical period of DM1, in DAAb-positive children we have recorded an increase in the absolute number of monocytes and reduced number of natural killer cells (CD56+-lymphocytes/large granule-containing leukocytes) in the PB, indicating a pathogenetically significant weakening of innate immunity on this stage of the disease. Latent, preclinical period of DM1 in children with elevated titers of DAAb to islet antigens compared to marker-negative patients in terms of DAAb presence and healthy children from the control group has been characterized by impaired adaptive immunity — a reduction in blood flow of total number of CD3+, CD4+, CD8+ T-cells, which are material substrate of determined autoimmune aggression on the preclinical stage of DM1.
Key words: type 1 diabetes mellitus, diabetes-associated au-toantibodies, immunity.
