CC BY
34
Новости клеточных технологий
клеток, по сравнению с CD33-. Кроме того, было показано, что антитела к CD33+ ингибируют приживление как лейке-мических, так и нормальных ГСК.
Эта работа ещё раз подтверждает гипотезу о возможном происхождении клеток лейкемии из нормальных ГСК через ЛСК. Исследователи выдвигают гипотезу о lin-/ CD34+/CD38-/CD33+ ГСК как сайте лейкемической трансформации при развитии ОМЛ.
Исследование меняет и некоторые представления о процессе дифференцировки ГСК. lin-/CD34+/CD38-/ CD33+ ГСК ещё не общие миелоидные предшественники, поскольку способны давать мультилинейное кроветворение и самообновляться, но и более «продвинутая» стадия дифференцировки плюрипотентных ГСК. Авторы провели первые эксперименты in vivo для функционального описания CD33+ клеток из гемопоэтических источников, показали их способность к репопуляции костного мозга и самообновлению.
В статье обсуждается вопрос о происхождении клеток острой миелоидной лейкемии. На данный момент присутствуют
две точки зрения - эти клетки происходят от коммитиро-ванного миелоидного предшественника, который приобрел способность к самообновлению, или это перерождение происходит внутри ветви миелоидной дифференцировки. По данным этого исследования, CD34+/CD38-/CD123+/ CD33УCD13+ популяция присутствует как в клетках лейкемии, так и в нормальных ГСК, а значит, существует вероятность возникновения клеток ОМЛ из этих нормальных ГСК.
Работа имеет также большое клиническое значение, поскольку именно клетки, несущие миелоидные маркеры, являются мишенями в новейших методах лечения ОМЛ. Эти способы лечения могут быть направлены на элиминацию CD33+ клеток лейкемии, не затрагивая нормальных ГСК. Однако, если нормальные ГСК тоже экспрессируют CD33, то они также являются мишенью терапии [например, с помощью антител против CD33 антигена, конъюгированных с цитотоксическим агентом), что может быть причиной длительной цитопении и недостаточной эффективности лечения [14].
ЛИТЕРАТУРА:
1. Passegue E., Jamieson C.H., Ailles L.E., Weissman I.L. Normal and leukemic hematopoiesis: are leukemias a stem cell disorder or a reacquisition of stem cell characteristics? Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100[Suppl. 1): 11842-9.
2. Warner J.K., Wang J.C., Hope K.J. et al. Concepts of human leukemic development. Oncogene 2004; 23: 7164-77.
3. Lapidot T., Sirard C., Vormoor J. et al. A cell initiating human acute myeloid leukemia after transplantation into SCID mice. Nature 1994; 367: 645-8.
4. Bonnet D., Dick J.E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat. Med. 1997; 3: 730-7.
5. Satoh C., Ogata K. Hypothesis: Myeloid-restricted hematopoietic stem cells with self-renewal capacity may be the transformation site in acute myeloid leukemia. Leuk. Res. 2005; Epub.
6. Hu M., Krause D., Greaves M. et al. Multilineage gene expression precedes commitment in the hemopoietic system. Genes Dev. 1997; 11: 774-85.
7. Orkin S.H. Priming the hematopoietic pump. Immunity 2003; 19: 633-4.
8. Sudo K., Ema H., Morita Y., Nakauchi H. Age-associated characteristics of murine hematopoietic stem cells. J. Exp. Med. 2000; 192: 1273-80.
9. Takano H., Ema H., Sudo K., Nakauchi H. Asymmetric division and lineage commitment at the level of hematopoietic stem cells: inference from differentiation in daughter cell and granddaughter cell pairs. J. Exp. Med. 2004; 199: 295-302.
10. Muller-Sieburg C.E., Cho R.H., Karlsson L. et al. Myeloid-biased hematopoietic stem cells have extensive self-renewal capacity but generate diminished lymphoid progeny with impaired IL-7 responsiveness. Blood 2004; 103: 4111-8.
11. Rossi D.J., Bryder D., Zahn J.M. et al. Cell intrinsic alterations underlie hematopoietic stem cell aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005; 102: 9194-9.
12. Bell D.R., Van Zant G. Stem cells, aging, and cancer: inevitabilities and outcomes. Oncogene 2004; 23: 7290-6.
13. Larochelle A., Vormoor J., Hanenberg H. et al. Identification of primitive human hematopoietic cells capable of repopulating NOD/SCID mouse bone marrow: implications for gene therapy. Nat. Med. 1996; 2: 1329-37.
14. Sievers E.L., Larson R.A., Stadtmauer E.A. et al. Efficacy and safety of gemtuzumab ozogamicin in patients with CD33-positive acute myeloid leukemia in first relapse. J. Clin. Oncol. 2001; 19: 3244-54.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам Blood, prepublished online; DOI 10.1182/blood-2005-03-1072
Новые данные в изучении генетических механизмов поддержания «стволовости» в эмбриональных стволовых клетках человека
Эмбриональное развитие у млекопитающих подразумевает дифференцировку более 200 специфических типов клеток из одной плюрипотентной эмбриональной стволовой клетки [ЭСК). Понимание процесса регуляции экспрессии генов в этих клетках необходимо для выяснения механизмов раннего развития и для их возможного терапевтического использования. Важнейшей характеристикой ЭСК является способность к самообновлению или поддержанию так называемой «стволовости» [stemness), обусловливающей их иммортальность с сохранением потенциала к плюрипотен-тной дифференцировке.
В последние годы было установлено, что способность ЭСК человека и мыши к самообновлению объясняется
взаимодействием таких факторов транскрипции, как Oct3/4 (Octamer-binding transcription factor4), SOX2 и NANOG [1-4]. Эти белки играют ключевую роль в раннем эмбриональном развитии, так как они необходимы для воспроизводства недифференцированных эмбриональных клеток [2, 4]. Нарушение экспрессии основных регуляторов раннего эмбрионального развития - Oct3/4 и NANOG [5] ведет к эктопической дифференцировке клеток внутренней массы бластоцисты в трофоэктодерму, а также к формированию энтодермы вне эмбриона. Во взрослом организме экспрессия Oct3/4 установлена в опухолевых клетках в процессе канцерогенеза. Во всех нормальных зрелых соматических клетках человека этот
Новости клеточных технологий
фактор не экспрессируется, за исключением некоторых стволовых популяций.
Ген NANOG был изолирован сотрудником эдинбургского университета, доктором Ian Chambers и получил название по имени страны вечной юности Тир Нан Ог из кельтской мифологии. Nanog кодирует белок, непосредственно связывающийся с определёнными участками молекулы ДНК в ЭСК, регулируя активность некоторых генов, тем самым влияя на ход развития клетки. В эмбрионе человека активность Nanog, вероятно, играет особенно важную роль приблизительно на 4-5 сутки развития, когда «всё возможно, но ничего ещё не решено», то есть, на стадии, после которой последующие поколения клеток уже специализированы.
Схема взаимодействия факторов NANOG, Oct3/4 и Stat3 в предимплантационном эмбрионе и в ЭСК представлена на рисунке [6].
Схема взаимодействия факторов NANOG, Oct3/4 и Stat3 в предимплантационном эмбрионе и в ЭСК
В недавнем исследовании, выполненном в Massachusetts Institute of Technology и Harvard University, опубликованном в журнале Cell было показано, что Oct3/4, SOX2 и NANOG взаимодействуют между собой. Они регулируют экспрессию других транскрипционных факторов, связываясь с определёнными генами. Взаимодействие всех факторов в этой единой «генетической сети» посредством авторегуляции и положительной обратной связи поддерживает плюрипотент-ность и самообновление ЭСК человека.
Идентифицированы новые гены-мишени для Oct3/4, SOX2 и NANOG. Оказалось, что эти белки одновременно взаимодействуют с некоторыми генами. Все три фактора конкурируют при связывании с промоторами некоторых генов, большинство из которых кодируют так называемые гомео-доменные белки, необходимые для самой ранней дифференциации тканей и органов. Было выявлено 353 человеческих гена, которые одновременно могут связывать все три фактора. Их сайты связывания находятся в непосредственной близости, что указывает на взаимодействие этих факторов при совместной регуляции транскрипции некоторых генов.
Исследователи выяснили транскрипционную активность генов, с промоторами которых взаимодействуют Oct3/4, SOX2 и NANOG в линиях ЭСК. Среди активируемых - несколько транскрипционных факторов (Oct3/4, SOX2, NANOG, STAT3, ZIC3), компоненты сигнальных путей TGF-beta и Wnt [7]. Все эти белки и сигнальные пути играют важную роль для поддержания плюрипотентности и самообновления ЭСК, что было показано в ряде предшествующих работ [1 -7].
Среди инактивируемых этими факторами генов большинство были транскрипционные факторы, вовлеченные в процессы развития и дифференцировки трофоэктодермы, энтодермы, мезодермы и эктодермы. Для подтверждения роли дифференциально экспрессирующихся генов был проведен эксперимент по сравнению их экспрессии в ЭСК и в клеточных линиях самой ранней дифференцировки. Этот эксперимент позволил выявить гены, предпочтительно экспрессирующиеся в ЭСК [DPPA4, TDGF1, Oct3/4, NANOG и LEFTY2). Все они задействованы в поддержании плюрипотентности [2, 3]. Также были выявлены гены, раньше всего экспрессирующиеся в развивающихся и дифференцирующихся клетках - гены, регулирующие раннее образование тканей и органов.
Авторы сделали вывод, что факторы Oct3/4, SOX2 и NANOG поддерживают «стволовость» через активацию генов, участвующих в процессе деления эмбриональных стволовых клеток, и инактивацию генов, запускающих процессы развития и дифференцировки. Все предшествующие работы лишь предполагали эти механизмы, либо показывали их для каждого фактора в отдельности. В эмбриональном развитии транскрипция этих факторов уменьшается, что приводит к возрастанию экспрессии генов, необходимых для дифференцировки, и уменьшению уровня транскрипции генов, поддерживающих плюрипотентность клеток.
Таким образом, исследователи выявили гены-мишени для ранее описанных факторов самообновления ЭСК, показали возможные схемы поддержания их экспрессии посредством авторегуляции и обратных связей. Также была предложена модель взаимодействия этих генов в ЭСК и раскрыта ключевая роль исследуемых факторов транскрипции.
Эти данные позволят создать экспериментальные системы с искусственным подавлением или индукцией процессов дифференцировки, продлвая или сокращая фазу плюри-потентности клетки. Ранее уже предпринимались попытки влиять на «стволовость» предшественников клеток различных типов тканей. В основном, это делалось посредством оверэкспрессии фактора NOTCH, который поддерживает плюрипотентность [8, 9]. Более того, недавно описан белок -GCNF [germ cell nuclear factor), репрессирующий фактор Oct3/4, тем самым влияя на плюрипотентность и активизируя гены дифференцировки [10]. Теперь, принимая во внимание описанные в статье генные взаимодействия 3 важнейших факторов Oct3/4, SOX2 и NANOG, можно поддерживать «стволовость» или запускать дифференцировку клеток, влияя на экспрессию этих генов. В дальнейшем исследование генов-мишеней этих факторов позволит выделить из них группы разной функциональости и тканевой дифференцировки. Продолжение работ в области идентификации генов ранней тканевой дифференцировки и специализации будет иметь значение не только в эмбриологии и клеточной биологии, но и послужит новым «деликатным инструментом» в клеточной трансплантологии.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Pera M.F., Trounson A.O. Human embryonic stem cells: prospects for development. Development 2004; 131: 5515-25.
2. Scholer H.R., Balling R., Hatzopoulos A.K. et al., Octamer binding proteins confer transcriptional activity in early mouse embryogenesis. EMBO J. 1989; 8: 2551-7.
3. Wood H.B., Episkopou V. Comparative expression of the mouse Sox1, Sox2 and Sox3 genes from pre-gastrulation to early somite stages. Mech. Dev. 1999; 86: 197-201.
4. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al., Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.
Новости клеточных технологий
5. Chambers I., Colby D., Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003; 113: 643-55.
6. Mitsui K., Tokuzawa Y., Itoh H. et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell 2003; 113: 631 -42.
7. James D., Levine A.J., Besser D., Hemmati-Brivanlou A. TGFbeta/activin/ nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells. Development 2005; 132: 1273-В2.
8. Dezawa M., Hoshino M., Ide C. Treatment of neurodegenerative diseases using adult bone marrow stromal cell-derived neurons. Expert. Opin. Biol. Ther. 2005; 5: 427-35.
9. Dezawa M., Ishikawa H., Itokazu Y. et al., Bone marrow stromal cells generate muscle cells and repair muscle degeneration. Science 2005; 309: 314-7.
10. Gu P., LeMenuet D., Chung A.C. et al. Orphan nuclear receptor GCNF is required for the repression of pluripotency genes during retinoic acid-induced embryonic stem cell differentiation. Mol. Cell. Biol. 2005; 25: 8507-19.
Подготовила T.B. Лопатина По материалам Cell 2005; 122: 947-956
Новые данные в изучении механизма миграции и хоуминга клеток по оси SDF-1 - CXCR4
Миграция стволовых клеток в костный мозг и другие органы через стенку сосуда - это сложный процесс, наиболее интенсивно протекающий при репарации места повреждения и при воспалении. Как известно, миграционная способность клеток обусловлена биохимическими сигналами, распознаваемыми системой рецепции клетки и её способностью к хемотаксису. Этот процесс протекает с участием ряда сигнальных молекул [SDF-1, SCF, LFA-1, VLA-4/5 и CD44) и заканчивается «заякориванием» клетки в своей нише. В настоящее время самым изученным фактором хоуминга стволовых и прогениторных клеток является рецептор - лигандная ось - CXCR4 - SDF-1 [stromal-derived factor-1).
Хемокин SDF-1 обладает большим спектром функций как в пре-, так и в постнатальном развитии. Эндотелиальные предшественники, остеобласты и другие клетки стромы костного мозга [КМ) экспрессируют и секретируют SDF-1 [9]. Этому фактору приписывается роль хемоаттрактанта в процессе ангиогенеза для эндотелиальных предшественников, а также для хоуминга гемопоэтических клеток в естественную нишу. Правильное взаимодействие SDF-1 с его рецептором важно при развитии нервной, кровеносной и сердечно-сосудистой систем в онтогенезе, а во взрослом организме регулирует подвижность и дифференцировку эндотелиальных предшественников и гемопоэтических стволовых клеток [ГСК) [3-6]. Считается, что этот белок осуществляет мобилизацию клеток из костного мозга [10]. В работе Yamaguchi J. показано привлечение эндотелиальных предшественников под воздействием SDF-1 в ишемизированный участок ткани [1]. Также было зафиксировано повышение уровня SDF-1 в кровотоке в течение нескольких дней после экспериментального инфаркта миокарда [2]. В последнее время SDF-1 активно изучается как фактор хоуминга и миграции не только стволовых и прогени-торных клеток [4-7,10], но и раковых клеток в процессе мета-стазирования [7, 8].
В недавней работе, опубликованной в журнале Nature Immunology, израильские ученые подробно описали механизм переноса SDF-1 через границу «кровь - костный мозг». CXCR4-рецептор экспрессируется на эндотелии и стро-мальных клетках КМ, он имеет уникальную функцию захвата SDF-1 из крови, вызывая его транслокацию [перемещение) в КМ. Однако механизмы захвата SDF-1 и его транслокации в КМ практически не изучены. Авторы предположили, что CXCR4 эндотелиальных клеток в КМ действует как интерцептор в селективном барьере «кровь - костный мозг» и регулирует количество SDF-1 в КМ.
Ученые обнаружили, что CXCR4 на эндотелии обуславливает перенос циркулирующего SDF-1 в костный мозг, что значительно повышает хоуминг человеческих CD34+ клеток в свою естественную нишу. В работе впервые приводятся результаты по иммуноцитохимической идентификации SDF-1 и его рецептора в КМ [синусоиды, эндост). Коэксп-рессия SDF и CXCR4 на эндотелии указывает на существование аутокринной петли регуляции экспрессии CXCR4.
Способность SDF-1 преодолевать эндотелиальный барьер была исследована путем введения биотинилированного фактора в кровь SCID-мышей. Его присутствие и количество измеряли в КМ в разные промежутки времени после введения. Содержание как интактной, так и расщепленной формы SDF-1 в кровотоке со временем уменьшалось, и происходило накопление фактора в КМ. Для выявления роли CXCR4 исследователи заблокировали его моноклональными антителами, что привело к значительному снижению содержания SDF-1 в КМ. Авторы заключают, что транспорт SDF-1 не происходит путем пассивной диффузии через плотные контакты между эндотелиальными клетками, это рецептор-зависимый процесс клеточного переноса.
Затем ученые показали, что SDF-1 захватывается и переносится именно эндотелиальными клетками. Этот процесс идет с участием вторичных мессенджеров - так называемых G-белков. Методом конфокальной микроскопии были выявлены участки локализации в микрососудах и микроструктура пузырьков с SDF-1. В опытах in vitro эндотелиальные клетки также секретировал SDF-1 в среду культивирования, причём фактор действовал как хемоаттрактант для пре-В [лейкемических) и CD34+ клеток в системе Transwell [стандартный тест на миграцию).
Наконец, функция транспортированного SDF-1 была исследована in vivo. Мышам после введения фактора пересадили человеческие CD34+ клетки и фиксировали их присутствие в КМ и селезенке животных. Введение SDF-1 перед трансплантацией ГСК значительно усиливало их хоу-минг в костном мозге и селезёнке.
Таким образом, результаты работы приближают нас к полному пониманию процессов хоуминга ГСК, опосредованного взаимодействием SDF-1/CXCR4. Возможная схема последовательных событий включает: захват свободного активного SDF-1 эндотелиальными клетками за счёт связывания с CXCR4 на его поверхности, перенос всего комплекса через эндотелиальную клетку, распад комплекса, попадание освобожденного SDF-1 в строму КМ. При этом
