CC BY
86
© ЕРЕМЕЕВ А.В., СВЕТЛАКОВ А.В., БОЛЬШАКОВ И.Н., ШЕИНА Ю.И.
НЕЙРОНАЛЬНАЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКА ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА НА МОДИФИЦИРОВАННЫХ КОЛЛАГЕН-
ХИТОЗАНОВЫХ МАТРИЦАХ
А.В. Еремеев, А.В. Светлаков, И.Н.Большаков, Ю.И. Шеина
Красноярский государственный медицинский университет им. проф. В.Ф.
Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П.Артюхов; кафедра оперативной
хирургии с топографической анатомией, зав. - д.м.н., проф. П.А.Самотесов; лаборатория клеточных технологий КрасГМУ, руководитель - к.б.н. А.В.
Еремеев; Центр репродуктивной медицины, руководитель - к.м.н.
А. В. Светлаков; Институт общей генетики им. Вавилова РАН, Москва, лаборатория генетических основ клеточных технологий, руководитель -
С.Л. Киселев.
Резюме. В представленной работе рассматривается возможность культивирования стволовых эмбриональных клеток человека на искусственно полученных матрицах на основе коллаген-хитозановых биополимеров для получения в эксперименте нейрональных клеток.
Ключевые слова: плюрипотентные клетки, маркеры плюрипотентности, нейрональная дифференцировка, коллаген-хитозановый комплекс, трансплантация.
Еремеев Артем Валерьевич - к.б.н., руководитель лаборатории клеточных технологий КрасГМУ; e-mail: art-eremeev@yandex.ru, тел. 8 (391)2640892.
Светлаков Анатолий Владимирович - к.м.н., руководитель Центра репродуктивной медицины, Красноярск; e-mail: krasivf@kcrm.ru.
Большаков Игорь Николаевич - д.м.н., проф. каф. оперативной хирургии с PDF created with pdfFactory Pro trial version www. pdffactory. com
топографической анатомии КрасГМУ; тел. 8(391)2200412.
В последнее время в большинстве стран мира уже наметилась тенденция к переходу от фундаментальных исследований в области плюрипотентных клеток, в частности эмбриональных стволовых (ЭСК), к фазе клинических испытаний этих клеток и их дифференцированных производных, поскольку только эмбриональные стволовые клетки обладают свойством самовозобновления в течение длительного периода времени, а также способностью к дифференцировке в производные всех трех зародышевых листков организма (плюрипотентность) в условиях in vitro и in vivo, что имеет существенное практическое значение для будущего медицины в области клеточной терапии и трансплантологии.
Растущие потребности в клеточных технологиях диктуются возрастающим уровнем различных патологий в том числе центральной нервной системы (ЦНС) и недостатком материала для трансплантации. Поэтому актуально создание технологии получения дифференцированного клеточного материала на основе ЭСК человека на биосовместимых конструкциях.
Компания Genvec Inc (USA) и медицинский центр Harvard Medical School (2005) провели успешные трансплантации нейронов, полученных из тератокарциномы человека Lyaton Bioscience. Было показано, что такие нейроны выживают более 2-х лет после трансплантации пациентам после инсульта без признаков малигнизации. Рядом клиник и лабораторий проводятся испытания трансплантации мезенхимальных клеток при патологиях ЦНС (инсульт, болезнь Паркинсона, повреждения спинного мозга) [5,8]. Несмотря на то, что в большинстве случаев исследователи обнаруживают улучшение состояния, способность к прямой дифференцировке клеток мезенхимального ряда in vivo в нейроны не доказана.
Одно из возможных негативных последствий при имплантации ЭСК в организм - это формирование тератом, что показано на иммунодефицитных (безтимусных) мышах. В этой связи наиболее вероятным использованием этих клеток в медицине представляется в виде их дифференцированных производных.
Так, в работе Анисимова и научной группы Павловой (II Съезд по клеточной биологии, г. С-Петербург, 2007) было показано, что использование трехмерных матриц с культивируемыми на них ЭСК позволяет дифференцировать последние в нейрональные клетки при подсадке в головной мозг и при этом не образуются тератомы. Однако дифференцировка ЭСК в нейрональные клетки на матрицах идет с предварительным культивированием их в специальной среде с последующим переносом этих клеток на матрицу, что усложняет работу и увеличивает риск контаминации.
В настоящий момент используют тканеинженерные конструкции для восстановления ЦНС и периферической НС. Так, Брюховецкий с соавт.[1] использовали гелеобразный полимерный матрикс для доставки СК в зону повреждения при спинальной травме. В работах McDonald с соавт. [10] и Wichterle [12] была показана дифференцировка ЭСК в олигодендроциты с последующей миелинизацией у крыс со спинальной травмой. Была показана миграция клеток на 1 см от области повреждения. Применение олигодендроцитов в лечении спинальной травмы было показано в экспериментах на крысах [6]. Было установлено, что олигодендроциты, полученные из ЭСК, восстанавливали двигательную активность только в первые дни после повреждения. Отсутствие положительного эффекта наблюдали при попытке лечения старой травмы.
В России А.С. Брюховецкий [1,2], работая с фетальными тканями, продемонстрировал возможность роста аксона с прорастанием через глиальный рубец при трансплантации клеток в область травмы спинного мозга. Трехмерные конструкции из биополимеров способствуют созданию трансплантата с приближенными по свойствам к биологическим тканям. В
частности, были получены трубки из коллагена или ПГА с гелем коллагена внутри и имплантированными нервными и швановскими клетками [12]. Использование лиофилизированного геля коллагена 1 типа и хондроитин сульфата в качестве трехмерной матрицы для инжиниринга ткани легких было описано в 2005 году [9].
Известно, что микроокружение контролирует дифференцировку ЭСК в прогениторные клетки [7]. Миграция и пролиферация прогениторных клеток -основные события, происходящие при развитии органа и регенерации после повреждения [11]. Дифференцировка в культуре ЭСК в нейрональные клетки стимулируется ретиноевой кислотой (0.5 мкМ), сопровождаясь увеличением экспрессии гена Wnt1. Характерными маркерами нейрональных стволовых клеток, полученных из ЭСК индукцией ретиноевой кислотой, являются нестин, виментин, pax6, позже появляется экспрессия маркера MAP2 [8]. Методом SAGE (серийный анализ экспрессии генов) выявлено, что первыми начинают экспрессироваться гены молекул адгезии (например, к ламинину, полилизину) и внеклеточного матрикса. Добавление ретиноевой кислоты и В27 (neurobasal supplement) увеличивало выход нейронов.
Таким образом, просматривается перспектива создания матрицы не только для трансплантации, но и для дифференцировки и миграции плюрипотентных клеток. Целесообразно получить такую матрицу, при нанесении на которую эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) могли бы дифференцироваться в нейрональном направлении, и данная конструкция была бы пригодна для трансплантации. Наличие такого сочетания очень важно особенно для срочных трансплантаций, когда необходимо быстро восстановить утраченную нервную ткань и обеспечить качественную регенерацию.
В настоящее время все большее внимание уделяется биосовместимым матрицам с управляемой биодеградацией. В нашем случае, на основе ранее сделанных изобретений, в состав разрабатываемых матриц включаются полисахаридные полимеры природного происхождения. Уникальность биополимеров полисахаридной природы состоит в высокой их
биосовместимости с тканями человека. Предварительные исследования показали, что коллаген-хитозановый комплекс в виде губки способен выполнять роль матрицы для клеток. Культивирование эмбриональных клеток мыши на коллаген-хитозановых губках выявило активную пролиферацию фибробластов, высокий уровень синтеза ДНК и РНК. Включение в состав коллаген-хитозанового геля гепарина и сывороточного фактора роста крупного рогатого скота ("адгелон") повысило функциональную активность клеток. Мы предположили, что культивирование на коллаген-хитозановых матрицах ЭСК человека в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками мыши среде или при добавлении в среду добавки N2 может приводить к нейрональной дифференцировке.
Материалы и методы
Коллаген-хитозановые матрицы. Предварительно подготовленная коллаген-хитозановая конструкция «Коллахит-бол», состоит из 2% раствора ацетата коллагена, 2% раствора аскорбата хитозана молекулярной массы 100-700 кБа со степенью дезацетилирования свыше 95%, содержащего в своем составе на 1 г сухого хитозана аскорбиновую кислоту - 1,8 г, хондроитинсерную кислоту -5-100 мг, Б-глюкуроновую кислоту - 10-100 мг, гепарин - 2,5-5 мг и сывороточный фактор роста крупного рогатого скота «адгелон» - 11-220 мкг.
При использовании губчатых матриц «Коллахит-Бол»» [4] последние предварительно замачивали в стерильном бикарбонатном буфере для понижения их кислотных свойств. После фазы нейтрализации покрытия промывали трижды стерильным фосфатным буфером Дульбекко, помещали во флаконы, а сверху осторожно наслаивали на них суспензию клеток в среде со всеми компонентами, в зависимости от типа клеток.
Получение среды, кондиционированной эмбриональными нейроналънъми клетками. Культуру эмбриональных нейрональных клеток получали из 7-10
дневных фетусов беспородных мышей. Культивирование клеток проводили при 37°С в среде ДМЕМ (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Sigma-Aldrich), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина (Hyclone). Среду на третьи сутки собирали, фильтровали через 0,22 мкм ацетат-целлюлозный фильтр и в дальнейшем использовали в качестве кондиционированной среды.
Эмбриональные стволовые клетки. В экспериментах по культивированию плюрипотентных клеток человека линии hESKM-05 (безфидерная animal-free линия, полученная ЦРМ г. Красноярска совместно с Институтом общей генетики РАН г. Москвы) на раневых покрытиях первоначально для наращивания биомассы использовали основную среду коДМЕМ (Invitrigen, USA) с добавлением 10% SR (Invitogen)(заменитель сыворотки), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1мМ L-глутамина (Hyclone), 4нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF) (Sigma-Aldrich), 1 мМ раствор незаменимых аминокислот (Sigma-Aldrich). Наращивание клеточной биомассы проводили во флаконах, покрытых 0.1% раствором желатина (Sigma-Aldrich). Смену среды проводили ежедневно. Состояние колоний в 100 полях зрения оценивали визуально с помощью микроскопа Olympus BX51. После пересева с помощью 0,5% раствора коллагеназы на матрицы клетки культивировали либо в кондиционированной среде, либо в среде с добавлением N2 (Invitrogen) компонента согласно инструкции производителя.
Иммуноцитохимия. Каждые трое суток проводилась формальдегидная фиксация с последующей иммуноцитохимией клеток с помощью антител (все от Abcam, USA) против GFAP - глиального фибрилярного кислого белка (маркер астроцитов), нейрофиламента и нестина. Выявление маркеров осуществляли методом согласно инструкции производителя антител. Ядра клеток окрашивали DAPI (0,1 мкг/мл) 10 мин. Для получения изображений и анализа использовали флюоресцентный микроскоп «Olympus BX-51» и программные продукты «Applied Spectral Imaging» (USA). Для анализа каждого маркера эксперимент повторяли трижды, наращивая по три флакона, в каждом
из которых случайным образом выделяли 6 зон для проведения иммуноцитохимии. Микроскопирование проводили по каждой зоне в 30 полях зрения.
Результаты и обсуждение
На сегодняшний день существуют различные протоколы получения дифференцированных дериватов нейрональных клеток из стволовых. Однако в этих протоколах для переноса клеток с культуральных флаконов используют растворы энзимов (трипсина, коллагеназы, деспазы и т.п.), что приводит к увеличению уровня апоптоза, клеточной гибели, повреждению поверхностных клеточных рецепторов [3]. Возрастает вероятность контаминации и усложняется процедура трансплантации. В этой связи использование матриц для культивирования и направленной дифференцировки устраняет выше указанные проблемы. Несмотря на это, необходимость в использовании дифференцировочных факторов все же остается. Вместе с этим, использование рекомбинантных факторов роста и морфогенов при добавлении в матрицу значительно увеличивает ее стоимость, а также увеличивает вероятность иммунного ответа на чужеродный белок. Известно, что культивируемые клетки секретируют в среду различные факторы, поддерживающие пролиферативную активность или состояние дифференцировки клеток. Использование кондиционированной клетками среды в качестве добавки к матрице может помочь избежать вышеуказанных проблем и дать предпосылки для создания подложек для культивирования клеток разных типов, в том числе и стволовых. Для проверки этого предположения при культивировании на матрице ЭСК добавлялась кондиционированная эмбриональными нейрональными клетками среда, которая менялась каждые третьи сутки. Результаты показали, что добавление в культуральную среду компонента N2 или кондиционированной среды приводило к нейрональной дифференцировке ЭСК человека. Оценивалась возможность таких клеток дифференцироваться в нейрональном направлении (рис 1, а,б,в,г).
Рис.1. Фазово-контрастная микроскопия культивируемых ЭСК человека, пассированных на коллаген-хитозановых матрицах в течении 14 дней в присутствии кондиционированной среды (рис. 1а -1 день, рис.1б -14 день) или при добавлении N2 компонента (рис. 1в -1 день, 1 г -14 день)
Исследование морфологии клеток показало, что ЭСК после культивирования в вышеописанных условиях способны приобретать нейрональный фенотип. Дальнейшие исследования, доказывающие способность ЭСК дифференцироваться в данных условиях в нейрональные дериваты, были проведены с помошью иммуноцитохимии. Первоначально была исследована динамика экспрессии одного из нейрональных маркеров - нейрофиламента. Было получено, что на первые сутки в обоих случаях отсутствуют сигналы флюоресценции по указанному маркеру (рис.2).
Рис.2. Динамика экспрессии нейрофиламента на 1, 7 и 14 сутки в клетках, культивируемых на коллаген-хитозановом комплексе в присутствии кондиционированной среды (а, б, в) или при добавлении N2 комплекса (г,д,е).
На пятые сутки наблюдалось появление экспрессии нейрофиламента при культивировании ЭСК в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками среде, а на седьмой день и в клетках, культивируемых в среде с добавлением N2 компонента. Аналогичная картина наблюдалась и в случае GFAP и нестина (рис.3).
Рис.3. Иммуноцитохимия ЭСК, культивируемых в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками среде (а, б, в) или в среде с добавлением N2 компонента (г, д, е). Клетки фиксированы 1% формальдегидом в фосфатном буфере. Клетки обрабатывали антителами против нестина,
глиального фибрилярного кислого белка и нейрофиламента, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флюоресценции.
Таким образом, результаты показали как и при культивировании на матрицах в кондиционированной эмбриональными нейрональными клетками среде, так и в среде с добавлением N2 компонента ЭСК на 14-й день ЭСК экспрессируют маркеры, характерные для нейрональных клеток и приобретают их морфологию.
В результате проведенной работы была показана возможность создания условий нейрональной дифференцировки культивируемых ЭСК человека на коллаген-хитозановых конструкциях.
Работа поддержана внутривузовским грантом КрасГМУ 2008 года.
NERONAL DIFFERENTIATION OF HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS ON MODIFIED COLLAGEN-CHITOSAN MATRICES A.V. Eremeev, A.V. Svetlakov, N.I. Bol'shakov, U.I. Sheina
Krasnoyarsk State Medical University named after prof. V.F. Voyno-Yasenetsky Institute of Genetics named after Vavilov, Russian Academy of Science.
Abstract. The paper describes the possibilities to cultivate human stem cells on artificially derived matrices based on collagen-chitosan biopolymers. Key words: pluripotent cells, pluripotency markers, neuronal differentiation, collagen-chitosan complex, transplantation.
Литература
1. Брюховецкий И.С., Ушаков С.О. Клинико-патогенетическое обоснование
применения фетальных тканей человека при заболеваниях центральной нервной системы // В сб. ст. «Трансплантация фетальных тканей и клеток человека». - М., 1996. - С.53-56.
2. Брюховецкий И.С., Дюйзен И.В., Мотавин П.А. Морфохимическая характеристика спинного мозга крыс после торакальной сегментэктомии и трансплантации полимерного коллагенового матрикса «Сферогель-Э» с инкорпорированными обкладочными нейроэпителиальными клетками // Клеточная трансп.и тканевая инж. - 2008. - Т.3. - №2. - С.57-62.
3. Еремеев А.В., Светлаков А.В., Большаков И.Н., Власов А. А., Арапова В. А. Жизнеспособность и функции плюрипотентных клеток и фибробластов дермально-эпидермального слоя животных в условиях их культивирования на коллаген-хитозановых покрытиях // Сиб. мед. обозрение. - 2008. - №6(54). -С.24-27.
4. Патент РФ № 2 252 787, БИПМ №15 от 27.05 2005.
5. Brüstle O., Jones K.N., Learish R.D. et al. Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelinating transplants // - 1999. - Vol. 285(5428). - P.754-756.
6. Bryan D.J., Tang J.B., Doherty S.A. et al. Enhanced peripheral nerve regeneration through a poled bioresorbable poly(lactic-co-glycolic acid) guidance channel // J. Neural. Eng. - 2004. - Vol.1. № 2. - P.91-98.
7. Ha Y., Park H.S., Park C.W., Yoon S.H., Park S.R., Hyun D.K., Kim E.Y., Park H.C. Synthes Award for Resident Research on Spinal Cord and Spinal Column Injury: granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) prevents apoptosis and improves functional outcome in experimental spinal cord contusion injury // Clin. Neurosurg. - 2005. - Vol.52. - P.341-47.
8. Kang S.K., Lee D.H., Bae Y.C., Kim H.K., Baik S.Y., Jung J.S. Improvement of neurological deficits by intracerebral transplantation of human adipose tissue-derived stromal cells after cerebral ischemia in rats // Exp.Neurol. - 2003. - Vol.183, № 2. -P.355-366.
9. Keirstead H.S., Nistor G., Bernal G., Totoiu M., Cloutier F., Sharp K., Steward
O. Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury // J Neurosci. - 2005. -Vol.25, №19. - P.4694-4705.
10. McDonald J.W., Liu X.Z., Qu Y. Transplanted embryonic stem cells survive, diffentiate, and promote recovery in injured rat spinal cord // Nat.Med. - 1999. - Vol. 5, №12. - P.1410-1412.
11. Rakic P.Illegal immigrations // Neuron. - 2000. - Vol.27, № 3. - P.409-410.
12. Rutkowski G.E., Miller C.A., Jeftinija S. et al. Synergistic effects of micropatterned biodegradable conduits and Schwann cells on sciatic nerve regeneration. // J. Neural. Eng. - 2004. - Vol.1. - P.151-157.
13. Wichterle H., Lieberam I., Porter J. A. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons // Cell. - 2002. - Vol.110, №3. - P.385-397.
