CC BY
38
■ ИМИ!
Оригинальные исследования
ЕЕ^ЕШ
Секретируемый транскрипционный фактор Н0ХВ4 стимулирует дифференцировку эндотелия из ЭСК человека
МА. Лагарькова1, И А. Муфазалов2, П.Ю. Волчков2, CJ1. Киселев1 1Институт общей генетики РАН, Москва 2Институт биологии гена РАН, Москва
Secreted transcription factor НОХВ4 promotes human ESCs endothelial lineage
M.A. Lagarkova1, I.A. Mufasalov2, P.Yu. Voltchkov2, S.L. Kiselyev1 1 Vavilov Institute of General Genetics, RAS, Moscow institute of Gene Biology, RAS, Moscow
Целью данного исследования было выяснить, влияет ли секретируемый транскрипционный фактор Н0ХВ4 на дифференцировку ЭСК человека в эндотелий. Н0ХВ4 - мультифункциональный транскрипционный фактор, способный индуцировать или подавлять апоптоз, стимулировать или репрессировать пролиферацию и дифференцировку клеток. Известна важная роль Н0ХВ4 в регуляции гемопоэза. Для выяснения влияния Н0ХВ4 на дифференцировку в эндотелий было проведено кокультивирование ЭСК человека со стромальными клетками линии 0Р9 и клетками линии OP9hoxb4, секретирующими транскрипционный фактор Н0ХВ4-ТАТ. Проведенный иммуногис-тохимический анализ не выявил различие экспрессии клетками эндотелиальных маркеров в зависимости от используемого фидера, но маркеры зрелого эндотелия [CD105} и сосудоподобные структуры, растущие на фидере из OP9hoxB4, проявлялись быстрее, чем на фидере 0Р9. Таким образом, наши данные позволяют утверждать, что секретируемый Н0ХВ4-ТАТ оказывает влияние на контролируемую дифференцировку эмбриональных стволовых клеток человека по эндотелиальному пути.
Ключевые слова: эндотелий, дифференцировка, ЭСК человека, Н0ХВ4.
The effect of the transcription factor H0XB4 on differentiation abilities of human ESCs to endothelial lineage was the aim of the present study. H0XB4 Is a multifunctional transcription factor inducing or inhibiting apoptosis, promoting or repressing cell proliferation and differentiation. H0XB4 plays an important role in development and hematopoesis. 0P9 stromal cells or OP9hoxb4 cells secreting transcription factor H0XB4-TAT were co-cultured with human embryonic stem cells to induce endothelial differentiation. OP9hoxb4 feeder cells significantly promoted timing of endothelium maturation both on the level of Immunological makers expression and functionally in comparison with 0P9 feeder. Thus our data Indicate that secreted H0XB4-TAT largely Influence controlled differentiation of human ESCs to endothelial cells.
Key words: endothelium, differentiation, hESCs, HÜXB4.
Введение
К настоящему времени получен целый ряд доказательств общего происхождения гематопоэтических и эндотелиаль ных клеток в процессе развития. Клетки предшественники, потенциально способные образовывать гематопоэтические и эндотелиальные клетки, были идентифицированы in vitro на модели ЭСК мыши [1 3] и позже in vivo при изучении гас труляции мышиного эмбриона [4]. При дифференцировке ЭСК мыши было также показано, что клоногенные гема топоэтические предщественники могут происходить из VE cadher¡n^CD45~ клеток эндотелиального типа [5]. Нами ведутся работы по прямой дифференцировке ЭСК человека в клетки эндотелия и разрабатываются методы селекции дифференцированных клеток. Используя коллаген IV и кол лаген I в качестве матрикса, специальную среду и VEGF и bFGF в качестве ростовых факторов, нам удалось получить клеточные популяции, в которых эндотелиальные клетки со ставляют более 50% (статья готовится к печати). Известно, что на гематопоэтическую дифференцировку ЭСК значи тельное влияние оказывает кокультивирование с мышины ми стромальными клетками, а также гиперэкспрессия транскрипционного фактора Н0ХВ4 [6 8]. Учитывая об щее происхождение гематопоэтических и эндотелиальных клеток, не исключено, что оба фактора могут существенным образом стимулировать процессы дифференцировки.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
Н0ХВ4 принадлежит к высококонсервативному семейству гомеобоксных транскрипционных факторов НОХ, играющих важнейшую роль в морфогенезе многоклеточных организмов. НОХ семейство характеризуется наличием высококонсерва тивного ДНК связывающего домена; кластерным расположе нием генов в хромосомах; особым порядком внутри группы, отражающим пространственно временную характеристику экспрессии в эмбриогенезе. Н0ХВ4 мультифункциональный транскрипционный фактор, способный индуцировать и подав лять апоптоз, стимулировать и репрессировать пролиферацию и дифференцировку клеток В эмбриогенезе Н0ХВ4 участву ет в развитии эпидермиса, нервной и скелетной систем [6]. Особая роль принадлежит Н0ХВ4 в регуляции гематопоэза млекопитающих. Эктопическая экспрессия Н0ХВ4 в ство ловых клетках крови мыши приводит к более чем 1000 кратному увеличению числа поликлональных гематопоэти ческих предшественников, преимущественно лимфоидного и миелоидного ряда, без признаков трансформации клеток [7].
Экспрессия НохВ4 в человеческом костном мозге и в пуповинной крови усиливает репопуляционную способность гематопоэтических стволовых клеток, не усиливает их диф ференцировку и не индуцирует лейкемию [9]. Нокаут НохВ4 приводит к уменьшению клеток в гематопоэтических орга нах и уменьшению количества гематопоэтических предше ственников у мышей [10]. Однако, используя лентивирусную
А
I I I I I
ЕЖИ
Ш
Оригинальные исследования
+
экспрессию НохВ4 в гематопоэтических клетках, получен ных из человеческих ЭСК, не удалось увеличить время жиз ни таких клеток при подсадке иммунодефицитным мышам [11]. В линии ЭСК человека, стабильно экспрессирующей Н0ХВ4, клетки можно поддерживать в недифференцирован ном состоянии, а при дифференцировке с образованием эмбриоидных телец наблюдается преимущественная диф ференцировка в гематопоэтические клетки [12]. Недавно был показан дозо зависимый эффект действия Н0ХВ4 на пролиферацию гематопоэтических клеток [13].
Целью данного исследования было выяснить, влияет ли секретируемый транскрипционный фактор Н0ХВ4 на диф ференцировку ЭСК человека в эндотелий.
Предпосылкой к исследованию послужил ряд опубли кованных данных о стимулирующем влиянии НохВ4 на дифференцировку гематопоэтических клеток, а также наблюдения проф. А.Я. Медвинского о стимулирующей роли Н0ХВ4 при эндотелиальной дифференцировке CD45FLK1~ клеток из AGM (aorta gonad mesonephros] эмбрионов мыши (неопубликованные данные].
Для изучения роли Н0ХВ4 в дифференцировке ЭСК че ловека мы сравнили дифференцировку ЭСК человека при культивировании на двух разных фидерах. Первый фидер представлял собой линию стромальных фибробластов мыши 0Р9. В научной литературе имеются многочисленные све дения об увеличении количества и скорости дифференци ровки клеток крови при кокультивировании с этой линией стволовых клеток крови, клеток, обладающих свойствами гемангиобласта и эмбриональных стволовых клеток мыши и человека [8, 14, 15]. 0Р9 также поддерживает пролифе рацию и дифференцировку эндотелиальных FLk1 предше ственников, происходящих из ЭСК мыши [16].
Вторым фидером служили клетки 0Р9 НохВ4. Это ли ния клеток на основе линии 0Р9, стабильно экспрессирую щая секретируемый НохВ4 с TAT (transduction domain of HIV transactivating protein] для транслокации в ядро.
Материал и методы
В работе использовались клеточные линии эмбриональных стволовых клеток человека ESM02 и ESM03 [17] с 25 по 41 пассаж, культивирование происходило в следующих условиях: Knockout DMEM [Invitrogen], 20% фетальная бычья сыворот ка (Invitrogen, ES qualified], 2 мМ L глутамин [Invitrogen], 0.1 мМ Р меркаптоэтанол [Sigma], 1 % смесь аминокислот [Invitrogen], рекомбинантный bFGF (4 нг/ml] [Chemicon], пенициллин/ стрептомицин [50 ЕД/мл; 50 мкг/мл] [Invitrogen] при 37°С и 5% С02 на фидерном слое МЭФ, инактивированных митоми цином С в желатинизированных 35 мм культуральных чашках Петри (Corning и Greiner], Клеточные линии 0Р9, OP9hoxB4 (получены в RIKEN Center for Developmental Biology, Япония]
и первичные инактивированные мышиные эмбриональные фибробласты [МЭФ] культивировались в среде a МЕМ, 20% фетальная бычья сыворотка, пенициллин/стрептоми цин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл], 2 мМ L глутамин [Invitrogen],
Для индукции эндотелиальной дифференцировки колонии недифференцированных ЭСК снимали механической диссек цией (как описано выше] и переносили на чашки Петри, по крытые коллагеном IV типа [Sigma] в среду, содержащую DMEM/F12 [HyClone], 15% фетальной бычей сыворотки (HyClone, characterized], 1% смесь аминокислот [Invitrogen], пенициллин/стрептомицин (50 ЕД/мл; 50 мкг/мл] [Invitrogen], рекомбинантный bFGF (4 нг/мл], SCF (20 нг/мл] -VEGF от 10 до 25 нг/мл [Chemicon],
Для иммуногистохимического анализа эмбриональных стволовых клеток и эмбриоидных телец использовались еле дующие антитела: первичные (anti human CD31, anti human vWF, anti human CD 105 [BD]] и вторичные (goat anti mouse Alexa Fluor 488 или 546 Ig (Molecular Probes]].
Результаты и их обсуждение
При использовании OP9hoxB4 и 0Р9 для индукции эндо телиальной дифференцировки клетки высевали в плотности около 50% монослоя в одинаковые 6 луночные планшеты. После прикрепления OP9hoxB4 и 0Р9 на них высевали ко лонии ЭСК человека, предварительно освобожденные с по мощью коллагеназы от фидера МЭФ. Культивирование про водилось в течение 5 10 дней в среде для дифференцировки эндотелия с меньшим (5 нг/мл] содержанием всех ростовых факторов. Состояние клеток и степень их дифференцировки оценивались через 7 дней по следующим параметрам: ко личество клеток в колонии; морфология клеток в колонии; диаметр колонии; количество эндотелиальных клеток и сте пень их дифференцировки.
Число клеток в колонии оценивалось следующим обра зом: по 20 колоний с каждого из фидеров снимали механи чески наконечником от пипетки, промывали дважды PBS и инкубировали 15 минут в нагретом до 37°С 0,05% трипси не, после чего инактивировали последний добавлением FBS. Клетки центрифугировали, разбавляли в 500 мкл среды DMEM и подсчитывали в камере Горяева.
К сожалению, нам не удалось получить статистически достоверных данных о том, есть ли разница в общем коли честве клеток в колониях, растущих на OP9hoxB4 и 0Р9. Это можно объяснить и объективными, и субъективными фак торами: клетки в колонии после 7 дней дифференцировки находятся в разных ее стадиях, популяция гетерогенна и имеет разную чувствительность к трипсину. В то время как одни группы клеток еще не успевают распасться на одиноч ные, другие «перетрипсиниваются» и слипаются в конгло мераты. Подсчет, таким образом, затруднен, и мы решили,
+
Рис, 1. Морфология колоний ЭСК человека линии ЕЭМ02 на 10 день культивирования на различных фидерах:
А - колонии ЭСК на фидере из МЭФ; В - колонии ЭСК на фидере из 0Р9; С - колонии ЭСК на фидере из ОР9!похВ4 Стрелками указаны сосудистоподобные структуры
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, № 1, 2007
І І І І І І
■ І І І
Оригинальные исследования
что он не может считаться достоверным. Другой способ под счета - окрашивание фиксированных колоний ОАР1 также не дал обнадеживающих результатов, потому что колонии -структура многослойная, и ядра часто заслоняют друг друга, делая подсчет практически невозможным.
Тем не менее, на фидерах ОР9ИохВ4 и ОР9 колонии име ли явные различия в морфологии и размере (рис. 1). По скольку колонии вырастали достаточно большие, хорошо видные невооруженным глазом, для определения размера применялась как микроскопия (соотнесение увеличения объектива с размером объекта в светлом поле), так и про стое измерение линейкой (фиксированную в метаноле чашку с колониями переворачивали, отмечали тонким фломасте ром границы колонии и измеряли диаметр). Измерения по казали, что кокультивирование ЭСК с 0Р9 и ОР9ИохВ4 ве дет к существенному увеличению размера колоний уже после трех дней кокультивирования (рис. 2). Морфология дифференцированных ЭСК на двух фидерах также отлича лась: в колониях, которые росли на ОР9ИохВ4, было больше структур, подобных сосудистой сети (указаны стрелками на рис. 1, б) и больше клеток, имеющих более высокий статус дифференцировки (меньшее соотношение ядро/цитоплаз ма, больший размер и др. характеристики).
Для того чтобы определить, как повлияло культивирование на разных фидерах на дифференцировку эндотелия из ЭСК,
Рис. 2. Зависимость диаметра дифференцирующейся колонии ЭСК от используемого фидера: 0Р9 либо 0Р9!юхВ4.
был проведен иммуногистохимический анализ колоний на 8 10 й день культивирования. Проведенный иммуногисто химический анализ выявил различие в экспрессии клетка ми эндотелиальных маркеров в зависимости от используе мого фидера. Уровень экспрессии CD31 и vWF и сложность сетчатых структур были выше в клетках, растущих на фидере из OP9hoxB4, чем на 0Р9. Более того, на 9 й день кокуль тивирования поздний эндотелиальный маркер CD105 об наруживался только в клетках, подвергавшихся влиянию Н0ХВ4 (рис. 3).
Под действием Н0ХВ4 наблюдалась активная миграция сосудистоподобных структур за границу колонии, что под тверждается иммуногистохимическим анализом (рис. 4) Подобной миграции в колониях, растущих на 0Р9, на том же сроке дифференцировки (10 дней) мы не наблюдали.
Таким образом, наши данные позволяют утверждать, что секретируемый фидерными клетками транскрипционный фактор Н0ХВ4, слитый с TAT белком, оказывает влияние на скорость и степень дифференцировки ЭСК человека по эн дотелиальному пути. Механизмы подобного стимулирующего действия, а также увеличивает ли Н0ХВ4 число эндотели альных предшественников при дифференцировке ЭСК чело века, остается пока неизвестным. Следует также отметить, что в данной работе мы сконцентрировали усилия на изуче нии эндотелиальной дифференцировки ЭСК человека и ис пользовали среды, которые не способствуют дифферен цировке ЭСК по пути гематопоэза. Например, в средах отсутствовали интерлейкин 3 и GM CSF, обязательные для гематопоэтических дифференцировок. Вопрос о том, влия ет ли Н0ХВ4 на увеличение популяции гемангиобластов в дифференцирующихся ЭСК и/или на сдвиг дифференци ровки гемангиобласта в сторону кроветворных или эндоте лиальных предшественников, остается открытым.
Мы не можем исключить возможности не прямого, а опосредованного воздействия Н0ХВ4 на дифференциров ку ЭСК человека в эндотелий. Существует вероятность, что Н0ХВ4 оказывает влияние на саму линию 0Р9, а она, в свою очередь, секретирует в среду факторы, стимулирующие диф ференцировку ЭСК. Создание контрольной линии 0Р9, трансфицированной плазмидой, содержащей Н0ХВ4 без TAT элемента, который бы не секретировался во внешнюю среду, позволит в будущем прояснить этот вопрос.
CD 31 vWF CD 105
Рис. 3. Иммуногистохимический анализ ЭСК после 10 дней кокультивирования с 0Р9 и ОР9ІіохВ4.
Экспрессия эндотелиальных маркеров 0031 [красный), vWF[кpacный]1 С0105 [зеленый], ядра окрашены ОАРІ [синий].
Вторичные антитела АІеха РІиог 546 [красный] и АІеха РІиог 488 [зеленый]
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 1, 2007
■■■ ■ I I I I I I I -ф- I ■ ■ ТП
Рис. 4. Распространение сосудистоподобных структур за границу колонии на фидере из ОР9ЬохВ4 на 10 день культивирования. Стрелка и пунктирная линия указывают на границу колонии:
А - Экспрессия эндотелиального маркера СОЭ1 [красный), ядра окрашены ОАРІ [синий]. Вторичные антитела АІеха РІиог 546;
В - фотография той же колонии в светлом поле
Благодарности:
Мы благодарим проф. А.Л. Медвинского и доктора Хи рофуми Ину за предоставление клеточной линии ОР9ИохВ4. Благодарим проф. А.Л. Медвинского за то, что он поделился с нами своими предварительными наблюдениями о влиянии
Н0ХВ4 на эндотелиальную дифференцировку в АвМ эмб рионов мыши.
Работа финансировалась из грантов РФФИ 05 04 49310 а ипрограммы «Молекулярная и клеточная биоло гия» Президиума РАН.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Choi К., Kennedy М., Kazarov A. et al. A common precursor for hematopoietic and endothelial cells. Development 1998; 125(4): 725 32.
2. Chung Y.S., Zhang W.J., Arentson E. et al. Lineage analysis of the hemangioblast as defined by FLK1 and SCL expression. Development 2002; 129(23): 5511 20.
3. Nishikawa S.I., Nishikawa S., Hirashima M. et al. Progressive lineage analysis by cell sorting and culture identifies FLK1 ~VEcadherin~ cells at a diverging point of endothelial and hemopoietic lineages. Development 1998; 125(9): 1747 57.
4. Huber T.L., Kouskoff V., Fehling H.J. et al. Haemangioblast commitment is initiated in the primitive streak of the mouse embryo. Nature 2004; 432(7017): 625 30.
5. Fujimoto T., Ogawa М., Minegishi N. et al. Step wise divergence of primitive and definitive haematopoietic and endothelial cell lineages during embryonic stem cell differentiation. Genes Cells 2001; 6: 1113 27.
6. Morgan R., Pettengell R., Sohal J. The double life of H0XB4. FEBS Lett. 2004; 578(1 2): 1 4.
7. Antonchuk J., Sauvageau G., Humphries R.K. H0XB4 induced expansion of adult hematopoietic stem cells ex vivo. Cell 2002; 109(1): 39 45.
8. Vodyanik MA, Bork J.A, Thomson J.A., Slukvin l.l. Human embryonic stem cell derived CD341 cells: efficient production in the coculture with 0P9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood 2005; 105(2): 617 26.
9. Sauvageau G., Thorsteinsdottir U., Eaves C.J. et al. Overexpression of
H0XB4 in hematopoietic cells causes the selective expansion of more primitive populations in vitro and in vivo. Genes Dev. 1995; 9(14): 1753 65.
10. Brun A.C., Bjornsson J.M., Magnusson M. et al. H0XB4 deficient mice undergo normal hematopoietic development but exhibit a mild proliferation defect in hematopoietic stem cells. Blood 2004; 103: 4126 33.
11. Wang L., Menendez P., Shojaei F. et al., Generation of hematopoietic repopulating cells from human embryonic stem cells independent of ectopic H0XB4 expression. J. Exp. Med. 2005; 201(10): 1603 14.
12. Bowles K.M., Vallier L., Smith J.R. et al., H0XB4 overexpression promotes hematopoietic development by human embryonic stem cells. Stem Cells 2006; 24(5): 1359 69.
13. Will E., Speidel D., Wang Z. et al. H0XB4 inhibits cell growth in a dose dependent manner and sensitizes cells towards extrinsic cues. Cell Cycle 2006; 5(1): 14 22.
14. Nakano T., Kodama H., Honjo T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science 1994; 265(5175): 1098 101.
15. Nakano T., Kodama H., Honjo T. In vitro development of primitive and definitive erythrocytes from different precursors. Science 1996; 272(5262): 722 4.
16. Hirashima M., Kataoka H., Nishikawa S. et al. Maturation of embryonic stem cells into endothelial cells in an in vitro model of vasculogenesis. Blood 1999; 93(4): 1253 63.
17.. Lagarkova M.A, Volchkov P.Y., Lyakisheva A.V. et al. Diverse epigenetic profile of novel human embryonic stem cell lines. Cell Cycle 2006; 5: 416 20.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
А
