CC BY
32
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
повторной сортировке на основе экспрессии обоих трансге нов. Таким путем исследователям удалось вывести 2 спер матогониальных линии БЭС? и 88С12.
Клетки были способны формировать эмбриоидные тельца и экспрессировали белки, характерные для сперматогониев. Для определения функциональной активности полученных кле точных линий их пересаживали в семенник мышам (второй служил в качестве контрольного), которым предварительно была проведена абляция половых клеток. У 2 из 10 проана лизированных животных в просвете семенного канальца, а также в его стенке, были обнаружены картины нормального сперматогенеза. Однако подвижность полученных клеток была значительно снижена по сравнению с положительным контролем. Происхождение постмейотических клеток в про свете канальца подтверждалось активной флуоресценцией трансгенных белков. У пяти мышей было зафиксировано об разование тератом после трансплантации.
Внутрицитоплазматическая инъекция клеток получен ных линий в неоплодотворенный овоцит мышей дикого типа приводила к последующему выбросу полярного тельца и формированию пронуклеусов. Двухклеточные эмбрионы, полученные таким образом, имплантировали в яйцевод псевдо беременной самки. Из 65 перенесенных эмбрио нов родилось 12 мышат. По сравнению с мышатами дикого
типа, мышата, полученные искусственным путем, были либо меньше, либо больше по размеру и погибали в течение 5 месяцев. Клетки, несущие трансген, были обнаружены в се менниках некоторых из потомков.
Несмотря на низкую эффективность переноса, рожде ние слабых и дефектных детенышей, образование тератом после трансплантации клеток, авторы впервые продемонст рировали возможность рождения потомства, полученного после оплодотворения in vitro «искусственно» полученными гаметами из ЭСК. Таким образом исследователи доказали, что мужские гаметы, полученные из ЭСК, полностью функ циональны. При усовершенствовании методики получения половых клеток из ЭСК и увеличении эффективности опло дотворения и рождения здоровых детенышей, откроются новые перспективы использования данной технологии в биологии и медицине. Прежде всего, разработанная систе ма может служить прекрасной моделью изучения диффе ренцировки гамет. Возможность выделения гамет из ЭСК может решить проблему некоторых форм бесплодия. Кроме того, выделение функциональных мужских и женских гамет из одной линии ЭСК позволит полностью автономно поддер живать и обновлять эту линию через создание новых блас тоцист. Тем не менее, развитие таких технологий одновременно порождает и ряд этических вопросов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Лопатина T.B. Искусственный гаметогенез: дифференцировка эмбриональных стволовых клеток в гаметы. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 2: 32 4.
2. Hubner К., Fuhrmann G., Christenson L.K. et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 2003; 300(5623): 1251 6.
3. Toyooka Y., Tsunekawa N., Akasu R., Noce T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100(20): 1 1457 62.
4. Lacham Kaplan 0., Chy H., Trounson A. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem (ES) cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 2006; 24(2): 266 73.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам Dev. Cell 2006;11(1 ):125-32
Nanog фактор репрограммирования ядра взрослой соматической клетки
Изучение и развитие технологии переноса ядра взрослой соматической клетки млекопитающих в энуклеированный овоцит позволило заключить, что генетические и эпигене тические изменения, приобретаемые клеткой в процессе дифференцировки, могут быть полностью «репрограмми рованы». При этом происходит активация «эмбриональных» генов и ингибирование генов, отвечающих за дифференци ровку. Оказалось, что репрограммирование взрослого ядра может быть также достигнуто и слиянием с эмбриональной стволовой клеткой (ЭСК) (2, 3]. Таким образом, взрослая со матическая клетка может вернуться в эмбриональное плю рипотентное состояние и дать начало новому эмбриону.
Остаётся загадкой, какие именно факторы, содержащиеся в овоците и в ЭСК, могут обусловливать феномен генетичес кого и эпигенетического репрограммирования «взрослого» ядра? Группа Austin Smith показала, что одним из таких фак торов является ген Nanog. Результаты работы опубликованы в недавнем номере журнала Nature.
Ген Nanog был изолирован и описан Ian Chambers из Эдинбургского университета (4). Он получил такое название по имени страны вечной юности Тир Нан Ог из кельтской мифологии. При взаимодействии с двумя другими важней шими факторами Oct3/4, и SOX 2, Nanog поддерживает «стволовость» через активацию генов, участвующих в про
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
цессе деления ЭСК, и инактивацию генов, запускающих процессы развития и дифференцировки (5).
Для проверки гипотезы значения Nanog для репрограм мирования ядра и приобретения клеткой свойств плюрипотен тности исследователи создавали гибриды нейральных ство ловых клеток (НСК) с ЭСК, оверэкспрессирующих ген Nanog (ЭСК N), сливая их in vitro. Причём избыточная экспрессия трансгена с Nanog в ЭСК не влияла на частоту слияния. Такой вариант слияния приводил к формированию гибридных коло ний, имеющих характеристики ЭСК. Оказалось, что частота формирования колоний была в 200 раз выше, чем в обычных НСК ЭСК гибридах и сравнима с таковой при слиянии ЭСК ЭСК. Клетки таких колоний теряли экспрессию генов НСК и не росли в «нейрональной» селективной среде. Колонии демон стрировали признаки репрограммирования НСК ядра и плю рипотентности экспрессию типичных для ЭСК генов, потерю ядерного маркёра НСК, спонтанную дифференцировку эмб риоидных телец в сокращающиеся миоциты и т.д. Слияние НСК (НСК N), избыточно продуцирующих Nanog, с обычными ЭСК приводило к возникновению эмбриональных колоний в 8 раз чаще, чем в контрольных слияниях НСК ЭСК.
Гиперэкспрессия Nanog в трансгенных ЭСК приводила так же к значительному увеличению выхода колоний при их слия нии с эмбриональными фибробластами и тимоцитами. Таким
А
■ И I II II
■ I I I
Новости клеточных технологий
образом, только избыточная экспрессия гена Nanog обуслов ливала появление ЭСК подобных колоний и репрограммиро вание ядер взрослых клеток. Исследователи заключают, что Nanog играет значительную и, возможно, доминирующую роль в репрограммировании ядра взрослой соматической клетки до эмбриональной «стадии плюрипотентности».
Таким образом, авторы впервые чётко определили фак тор репрограммирования «взрослого клеточного ядра». Даль нейшая идентификация таких факторов и умение управлять ими может привести к развитию технологии создания соб ственных ЭСК подобных клеточных линий без использования эмбрионов, яйцеклеток и технологии переноса ядра.
Ясно, что Nanog не единственный «игрок в поле», но, возможно, основной. Уже известно, что плюрипотентное
состояние ЭСК поддерживается взаимодействием основ ных факторов Oct3/4, Nanog, Sox2 и, возможно, рядом дополнительных [5]. Так Yamanaka Shinya из Kyoto University месяц назад доложил о возможности репрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов до ЭСК подобного состояния введением комбинации факторов, включающих Sox2 и Oct3/4 [6]. Возможным механизмом репрограмми рования и плюрипотентности также могут являться белки (Wnt 3) и молекулы мРНК транскрипционных факторов (Oct 4, Rex 1, Nanog, SCL и GATA 2,4), содержащиеся в цитоплазме ЭСК или в мембранных везикулах и поддержива ющих «стволовость» (7). Будущие работы будут направлены на более тщательное изучение этих факторов в человечес ких клетках.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Rideout W.M. 3rd, Eggan К., Jaenisch R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science 2001; 293: 1093 8.
2. Tada М., Takahama Y., Abe K. et al. Nuclear reprogramming of somatic cells by in vitro hybridization with ES cells. Curr. Biol. 2001; 11: 1553 8.
3. Cowan C.A, Atienza J, Melton DA., Eggan K. Nuclear reprogramming of somatic cells after fusion with human embryonic stem cells. Science 2005; 309:1369 73.
4. Chambers I., Colby D, Robertson M. et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003; 113:643 55.
5. Boyer L.A., Lee T.I., Cole M.F. et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell 2005; 122(6): 947 56.
6. Shinya Y. Identification of factors that generate ES like pluripotent cells from fibroblast culture. Oral presentation at 4th ISSR Annual Meeting. June 29 July 1, 2006, Toronto, Canada.
7. Ratajczak J., Wysoczynski М., Hayek F. et al. Embryonic stem cell derived microvesicles reprogram hematopoietic progenitors: evidence for horizontal transfer of mRNA and protein delivery. Leukemia 2006; 20: 847 56.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам Nature 2006; 441(7096): 997-1001
Выделение эмбриональных стволовых клеток человека из бластомеров
Стандартный метод выделения эмбриональных стволо вых клеток человека (ЭСК) из внутренней клеточной массы бластоцисты вызывает ряд этических противоречий, свя занных с разрушением эмбрионов, несмотря на то, что этот материал утилизируется в клиниках искусственного опло дотворения. Чтобы избежать этических проблем, учёные предлагают технологию выделения линий ЭСК из единич ных бластомеров на более ранних стадиях развития чело веческого эмбриона. Так, в прошлом году группа Lanza из компании Advanced Cell Technology (Worcester, MA, USA) опубликовала работу по выделению линий ЭСК из мышиных бластомеров (1). Возможность выделения ЭСК человека из эмбрионов более ранних стадий развития (до бластоцисты) была также показана Н. Стрельченко, однако процедура со провождается разрушением эмбриона (2).
Новая технология выделение ЭСК из единичных бласто меров позиционируется как метод без разрушения эмбрио нов. Техника биопсии бластомера без разрушения эмбриона была отработана уже давно при разработке метода предим плантационной генетической диагностики (PGD) после про цедур экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). При этом было показано, что удаление одного бластомера из ранних эмбрионов (до развития стадии бластоцисты) не имеет ни какого орицательного влияния на последующее развитие зародыша и ребёнка в будущем (3). Результаты новой ра боты группы Lanza , описывающие технику выделения ЭСК из бластомеров человека, опубликованы в он лайн версии журнала Nature.
Исследователи использовали 16 эмбрионов, заморо женных на 8 10 клеточной стадиях в клиниках ЭКО. После
выделения отдельных бластомеров их помещали в среду, оптимальную для культивирования ЭСК. В течение недели исследователи наблюдали деление бластомеров и форми рование колоний ЭСК подобных клеток. Авторам удалось выделить 2 стабильные линии ЭСК. Эти линии демонст рировали все классические признаки плюрипотентности экспрессировали характерные маркёры, давали терато мы в SCID мышах, дифференцировались спонтанно или ин дуцированно в клетки всех 3 х зародышевых листков как in vitro, так и in vivo. Кроме того, эти линии по своим характе ристикам были практически неотличимы от стандартных зарегистрированных линий ЭСК, выделенных из бласто цист, и даже демонстрировали более выраженные признаки плюрипотентности.
Таким образом, авторы работы показали принципиальную возможность выделения стабильных линий ЭСК человека из единичных бластомеров, полученных из 8 10 клеточных эмбрионов, без их разрушения. Исследователи усовершен ствовали технику культивирования бластомеров и индукцию развития из них ЭСК. Более ранние попытки получения ЭСК из бластомеров человека оказывались нереализованными (4, 5].
Несмотря на красивую демонстрацию идеи «выделения ЭСК человека без разрушения эмбрионов», технология не найдёт широкого применения в будущем. Поскольку, как от мечает сам Lanza, она может применяться только у клиентов клиник ЭКО, проходящих процедуру PGD. Однако число та ких женщин и семейных пар крайне невелико, и гарантиро вать женщине донору яйцеклеток получение собственной линии ЭСК будущего ребёнка можно только при совершенной
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия № 4 (6), 2006
