CC BY
71
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Human study
Ксеногенная контаминация линий эмбриональных стволовых клеток человека
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) традиционно культивируются на так называемом фидерном слое (ФС), который поддерживает их выживание в «стволовом» состоянии за счёт секреции в культуру ростовых факторов и блокирует прямой контакт с подложкой, адгезия с которой служит сигналом к началу синтеза белков цитоскелета и спонтанной дифференцировке. В качестве фидерного слоя клеток обычно используются эмбриональные фибробласты мыши, обработанные антимитогеном - митомицином С. Отработка техники выделения, культивирования и направленной дифференцировки ЭСК во множество различных типов зрелых клеток и тканей, открыло перспективы использования этих клеток в регенеративной медицине. После первого получения линии ЭСК человека в 1998 году [1], в последующие 3 года различными академическими институтами и частными компаниями было создано ещё более 20 бессмертных линий, зарегистрированных в регистре NIH [2]. В августе 2001 президент США запретил создавать новые линии ЭСК на территории страны с исследовательской и терапевтической целью по этическим соображениям. Все линии, зарегистрированные до этой даты, могли быть использованы только с исследовательской целью [2]. В февральском номере Nature Medicine группой исследователей под руководством Varki A. из University of California было показано, что линии ЭСК человека, созданные до 2001 в США содержат ксеноантиген - сиало-вую кислоту, интегрировавшуюся из мышиного ФС и среды культивирования, содержащую заменитель сыворотки с ксенобелками. Работа вызвала немало шума, показав потенциальную непригодность этих линий для получения клеток с целью трансплантации их человеку, в связи с высоким риском иммунного ответа на них. В клетках человека, в отличие от других млекопитающих, не синтезируется сиа-ловая кислота - N-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc), однако имеется её метаболический предшественник - N-acetylneuraminic acid (Neu5Ac).
Для проверки гипотезы возможности интеграции Neu5Gc в человеческие ЭСК в стандартных условиях культивирования исследователи тестировали линию H1 (WiCell Research Institute) [3] на содержание этого ксеноантигена в мембране и цитоплазме. ЭСК культивировали в стандартных условиях мышиного ФС и заменителя сыворотки (20% KnockOut serum replacement, Gibco), что могло явиться потенциальным источником ксеноконтаминации. Для идентификации Neu5Gc использовали антитела и метод проточной цитометрии. Чтобы отличить ЭСК от фибробластов фидера при анализе, в клетки трансфецировали конструкцию, несущую метку GFP. Количественное содержание Neu5Gc в мембране и цитоплазме ЭСК измеряли методом масс-спектрометрии. Оказалось, что ЭСК содержали Neu5Gc в соотношении: 6-10,5% (от общей концентрации Neu5Gc в культуре) - в мембране, 2,5-9% в цитоплазме. Содержание Neu5Gc в эмбриоидных тельцах составляло 517% в мембране и 6.5-11 в цитоплазме. При установлении источника контаминации выяснилось, что 20% Neu5Gc содержится в мышином ФС и 54% - в самой среде, а именно - в заменителе сыворотки, содержащей ксенопротеины. Таким образом, ксеногенный фидер и добавки в культуру являются источником Neu5Gc, интегрированной в мембрану и цитоплазму ЭСК. В нормальном организме человека имеется различный уровень циркулирующих антител к Neu5Gc. Инкубация H1 линии ЭСК в условиях, содержащих
донорскую человеческую сыворотку с высоким титром анти-№и58с-антител (культура 1), приводила к быстрому иммунному ответу, опосредованному IgG-связыванием ксе-но-№и58с. Напротив, при инкубации в сыворотке с низким титром анти-Neu5Gc-антител (культура 2), уровень IgG был сравним с контрольным (ЭСК, без инкубации в донорской сыворотке). Обычно такая иммунная реакция на поверхности клетки в условиях организма заканчивается комплемент-опосредованным киллингом или фагоцитозом. 37% ЭСК культуры 1 экспрессировали C3b (молекула комплемента), против 22% клеток в культуре 2. При тестировании цитотоксичности in vitro оказалось, что культура 1 вызывает 60-70% гибель и лизис ЭСК в течение 2 часов. Таким образом, введение в организм человека клеток, выделенных из линий ЭСК (созданных в ксеногенных условиях), может привести к выраженному иммунному ответу и их быстрому лизису. Культивированиие ЭСК в человеческой сыворотке (инактивированной нагреванием) (ИСЧ), вместо использования коммерческого заменителя (Gibco), приводило к снижению количества Neu5Gc в мембране клеток ~ в 11 раз через 3 дня культивирования и ~ в 30 раз - через неделю культивирования. Обратная замена продукта сыворотки приводила к противоположному эффекту. При замене культуры 1 (неинактивированная донорская сыворотка человека с высоким титром анти-Neu5Gc-антител) на нормальную ИСЧ с последующим ведением в течение 5-ти дней, происходило снижение концентрации C3b+ (комплемент) ЭСК с 37% до 13%. При тестировании цитотоксичности в условиях ИСЧ процент лизиса оставался довольно высоким - 40%. При снятии ФС и культивировании в условиях ИСЧ ЭСК полностью сохраняли способность формировать эмбриоидные тельца.
Таким образом, исследователями было показано, что простая замена ксеногенных компонентов среды культивирования на ИСЧ приводит к значительному снижению инкорпорации Neu5Gc в ЭСК что, возможно, не будет вызывать иммунного ответа в организме при введении дериватов таких клеток. Идея о возможной контаминации линий ЭСК, культивированных в ксеногенных условиях, далеко не нова и давно требовала проверки. То, что группа Varki смогла это оригинально доказать на примере сиаловой кислоты (Neu5Gc), безусловно является заслугой исследователей перед научным миром. Сообщение было опубликовано в Nature Medicine как технический доклад, то есть именно метод, применяемый в работе оригинален и прост. Можно ли этот метод экстраполировать на прочие культуры клеток, предполагаемые для трансплантации человеку, покажет время. Кроме того, авторы исследования озабочены и тем фактом, что Neu5Gc может встраиваться в мембранные рецепторы ЭСК, которые служат их важными маркёрами - SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81. Такая инкорпорация и замена Neu5Ac может привести к модификации биологических свойств ЭСК и непредсказуемому изменению поведения клеток в культуре [4]. Большинство линий ЭСК, выделенных до 2002 года во всём мире, потенциально содержат подобный ксеноантиген, поскольку создавались в стандартных условиях культивирования [5]. Однако в последние 2-3 года рядом исследовательских групп и частными компаниями были предложены бессывороточные и бесфидерные протоколы культивирования ЭСК. Одна из исследуемых безфидерных систем предполагает использование коммерческого аналога ком-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
32
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Новые технологии
33
понентов экстрацеллюлярного матрикса - Ма^де! [6, 9, 10]. Владелец нескольких зарегистрированных линий ЭСК -корпорация Оепоп [7] - одна из первых опубликовала 2 года назад на своём веб-сайте бесфидерный протокол на основе Ма^де! [8]. Другие исследователи предлагают не отказываться от ФС, а заменить его на человеческий [11, 12]. В качестве источников последнего предлагаются стромаль-ные клетки костного мозга [13], кожные фибробласты [14], адгезивные клетки плаценты [15]. Подобные подходы уже находят применение при культивировании других клеток -потенциальных кандидатов для клеточной терапии. Напри-
мер, культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) для целей клеточной терапии в аутологичной сыворотке пациента [16]; использование фидера из СККМ [17] и бессывороточного протокола для экспансии гемопоэти-ческих клеток [18]. Все эти данные указывают на то, что эра культивирования клеток человека для клинических целей в «ксеногенных» (содержащих ксеносыворотку и ФС) условиях заканчивается. Все новые линии ЭСК должны быть созданы в условиях, свободных от источников ксеногенной контаминации.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Thomson J.A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.
2. Information on eligibility criteria for federal funding of research on human embryonic stem cells. NIH Stem Cell Information. Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute) Registered Cell Lines (United States).
3. Varki A. Loss of N-glycolylneuraminic acid in humans: mechanisms, consequences and implications for hominid evolution. Yearb Phys Anthropol 2002; 44: 54-69.
4. Carpenter M.K. et al. Characterization and differentiation of human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells 2003; 5: 79-88.
5. Draper J.S. et al. Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 2004; 13; 4: 325-36.
6. Geron Corporation Registered Cell Lines (United States). Geron Corporation. Protocols for the maintenance of human embryonic stem cells in feeder free conditions.
7. Rosler E.S. et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev Dyn 2004; 229: 259-74.
8. Amit M. et al. Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod 2004;70: 837-45.
9. Richards M. et al. Human feeders support prolonged undifferentiated
growth of human Inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Blotechnol 2002; 20: 933-6.
10. Richards M. et al. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 2003; 21: 546-56.
11. Cheng L. et al. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells 2003; 21: 131-42.
12. Hovatta O. et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod 2003;18: 1404-9.
13. Miyamoto K. et al. Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells. Stem Cells 2004; 22: 433-40.
14. Schecroun N., Delloye Ch. In vitro growth and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells supported by autologous plasma. Bone 2004; 35; 2: 517-24.
15. Yamaguchi M. et al. Bone marrow stromal cells prepared using AB serum and bFGF for hematopoietic stem cells expansion. Transfusion 2002; 42: 921-927.
16. Mobest D. et al. Serum-free ex vivo expansion of CD34(+) hematopoietic progenitor cells. Biotechnol Bioeng 1998; 60; 3: 341-7.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Nat Med 2005; 11: 228 - 32.
Крупномасштабное получение дифференцированных эритроцитов из гемопоэтических стволовых клеток человека
Известно, что гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК) является родоначальницей всех форменных элементов крови. Однако до настоящего времени не удавалось получить полностью зрелые эритроциты из ГСК in vitro и моделировать все стадии эритропоэза. Ранее сообщалось о выделении и характеристике эритроидных предшественников (ЭП) из ГСК [1-3], но не зрелых форм. Для масштабирования клеток крови из ГСК применяют 2-3-х ступенчатые протоколы культивирования. На первом этапе производят экспансию ГСК, кокультивируя их на стромальных линиях или первичных стромальных клетках костного мозга, создавая тем самым комфортное микроокружение и искусственную нишу. В последнее время исследователи добиваются высокой экспансии и хорошей дифференцировки в условиях бесстромального культивирования, что, с одной стороны, упрощает протокол, а с другой - требует добавления в культуру дополнительных цитокинов. Этап экспансии требует добавления в культуру цитокинов и факторов роста, стимулирующих пролиферацию ГСК (SCF, IL-6, IL-3, TPO, flt3-ligand) без «ухода» в лимфоидную или миелоидную диффе-ренцировку. Задача следующих этапов - стимуляция специфической дифференцировки в «стромальных или бесстромальных» условиях культивирования. В 2002 году
был опубликован первый протокол по крупномасштабному выделению ЭП человека [4]. Группе Neildez-Nguyen удалось добиться более чем 200000-кратной экспансии ГСК пу-повинной крови (CD34+) и выделения ЭП из них с чистотой 95-99%. Однако клетки становились полностью зрелыми только in vivo, в течение первых 4-х дней после инъекции в NOD/SCID мышей [4]. Новый протокол французской группы, опубликованный в Nature Biotechnology, позволяет добиться крупномасштабного выделения полностью зрелых эритроцитов человека из ГСК in vitro. CD34+ клетки выделяли из костного мозга, периферической крови (нормальной и мобилизированной G-SCF) здоровых волонтёров и пуповинной крови, методом магнитного сортинга (miniMACS). Очищенные клетки культивировали в бессывороточных условиях. Производили трехступенчатую экспансию. Первые дни ГСК культивировали в присутствии цитокинов (IL-3, SCF, EPO), стимулирующих преимущественно пролиферацию. Затем масштабированные клетки разводили в большом объёме среды и культивировали на стромальной мышиной линии MS-5 или в присутствии первичных стро-мальных клеток костного мозга человека и EPO (эритропо-этина). В заключительной стадии все цитокины отменяли, оставляя «клетки на строме» в течение 10 дней. При этом
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
