CC BY
114
I I I I I
Ш
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Особенности культивирования ЭСК человека в отсутствии сыворотки и фидера
Е.С. Филоненко, А.Н. Камнев, В.Г. Зауторов, М.В. Шутова, П.В. Цховребова,
A.H. Богомазова, С.П. Киселев, М.А. Пагарькова Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва
Cultivation properties of human embryonic stem cells in the absence of serum and feeder layer
E.S. Philonenko, A.N. Kamnev, V.G. Zautorov, M.V. Shutova, L.V. Tskhovrebova,
A.N. Bogomazova, S.L. Kiselev, M.A. Lagarkova Vavilov Institute of general genetics, Moscow
Клетки 5 линий эмбриональных стволовых клеток [ЭСК) человека [hESM01, hESM02, hESM03,hESM04, HUES-9), ранее культивируемые на фидере из эмбриональных фибробластов мыши и в присутствии заменителя сыворотки, были переведены на новые условия культивирования. На протяжении 20 пассажей культивирование проводилось на двух средах, рекомендованных производителями для бесфидерного культивирования ЭСК человека - среде mTESRI [StemCell Technologies, Канада) и среде StemPro [Invitrogen, США). В качестве подложки для культивирования использовался Matrigel [BD Biosciences, США). ЭСК, культивируемые в полностью определенных условиях среды и в отсутствии компонентов животного происхождения, сохранили плюрипотентность и способность дифференцироваться. Клетки перенесли криоконсервирование. При бесфидерном культивировании отмечено изменение морфологии колоний ЭСК. Увеличение пролиферативной активности, наблюдаемое при использовании бесфидерного способа культивирования ЭСК, позволяет существенно увеличить количество получаемых клеток.
Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки человека (чЭСК), культивирование, плюрипотентность.
Cultivation conditions for five human embryonic stem cell lines (hESM01, hESM02, hESM03, hESM04, HES-9) were switched from serum replacement containing medium with mouse embryonic fibroblasts as a feeder to two commercialy available media (mTESRI by StemCell Technologies, Canada and StemPro by Invitrogen, USA). Cell lines were maintained in these media for more than 20 passages. Matrigel (BD Biosciences, USA) was used as a substrate. hESCs cultivated in defined media and without animal derived components retain their pluripotency and differentiation ability . Changes in morphology of feeder-free hESC colonies were observed. Feeder-free hESC cultivation gives possibility to get larger amount of cells due to increase of proliferative activity.
Key word: human embryonic stem cells (hESCs), cultivation, pluripotency.
Введение
Первые линии эмбриональных стволовых клеток [ЭСК] мыши и человека [мЭСК и чЭСК соответственно] были получены при культивировании с использованием подслоя из ми-тотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши [1, 2]. Такой метод широко применяется до сих пор, хотя культивирование мЭСК без фидера с использованием LIF давно вошло в рутинную лабораторную практику [3]. Идентификация ростовых факторов [фактора роста фибробластов [ФРФ], трансформирующего фактора роста в (ТФРв) и компонентов внеклеточного матрикса [фибронектин, коллаген IV типа, витронектин], способствующих самопод-держанию чЭСК, позволила разработать среды для бесфидерного культивирования чЭСК [4, 5]. Переход на среды со строго определенным составом и без компонентов животного происхождения диктуется требованиями по воспроизводимости результатов исследований, а также возможным перспективным практическим применением этих клеток.
Возможное применение дифференцированных производных чЭСК в клинической практике может потребовать использования строго определенных компонентов культуральной среды. Использование сред, содержащих продукты
животного происхождения, нежелательно по целому ряду причин: во-первых, возможна контаминация сыворотки или фидера вирусами, опасными для человека; во-вторых, неопределенный состав сывороток и фидера из эмбриональных фибробластов варьирует от лота к лоту, что сказывается как на сохранении клетками плюрипотентности и стабильности генома, так и на их потенциале дифферен-цировки. Кроме того, было показано, что чЭСК, культивируемые с использованием фидера из мышиных фибробластов, экспрессируют Neu5Gc, сиаловую кислоту, которые могут инициировать иммунный ответ после трансплантации [6]. Таким образом, переход на бесфидерное культивирование ЭСК и использование бессывороточных сред является важным шагом на пути к использованию ЭСК в клинической практике.
Кроме сугубо прикладных аспектов переход на бесфи-дерное культивирование в средах с полностью определенным составом увеличивает воспроизводимость результатов исследований, так как вариации в фидерных клетках или в лотах сыворотки делают невозможным воспроизведение результатов при смене животных или компаний-произво-дителей.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
тттт
Материал и методы
Клеточные линии
В работе использовались клеточные линии hESM01, hESM02, hESM03, hESM04 [7] и HUES-9 [8]. Культивирование проводили на двух средах для бесфидерного культивирования чЭСК - среде mTESRI (Stem Cell Technologies, Канада) и среде StemPro (Invitrogen, США). В качестве подложки для культивирования использовался Matrigel (BD Biosciences, США). Смена среды производилась каждый день. Клетки пассировали каждые 5-7 сут. с использованием 1 mg/ml диспазы (Invitrogen, США). Чтобы индуцировать формирование эмбриоидных телец (ЭТ) колонии ЭСК после диссоциации переносились в пластиковые чашки Петри с низкой адгезией (Corning, США) и растили 14 сут. в среде KO DMEM с 20% FBS, 1 mM глютамина, 1% незаменимых аминокислот, 50 units/ml пеницилина, 50 мg/ml стрептомицина (HyClone, США), 0,1 mM ß-меркаптоэтанола (Sigma, США). Для замораживания использовали специальную среду для заморозки чЭСК FESR (Sternhell Technologies, США) , и среду, содержащую 90% FBS и 10% DMSO. Для длительного хранения клетки помещались в жидкий азот.
Иммуноцитохимические исследования
Клетки фиксировали в 100% метаноле или 3% параформальдегиде.
Для иммуноцитохимического анализа использовались следующие антитела: первичные - anti-human oct 4 (Chemicon, США), anti-human Tra-1-60 (Chemicon, США), anti-human SSEA-4 (Hybridoma Bank, США), anti-human CD30 (Ber-H2) (Chemicon, США) anti-human ß-tubulin (Chemicon, США); вторичные - goat anti-mouse, goat antirabbit Alexa Fluor 488 или 546 Ig (Molecular Probes, США). Окрашивание проводилось согласно протоколам, рекомендованным производителями. Ядра клеток дополнительно окрашивали DAPI.
Видеомикроскопия
Окрашенные флуоресцентной меткой препараты клеток изучали при помощи видеоидентификационной микроскопии на флуоресцентном микроскопе Axio Imager A1 (Carl Zeiss, Австрия).
Выделение тотальной РНК
из клеточных культур
Для выделения тотальной РНК из клеточных культур использовали колонки MiniRNA kit (Qiagen, США) согласно прилагающимся инструкциям. Обработка ДНКазой осуществлялась непосредственно на колонках, с использованием прилагающемуся к набору MiniRNA kit ДНКазы I и буфера.
Реакция обратной транскрипции
Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием случайных шестинуклеотидных праймеров (Amersham Biosciences, США), ферментов RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas, США), Ribonuclease Inhibitor (Promega, США), dNTP (Pharmacia Biotech, США) при 37°С в течение 60 мин. На одну реакцию использовали около 1 мкг тотальной РНК. Продукты обратной транскрипции использовались для дальнейшего анализа с помощью полимеразной цепной реакции.
Полимеразная цепная реакция
Для проведения ПЦР-амплификации продуктов реакции обратной транскрипции брали 0,1-0,5 часть реакционной смеси. Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР указаны в таблице.
Последовательности праймеров для ОТ-ПЦР
Название гена Последовательность праймеров (5’-3’)
FoxD3 CAAGCCCAAGAACAGCCTAGTGAA TGACGAAGCAGTCGTTGAGTGAGA
Hesx1 ACCTGCAGCTCATCAGGGAAAGAT AAAGCAGTTCTTGGTCTTCGGCCT
REST TGCTGTGATTACCTGGTCGGTGAA TCTTCGAGCTCTTGCCTTTGTCCT
Sox2 CCCCCGGCGGCAATAGCA TCGGCGCCGGGGAGATACAT
NANOG AGCATCCGACTGTAAAGAATCTTCAC CGGCCAGTTGTTTTTCTGCCACCT3’
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTCA TTCACACCCATGACGAACAT
Результаты и обсуждение
Пять линий ЭСК (hESM01, hESM02, hESM03, hESM04, HUES-9) 10-35 пассажей, ранее растущих на фидере из мышиных эмбриональных фибробластов, были переведены на культивирование in vitro в бесфидерных условиях и успешно культивировались более 20 пассажей. Переход на новые условия культивирования потребовал существенного изменения техники культивирования клеток и модификации протоколов пересева. Пересев с использованием способа механической диссекции колоний без предварительной энзиматической обработки оказался неприемлем для культур на матригеле, так как приводил к низкой выживаемости клеток после пересева. Энзиматический пересев требовал подбора времени обработки диспазой для каждой конкретной линии. Слишком большая плотность клеток на чашке или слишком частый пересев приводили к гибели или дифферен-цировке большого числа клеток. При бесфидерном культивировании чЭСК изменялась морфология колоний (рис. 1А). Они становились более плоскими и менее плотными. При культивировании в бесфидерных условиях увеличивалась пролиферативная активность - митотический индекс возрастал более чем в 2 раза. Хотя в руководстве к среде mTESR-1 указано, что оптимальное разведение при пересеве чЭСК - от 1:6 до 1:10 в наших условиях оптимальным разведением было 1:4-1:6. Возможным объяснением может служить то, что мы добавляли в среду антибиотики (пенициллин и стрептомицин) что несколько снижает скорость роста клеток. В результате тестирования бессывороточных сред было отмечено, что использование бесфидерного способа культивирования позволяет существенно увеличить выход клеточной массы (до 5 млн. клеток с 10 см2 поверхности, в отличие от 500-600 тыс. при культивировании на МЭФ). Тем не менее, наряду с большим числом делящихся клеток и быстрым наращиванием клеточной массы, большое число клеток (до 10% ежедневно) погибало (рис. 1Б). Причины и способ клеточной гибели пока остается неизученным, хотя по характерной фрагментации ядер клеток можно предположить, что это апоптоз.
чЭСК, культивируемые в бесфидерных условиях, сохраняют характеристики, определяющие их как стволовые, а именно: экспрессия поверхностных маркеров и специфических генных продуктов, свидетельствующая о сохранении плюрипотентности при пассировании. Иммуноцитохимичес-кий и ОТ-ПЦР анализы показали, что чЭСК, культивируемые в бесфидерных условиях, сохраняют экспрессию поверхностных специфических маркеров (рис. 2) и характерных транскрипционных факторов (рис. 3).
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N° 3, 2008
тттт
ш
Рис. 1. Культура чЭСК линии hESM01:
А- колонии чЭСК в светлом поле, 4-е сут. после пассирования в среде mTESR-1;
Б - тройное иммуногистохимическое окрашивание клеток чЭСК в колонии. Клетки окрашены антителами против oct-4 (красный), ß-тубулина (зеленый). Ядра окрашены DAPI (синий).
Желтые стрелки указывают на клетки в состоянии митоза, оранжевая стрелка -на гибнущую клетку с фрагментированным ядром
Рис. 2. Экспрессия специфических маркеров чЭСК при культивировании в бесфидерных условиях:
А - SSEA-4;
Б - TRA-1-60;
В - CD-30.
Ядра окрашены DAPI. Масштаб -100 mM
m FoxD3 Hesxl REST Sox 2 Nanog
■ + — + — + — + — + —
— - 1 1 •
Рис. 3. Результат ОТ-ПЦР-анализа экспрессии специфических транскрипционных факторов чЭСК линии hESM01, при культивировании в среде mTESRI. m-маркер молекулярного веса. Дорожки (-) представляют отрицательный контроль
Ранее нами был разработан ряд протоколов по направленной дифференцировке чЭСК в нейроны, кератиноци-ты, эндотелий [9]. Эти протоколы были успешно применены для чЭСК, культивируемых в описанных условиях с минимальными модификациями. Клетки успешно проходят криоконсервирование в среде для заморозки FESR. Процент колоний, вышедших после криоконсервации, в полтора-два раза выше по сравнению с использованием стандартной среды для заморозки, содержащей 90% FBS и 10% ДМСО.
Следует отметить, что mTESR1 гораздо удобнее в использовании, чем StemPгo, так как готовая среда содержит 2 компонента [собственно среду и 5-кратную добавку к среде], по сравнению с пятью компонентами среды StemPгo; может храниться при температуре +4°С в течение 2-х нед. или до полугода при температуре -20°С.
fMTEPATyPA:
1. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292(5819): 154-6.
2. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.
3. Nichols J., Evans E.P., Smith A.G. Establishment of germ-line-competent embryonic stem (ES) cells using differentiation inhibiting activity. Dev. 1990; 110(4): 1341-8.
4. Ludwig T.E., Levenstein M.E., Jones J.M. et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 2006; 24: 185-7.
T.E. Ludwig и соавт. (2006) утверждают, что среда mTESR способствует поддержанию стабильного кариотипа чЭСК [4]. Мы можем подтвердить эти данные с небольшой оговоркой - в процессе культивирования мы замечали небольшое количество (около 5%) анеуплоидных (3n-4n) клеток. В процессе культивирования в течение 20 пассажей процент аномальных клеток не увеличивался, подобный феномен требует дальнейшего изучения.
Недавно нами, в сотрудничестве с Красноярским Центром репродуктивной медицины, была получена новая линия чЭСК на среде mTESRI, без использования фидера (статья готовится к публикации). Таким образом, по нашему мнению, среда mTESRI, несмотря на ее высокую стоимость, на данный момент является не только лучшей из коммерчески доступных сред для культивирования чЭСК, но и может использоваться для получения новых линий, потенциально пригодных для медицинских целей.
5. Ludwig T.E., Bergendahl V., Levenstein M.E. et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat. Methods. 2006; 3(8): 637-46.
6. Martin M.J., Muotri A., Gage F., Varki A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat. Med. 2005; 11: 228-32.
7. Lagarkova M.A., Volchkov P.Y., Lyakisheva A.V. et al. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle 2006; 5: 416-20.
8. Cowan C.A., Klimanskaya I., McMahon J. et al. Derivation of embryonic stemcell lines from human blastocysts. N. Engl. J. Med. 2004; 35013: 1353-6.
9. Киселев С.Л., Волчков П.Ю., Филоненко Е.С. и др. Молекулярная и клеточная биология линий ЭСК человека. Молекулярная медицина 2006; 2: 6-11.
Поступила 07.07.2008
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 3, 2008
