CC BY
55
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Новые технологии
33
понентов экстрацеллюлярного матрикса - Ма^де! [6, 9, 10]. Владелец нескольких зарегистрированных линий ЭСК -корпорация Оепоп [7] - одна из первых опубликовала 2 года назад на своём веб-сайте бесфидерный протокол на основе Ма^де! [8]. Другие исследователи предлагают не отказываться от ФС, а заменить его на человеческий [11, 12]. В качестве источников последнего предлагаются стромаль-ные клетки костного мозга [13], кожные фибробласты [14], адгезивные клетки плаценты [15]. Подобные подходы уже находят применение при культивировании других клеток -потенциальных кандидатов для клеточной терапии. Напри-
мер, культивирование стромальных клеток костного мозга (СККМ) для целей клеточной терапии в аутологичной сыворотке пациента [16]; использование фидера из СККМ [17] и бессывороточного протокола для экспансии гемопоэти-ческих клеток [18]. Все эти данные указывают на то, что эра культивирования клеток человека для клинических целей в «ксеногенных» (содержащих ксеносыворотку и ФС) условиях заканчивается. Все новые линии ЭСК должны быть созданы в условиях, свободных от источников ксеногенной контаминации.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Thomson J.A. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.
2. Information on eligibility criteria for federal funding of research on human embryonic stem cells. NIH Stem Cell Information. Wisconsin Alumni Research Foundation (WiCell Research Institute) Registered Cell Lines (United States).
3. Varki A. Loss of N-glycolylneuraminic acid in humans: mechanisms, consequences and implications for hominid evolution. Yearb Phys Anthropol 2002; 44: 54-69.
4. Carpenter M.K. et al. Characterization and differentiation of human embryonic stem cells. Cloning Stem Cells 2003; 5: 79-88.
5. Draper J.S. et al. Culture and characterization of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev 2004; 13; 4: 325-36.
6. Geron Corporation Registered Cell Lines (United States). Geron Corporation. Protocols for the maintenance of human embryonic stem cells in feeder free conditions.
7. Rosler E.S. et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Dev Dyn 2004; 229: 259-74.
8. Amit M. et al. Feeder layer- and serum-free culture of human embryonic stem cells. Biol Reprod 2004;70: 837-45.
9. Richards M. et al. Human feeders support prolonged undifferentiated
growth of human Inner cell masses and embryonic stem cells. Nat Blotechnol 2002; 20: 933-6.
10. Richards M. et al. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 2003; 21: 546-56.
11. Cheng L. et al. Human adult marrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells 2003; 21: 131-42.
12. Hovatta O. et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod 2003;18: 1404-9.
13. Miyamoto K. et al. Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells. Stem Cells 2004; 22: 433-40.
14. Schecroun N., Delloye Ch. In vitro growth and osteoblastic differentiation of human bone marrow stromal cells supported by autologous plasma. Bone 2004; 35; 2: 517-24.
15. Yamaguchi M. et al. Bone marrow stromal cells prepared using AB serum and bFGF for hematopoietic stem cells expansion. Transfusion 2002; 42: 921-927.
16. Mobest D. et al. Serum-free ex vivo expansion of CD34(+) hematopoietic progenitor cells. Biotechnol Bioeng 1998; 60; 3: 341-7.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Nat Med 2005; 11: 228 - 32.
Крупномасштабное получение дифференцированных эритроцитов из гемопоэтических стволовых клеток человека
Известно, что гемопоэтическая стволовая клетка (ГСК) является родоначальницей всех форменных элементов крови. Однако до настоящего времени не удавалось получить полностью зрелые эритроциты из ГСК in vitro и моделировать все стадии эритропоэза. Ранее сообщалось о выделении и характеристике эритроидных предшественников (ЭП) из ГСК [1-3], но не зрелых форм. Для масштабирования клеток крови из ГСК применяют 2-3-х ступенчатые протоколы культивирования. На первом этапе производят экспансию ГСК, кокультивируя их на стромальных линиях или первичных стромальных клетках костного мозга, создавая тем самым комфортное микроокружение и искусственную нишу. В последнее время исследователи добиваются высокой экспансии и хорошей дифференцировки в условиях бесстромального культивирования, что, с одной стороны, упрощает протокол, а с другой - требует добавления в культуру дополнительных цитокинов. Этап экспансии требует добавления в культуру цитокинов и факторов роста, стимулирующих пролиферацию ГСК (SCF, IL-6, IL-3, TPO, flt3-ligand) без «ухода» в лимфоидную или миелоидную диффе-ренцировку. Задача следующих этапов - стимуляция специфической дифференцировки в «стромальных или бесстромальных» условиях культивирования. В 2002 году
был опубликован первый протокол по крупномасштабному выделению ЭП человека [4]. Группе Neildez-Nguyen удалось добиться более чем 200000-кратной экспансии ГСК пу-повинной крови (CD34+) и выделения ЭП из них с чистотой 95-99%. Однако клетки становились полностью зрелыми только in vivo, в течение первых 4-х дней после инъекции в NOD/SCID мышей [4]. Новый протокол французской группы, опубликованный в Nature Biotechnology, позволяет добиться крупномасштабного выделения полностью зрелых эритроцитов человека из ГСК in vitro. CD34+ клетки выделяли из костного мозга, периферической крови (нормальной и мобилизированной G-SCF) здоровых волонтёров и пуповинной крови, методом магнитного сортинга (miniMACS). Очищенные клетки культивировали в бессывороточных условиях. Производили трехступенчатую экспансию. Первые дни ГСК культивировали в присутствии цитокинов (IL-3, SCF, EPO), стимулирующих преимущественно пролиферацию. Затем масштабированные клетки разводили в большом объёме среды и культивировали на стромальной мышиной линии MS-5 или в присутствии первичных стро-мальных клеток костного мозга человека и EPO (эритропо-этина). В заключительной стадии все цитокины отменяли, оставляя «клетки на строме» в течение 10 дней. При этом
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2005
■ мм
ш
Новости клеточных технологий. Новые технологии
количество клеток увеличивалось в 16 500 раз для ГСК костного мозга и периферической крови, в 29 000 - для мобилизированной крови и в 140 000 для клеток пуповин-ной крови. Так, например, из 1 миллиона CD34+ клеток, выделенных их мобилизированной крови, получали 30 миллиардов безъядерных эритроцитов. На 8-й день культивирования 95-98% клеток характеризовались как эритроб-ласты. Количество безъядерных клеток возростало с 1-5% на 11 день культивирования до 65-80% - на 15-й день (98% из них были ретикулоцитами). Дифференцировка ре-тикулоцитов в зрелые эритроциты наблюдалась с 15-го по 18-й день культивирования. На конечном этапе чистота зрелых эритроцитов в культуре составила 90-100%. Диф-ференцировку в ЭП подтверждали исследованием характерных колоний - BFU-E (burst forming unit-erythroid) и CFU-E (colony forming unit-erythroid). Интересно, что способность к экспансии ГСК и ЭП сохранялась и в бесстро-мальных условиях культивирования, однако при этом утрачивалась финальное «созревание» ретикулоцитов в зрелые формы. Общее время культивирования составляло 18 дней, за которое расходовалось 10 литров среды. В предложенной системе был показан процесс нормального синтеза гемоглобина. Так, 95% эритроцитов, выделенных из ГСК костного мозга и периферической крови, содержали HbA и около половины из них - HbF. 64% эритроцитов, выделенных из ГСК пуповинной крови, содержали фетальный гемоглобин (HbF). Другим признаком функциоирования полученных клеток была активность ферментов -фосфат-дегидрогеназы (G6PD) и пируват-киназы (PK). Тест на способность фиксировать и освобождать кислород подтвердил полную функциональную зрелость полученных клеток. Показатели «кислородных» тестов были очень близки к контрольным пробам - эритроцитам, взятым от тех же доноров. Для подтверждения способности к дифференциров-ке in vivo, NOD/SCID мышам интраперитонеально вводили меченые ретикулоциты, порлученные in vitro. Через 3 дня наблюдали большинство (>90%) меченых клеток в периферическом кровотоке, подтверждая их происхождение от человека. Получение полностью зрелых эритроцитов in vitro позволит изучить эритропоэз в норме и патологии. Предложенный способ масштабирования эритроцитов in vitro впервые открывает в медицине возможность аутогемотран-сфузий аутогенных доз эритромассы. Так, одна стандартная доза донорских эритроцитов содержит 2Ч1012 клеток. Из одного образца пуповинной крови можно выделить 2-5 млн CD34+ клеток, а из мобилизированной крови ~ 5 млн/ кг веса. При показанной исследователями степени экспансии можно получить как минимум 1 полноценную дозу эрит-ромассы. То есть, предложенный протокол вполне совместим с клиническими требованиями по количеству
Рис. Различные стадии дифференцировки эритроцитов
в культуре, а - CD34+ клетки (сразу после выделения),
б - эритробласты (8 суток),
в - ретикулоциты (15 суток),
г - зрелые эритроциты (18 суток).
Окраска по Мэй-Грюнвальд-Гимза. Ув. Ч 500.
Из Nat Biotechnol (Advanced Online Publication - Published
26, December 2004; doi:10.1038/nbtl047) с
изменениями.
эритроцитов для трансфузий. Подобные аутогемотрансфу-зии могут быть полезны при различных формах анемий и хронических кровопотерях, но не в острых ситуациях. Так, при серповидно-клеточной анемии можно искусственно повысить количество незрелых форм, богатых HbF, что возможно, приведёт к коррекции полимеризации гемоглобина и терапевтическому эффекту. Аутоэритроцитарная трансфузия позволит поддерживать срок жизни введённых клеток до 120 суток, в то время как донорские эритроциты способны жить в реципиенте только 28 дней. Теоретически, метод способен совершить революцию в медицине, несмотря на высокую стоимость и стать уникальным. При этом следует помнить о высоком риске инфицирования и о гарантиях безопасной (по HIV, HCV, HBV и т.д.) трансфузии эритроцитов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Freyssinier J.M. et al. Purification, amplification and characterization of a population of human erythroid progenitors. Br J Haematol 1999; 106: 912-22.
2. Panzenbock B. et al. Growth and differentiation of human stem cell factor/erythropoietin-dependent erythroid progenitor cells in vitro.
Blood 1998; 92: 3658-68.
3. Fibach E. et al. Proliferation and maturation of human erythroid progenitors in liquid culture. Blood 1989; 73: 100-3.
4. Neildez-Nguyen T.M. et al. Human erythroid cells produced ex vivo at large scale differentiate into red blood cells in vivo. Nat Biotechnol 2002; 20: 467-72.
Подготовил А.В. Берсенев; по материалам Nat Biotechnol (Advanced Online Publication - Published 26, December 2004; doi:10.1038/nbt1047).
3
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 1, 2GG5
