CC BY
21
участие lif-stat3 каскада в поддержании самообновления и плюрипотЕнтного состояния в клетках крысы
Е.А. Васькова 12■3, В.В. Шерстюк12■3, С.М. Закиян1234
1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск, Россия
2 Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. Е.Н. Мешалкина, Новосибирск, Россия
3 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия
4 Новосибирский государственный университет, Новосибирск, Россия
The role of LIF-STAT3 signaling in maintaining self-renewal and pluripotent state and in rat cells
EA. Vaskova 1 2 3, V.V. Sherstyuk 1 2 3, S.M. Zakian 1 2 34
1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the SB of RAS, Novosibirsk, Russia
2 E.N. Meshalkin Novosibirsk State Research Institute of Circulation Pathology, Novosibirsk, Russia
3 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, Novosibirsk, Russia
4 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
Лабораторная крыса является одним из старейших и наиболее изученных объектов физиологии и экспериментальной медицины. Однако плюрипотентные клетки крыс (эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) были получены сравнительно недавно и остаются малоизученными на уровне транскрипто-ма, протеома и эпигенома, а также сигнальных каскадов, обуславливающих поддержание свойств плюрипотентности и самообновления. Данная работа посвящена изучению роли 1_1Р-БТАТЗ каскада в поддержании плюрипотентного состояния и самообновления в клетках крыс. Было показано, что ингибирование данного каскада приводит к изменениям в клеточном цикле и к гибели клеток по некротическому типу, что свидетельствует о важной роли
□ Р-БТАТЗ в поддержании самообновления плюрипотентных клеток. Используя данные транскриптомного анализа, был проведен сравнительный анализ экспрессии компонентов
□ Р-БТАТЗ каскада в соматических и плюрипотентных клетках, который также показал активность компонентов каскада на уровне транскрипции генов.
Ключевые слова: плюрипотентные клетки, сигнальные каскады, транскриптом, крыса.
Бведение
Эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ЭСК и ИПСК) обладают определенным набором свойств, таких как самообновление и плюрипотентность. Самообновление подразумевает способность бесконечно симметрично делиться, давая две плюрипотентные клетки. Свойство плюрипотентности реализуется при дифферен-цировке в способности давать производные всех трех зародышевых листков [1—4]. Так, на молекулярном уровне самообновление и плюрипотентное состояние клеток мыши обусловлено активностью BMP4 и сигнального белка Stat3 (signal transducer and activator transcription 3), активируемого интерлей-кином LIF (leukemia inhibitory factor). Поддержание данных свойств в клетках человека обуславливается иными механизмами и зависит от активности в различных комбинациях фактора роста фибробластов-2 (FGF-2), Noggin, Activin/Nodal, и TGF-p сигнальных каскадов [5—9]. В то же время практически нет данных о сигнальных каскадах, участвующих в поддержании плюрипотентности и самообновления в клетках крысы. На сегодняшний день известно, что для получения и поддержания плюрипотентных клеточных линий крыс в культуре необходимо использование
e-mail: zakian@bionet.nsc.ru
Laboratory rat is one of the oldest and best studied objects of physiology and experimental medicine. However, rat pluripotent cells (embryonic and induced pluripotent stem cells) have been obtained relatively recently and remains poorly understood in terms of their transcriptome, proteome, epigenome as well as signaling cascades that maintain its self-renewal and pluripotency. In the study, the role of LIF-STAT3 cascade in maintaining self-renewal and pluripotency was investigated. It was shown that inhibition of the cascade led to cell cycle alteration, apoptotic and necrotic cell death. Additionally, RNA-seq data analysis was performed to identify transcripts level for LIF-STAT3 components. These results also suggest that LIF-STAT3 cascade plays an important role in self-renewal in rat pluripotent stem cells.
Keywords: pluripotent cells, signaling cascades, transcriptome, rat.
интерлейкина ИР, а также специфических ингибиторов митоген-активируемых протеинкиназ (МЕК1/2) и гликоген синтазы киназы 3 (ЭБКЗ) [10, 11].
Согласно ранее опубликованным работам [10, 11], а также результатам наших исследований (неопубликованные данные) исключение интерлейкина ИР из культуральной среды приводит к быстрой гибели клеток, что говорит о потенциальной роли сигнального каскада ИР-БТАТЗ в процессах их самообновления и поддержания плюрипотентного состояния.
Цель работы — изучение роли ЫР-БТАТЗ каскада в самообновлении и поддержании плюрипотентного состояния клеток крысы. Был оценен эффект инги-бирования ЫР-БТАТЗ каскада на свойства самообновления и плюрипотентности, а также на пролифера-тивную активность путем анализа клеточного цикла. Кроме того, проведен сравнительный анализ уровня экспрессии компонентов ЫР-БТАТЗ каскада, используя данные транскриптомного анализа.
материал и методы
Культивирование клеток
Методика получения и характеристика клеточных линий крысы описаны нами ранее [12]. Клетки
культивировали в С02-инкубаторе (37°C, 5% CO2) на подложке из митотически инактивированных фибро-бластов мыши в среде N2B27, состоящей из смеси сред N2 (DMEM/F12 с добавлением 1*N2) и B27 (Neurobasal с добавлением 1*B27) в соотношении 1:1, GlutaMAX (ThermoFisher Scientific, США), 5,000 U/mL penicillin/streptomycin (ThermoFisher Scientific, США), 0,1 mM 2-mercaptoethanol, 1,000 U/mL mouse LIF (StemRD, США), 1 mM PD0325901 (StemRD, США), и 3 mM CHIR99021 (StemRD, США).
Ингибирование Янус-киназ в плюрипотентных
клетках крысы
Для репрессии активности Янус-киназ использовали ингибитор Янус-киназ (Calbiochem, США) в конечной концентрации 5|M, который добавляли в культуральную среду к плюрипотентным клеткам с последующим анализом через 24, 48 и 72 ч. на проточном цитофлуориметре BD FACSII (BD Biosciences, США). В контрольную лунку добавляли соответствующее количество ДМСО.
Количественная оценка жизнеспособных,
апоптотических и некротических клеток
Оценка количества жизнеспособных, апоптотиче-ких и некротических клеток в культуре была выполнена на линии эмбриональных стволовых клеток крысы (RES27) методом двойного окрашивания Аннексином V и пропидием иодитом (PI) с использованием коммерческого набора FITC Annexin V Apoptosis Detection kit with PI (Biolegend, США) согласно инструкции фирмы-производителя с последующим анализом на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoII (BD Biosciences, США).
Анализ распределения культуры клеток по клеточному циклу был выполнен на линии эмбриональных стволовых клеток (RES27). 400,000 клеток фиксировали в 60% метаноле при 4°C в течение 1 ч. с последующим центрифугированием при 4°C, 400g в течение 5 мин. Осадок клеток ресуспенди-ровали в 400 мкл фосфатно-солевого буфера и обрабатывали 200 мкг/мл панкреатической РНКазой в течение 30 мин. при 37°C. Далее суспензию клеток центрифугировали при 4°C, 400g в течение 5 мин., ресуспендировали в 500 мкл фосфатно-солевого буфера, добавляли 20 мкл 5мг/мл PI (ThermoFisher Scientific, США) и окрашивали клетки в течение 10 мин. при комнатной температуре. Анализ распределения клеток по клеточному циклу проводили с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCantoII (BD Biosciences, США) с последующей обработкой данных в программе ModFit LT v3.3
Анализ данных транскриптомного анализа
Для проведения сравнительного анализа уровня экспрессии компонентов LIF-STAT3 каскада были использованы данные транскриптомного анализа клеточных линий фибробластов (RNFF1, RNFM1), ЭСК (RES27, dB50) и ИПСК (NF13, NF21, SU3 и QV8) крыс линий WAG и Brattleboro [12], которые размещены в SRA базе ID SRP019984.
Графические иллюстрации экспрессии генов выполнены с помощью программы boxplot в R (www. r-project.org). По X-оси представлены нормированные значения, полученные с помошью программы DESeq.
Результаты
Влияние ингибирования Янус-киназ на плюрипотентное состояние и самообновление в клетках крыс
Для проверки гипотезы о важной роли сигнального каскада 1_!Р-8ТДТ3 в реализации самообновления в клетках крысы, на первом этапе работы оценивали степень влияния активности Янус-киназ — компонентов 1_!Р-8ТДТ3 каскада, активирующихся при взаимодействии ИР с рецептором клетки, на плюрипотентное состояние и самообновление клеток крысы. В культуральную среду к плюрипотентным клеткам добавляли ингибитор Янус-киназ с последующим анализом через 24, 48 и 72 ч количества жизнеспособных, апоптотических и некротических клеток, а также характера их распределения по клеточному циклу. Для определения количества жизнеспособных, апоптотических и некротических клеток в каждой временной точке было проведено двойное окрашивание культуры клеток Аннексином V и Р1 с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Комбинированная окраска Аннексином V и Р1 позволяет идентифицировать живые клетки (Аннексин-/Р1-), ранние проапоптотические изменения (Аннексин+/Р1-), позднюю стадию апоп-тоза, сопровождающуюся вторичным некрозом клеток и некротический вариант гибели клеток (Р1+). Было показано, что при использовании 5цМ концентрации ингибитора Янус-киназ происходило постепенное снижение доли жизнеспособных клеток с ~81,3% до 38,4% (к 72 ч.). В то же время наблюдалось увеличение количества клеток, соответствующих стадии позднего апоптоза, в 4 раза и, соответствующих стадии некроза, в 3 раза (рис. 1).
Существуют данные о том, что сигнальные каскады, опосредуемые Янус-киназами, обеспечивают корректную работу клеточного цикла, а именно участвуют в Э2-М переходе, и в процессах поддержания стабильности генома [13]. Поэтому, на следующем этапе была проведена оценка влияния ингибирования Янус-киназ на клеточный цикл в клетках крысы. Для этого через 24, 48 и 72 ч. после добавления ингибитора Янус-киназ клетки были окрашены Р1 с последующим анализом на проточном цитофлуо-риметре. Было показано, что ингибирование Янус-киназ приводило к снижению количества клеток в Б-фазе и увеличению количества клеток в Э2-фазе (рис. 2).
Таким образом, мы определили, что ингибирова-ние Янус-киназ приводит к значительному снижению пролиферации клеток и гибели клеток как по апо-птотическому пути, так и по некротическому пути, что свидетельствует о важной роли Янус-киназ, в частности, сигнального каскада 1_!Р-8ТДТ3, в самообновлении плюрипотентных клеток крыс.
Активность компонентов сигнального каскада LIF-STAT3 по данным транскриптомного анализа
ИР и все остальные члены семейства интерлей-кина-6 (ИЛ-6) используют единый механизм передачи сигнала активации для транскрипционного фактора БТДТ3 и, соответственно, могут участвовать в качестве активаторов сигнального каскада. Мы оценили относительный уровень мРНК всех генов, кодирующих лиганды ИЛ-6 семейства (табл.). В фи-бробластах и в линиях плюрипотентных клеток на
одинаковом, но низком уровне выявлялась транскрипция генов Cntf, Lif, Il23a. Уровень мРНК генов, кодирующих лиганды CTF1 и CLCF1, снижался в плюрипотентных клетках более чем в 100 раз, тогда как ген, кодирующий Osm, не транскрибировался ни в одной из исследуемых линий. Эти данные говорят о том, что сигнальный каскад, опосредуемый LIF, не активируется в клетках крысы аутокринно, и, следовательно, необходима его стимуляции, используя экзогенный LIF. У мыши LIF связывается с низкоаффинным рецептором LIFR, что приводит к гетеродимеризации LIFR с трансмембранным рецептором gp130 [14]. Среди генов, кодирующих соответствующие рецепторы у крысы (Csf3r, Epor, Ghr,
Ifnarl, Ifngrl, Ill 1 ra1, Osmr, Il20ra, Il20rb, Il21r), только для Lifr показано увеличение уровня мРНК (от 3 до 40 раз) (табл.). Ген gp130 экспрессируется во всех исследуемых клеточных линиях на высоком уровне (среднее значение нормализованного числа прочтений на ген (н.ч.п.) составляет 2637). Таким образом, мы полагаем, что в плюрипотентных клетках крысы активация сигнального каскада LIF-STAT3 на уровне лиганд-рецептор происходит по единому механизму, аналогичному таковому в клетках мыши. Далее сигнал от рецепторов может проходить в трех направлениях: JAK(Janus kinase)/STAT3); PI3K(phosphoinositide 3-kinase)/Akt и MAPK(mitogen-activated protein kinase)/Erk.
Рис. 1. Количество жизнеспособных, апоптотических и некротических клеток в культуре плюрипотентных клеток крыс на примере линии эмбриональных стволовых клеток (RES27) до и после ингибирования Янус-киназ через 24, 48 и 72 ч.
содержание ДНК содержание ДНК
Рис. 2. Распределение по клеточному циклу культуры плюрипотентных клеток крыс на примере линии эмбриональных стволовых клеток (RES27) до и после ингибирования Янус-киназ через 24,48 и 72 ч.
таблица. Данные количественного анализа экспрессии генов с помощью RNA-seq
Название Значение н.ч.п. по данным RNA-seq
гена RNFF1 RNFM1 RES 27 dB50 QV8 SU3 NF13 NF21
Лиганды ИЛ-6 семейства
Cntf 31,96 23,33 47,49 14,55 7,63 16,95 4,36 8,19
Lif 34,86 629,99 15,26 57,36 57,36 32,13 498,89 32,76
Il23a 29,05 11,05 10,17 15,41 16,96 33,91 41,48 1,36
Ctf1 489,14 319,29 5,93 19,69 5,08 22,31 4,36 2,73
Clcf1 437,81 314,38 8,48 15,41 11,87 12,49 4,36 4,09
Osm 1,93 0 0 2,56 0 1,78 0
Рецепторы LIF
Csf3r 0 0 0,84 0 15,26 5,35 0 0
Epor 5,81 14,73 2,54 6,85 9,32 1,78 4,36 12,28
Ghr 1882,97 362,27 11,02 5,99 5,08 4,46 0 0
Ifnar1 3114,07 2201,92 2256,17 1787,01 1322,19 1655,62 1377,67 2340,09
Ifngr1 850,43 1215,78 165,39 138,71 165,38 104,42 72,04 116,04
Il11ra1 11211,62 2970,68 111,11 434,12 335,00 132,09 188,85 794,59
Osmr 1268,87 826,48 1,69 5,99 2,54 0 1,09 0
окончание таблицы
Название Значение н.ч.п. по данным RNA-seq
гена RNFF1 RNFM1 RES 27 dB50 QV8 SU3 NF13 NF21
Il20ra 1,93 0 0 0 0 0 0 1,36
Il20rb 24,21 0 0,84 3,42 0 0 1,09 0
Il21r 388,41 195,26 163,70 135,28 92,44 77,64 70,95 234,82
Lifr 168,53 179,29 4926,26 3849,75 3070,14 3833,38 6213,75 847,84
Транскрипционные факторы семейства STAT
Stat1 1593,35 1412,27 58,52 217,49 132,30 38,37 29,47 9,55
Stat2 1213,66 620,17 741,31 1366,59 2234,75 996,05 973,76 865,58
Stat3 7774,03 6821,90 7103,56 6492,17 8107,88 7905,06 6901,49 6976,59
Stat4 0,96 0 1,69 5,13 0 0,89 1,09 5,46
Stat5a 2084,44 1235,43 50,89 183,24 333,30 151,72 94,97 147,45
Stat5b 2162,89 1369,29 44,95 260,30 388,43 165,11 114,62 158,37
Stat6 3020,11 3054,19 21,20 22,26 16,11 17,85 33,84 12,28
Примечания: RNFF1, RNFM1 — эмбриональные фибробласты крысы; RES27, dB50 — эмбриональные стволовые клетки; QV8, SU3, NF13, NF21 — индуцированные плюрипотентные стволовые клетки; н.ч.п. — нормализованное число прочтений на ген.
LIF/JAK/STAT3 сигнальный каскад Связывание LIF с рецептором и образование гетеродимерного комплекса приводит к gp130-опосредованной активации Янус-киназ и последующему фосфорилированию цитоплазматического домена gp130, привлекающего белки семейства STAT. Данные белки также подвергаются фосфори-лированию Янус-киназами, димеризуются и проникают в ядро, где участвуют в регуляции транскрипции генов-мишеней [15]. Анализ транскриптома линий ЭСК и ИПСК крысы показал, что уровень экспрессии генов Jak1 (от 262 н.ч.п. в NF21 до 1126 н.ч.п. в QV8) и Jak2 (от 47 н.ч.п. в NF21 до 357 н.ч.п. в QV8) у них выявляется, но он значительно ниже по сравнению с фибробластами. Экспрессия Jak1 снижена в 4—26 раз, Jak2 — в 2—15 раз (рис. 3). В то же время, интересно отметить, что для Tyk2-киназы (также из семейства Янус-киназ) не наблюдалось снижения уровня транскрипции по сравнению с фибробластами и был детектирован наиболее высокий уровень экспрессии среди всех представителей Янус-семейства
(от 648 н.ч.п. для NF21 до 1204 н.ч.п. для dB50). Таким образом, можно сделать предположение, что у крысы именно киназа Tyk2 задействована в активации транскрипционных факторов STAT. Среди данного семейства (STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6) неизменно высокую экспрессию во всех исследуемых линиях показали транскрипционные факторы STAT3 (в среднем 7484 н.ч.п.) и STAT2 (в среднем 1195 н.ч.п.). Тем не менее, если судить об экспрессии генов на уровне транскрипции, то мы не обнаружили ее увеличения для данных транскрипционных факторов в плюрипотентных клетках крысы по сравнению с фибробластами (табл.). Известно, что в ответ на индукцию цитокином сигнального каскада происходит увеличение экспрессии ряда членов данных семейств, как например, SOCS3 и Ptpn6 [14]. Согласно данным транскрип-томного анализа в ЭСК и ИПСК уровень мРНК Socs3 и Ptpn6 возрастает в 6—9 и в 5—42 раз соответственно, что является косвенным доказательством того, что сигнальный путь LIF-STAT3 действительно активируется в плюрипотентных клетках крысы.
NF21 □ NF13D SU3 □ QV8 | | dB501 | RES27Щ RNFM11
RNFF1
JAK1
□
JAK2
TYK2
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
100 200 300 400 500 600 700
Рис. 3. Уровень экспрессии генов Jak1, Jak2 и Tyk2 в линиях эмбриональных фибробластов крысы (RNFF1, RNFM1), эмбриональных стволовых клеток (RES27, dB50) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (QV8, SU3, NF13, NF21) по данным транскриптомного анализа
Таким образом, согласно анализу уровня мРНК компонентов LIF-STAT3 сигнального каскада в дифференцированных и плюрипотентных клетках крысы мы полагаем, что данный сигнальный каскад является функциональным в плюрипотентных клетках крысы, однако, возможно, его регуляция отличается от таковой у мыши, в частности, спектр задействованных мишеней STAT3 значительно меньше и/или специфичнее.
LIF/PI3K/AKT и LIF/SHP2/MAPK каскады
Индукция LIF с помощью Янус-киназ также может активировать PI3Ks, которые в свою очередь участвуют в активации Akts, основной мишенью которых является белок GSK3 [16]. Репрессия генов, кодирующих Янус-киназы, а также большинства компонентов PI3K/AKT пути, например, генов, кодирующих Pik3r3-субъединицу, PI3K и Akt3 свидетельствует о том, что данный сигнальный путь в плюрипотентных клетках крысы неактивен. В пользу данного предположения свидетельствуют также данные о том, что in vivo, в клетках внутренней клеточной массы крысы, гены Pik3r1 и Pik3r3 подвергаются специфической репрессии [17]. Конечная мишень PI3K/AKT пути — GSK3, являющаяся также компонентом канонического Wnt пути, подвергается действию ингибитора CHIR99021, используемого в данной работе при культивировании ЭСК и ИПСК крысы. В результате ингибирования GSK3 происходит активация генов-мишеней данного каскада.
В отличие от предыдущих двух ветвей LIF-опосредованных сигнальных путей, активация LIF/SHP2/MAPK сигнального каскада приводит к дифференцировке плюрипотентных клеток, по крайней мере, у мыши. Данный сигнальный каскад опосредуется путем привлечения и последующего фосфорилирования SHP2 с помощью Янус-киназ. Затем SHP2 взаимодействует с Grb2-SOS комплексом, что приводит к активации MAPK пути, включая Ras/RAF/MEK/ERK каскад [18]. Кроме того, известно, что у мыши Ras/RAF/MEK/ERK каскад способен активироваться аутокринно под действием FGF4 лиганда [19, 20]. Тот факт, что в плюрипотент-ных клетках крысы экспрессия генов, кодирующих Янус-киназы, подавлена, а уровень мРНК гена Fgf4 повышен в среднем до 992 н.ч.п. по сравнению с фибробластами, где его мРНК не выявляется, свидетельствует об активации Ras/RAF/MEK/ERK сигнального каскада у крысы по аутокринной схеме. В пользу того, что Ras/RAF/MEK/ERK каскад в ЭСК и ИПСК активируется аутокринно с помощью FGF4, свидетельствует также тот факт, что in vivo в эмбрионах крысы экспрессия гена Raf1 (члена MAPK/ ERK пути), активируемого в эмбриональном развитии FGF факторами, специфически увеличивается в клетках ВКМ [21].
Таким образом, мы полагаем, что ни LIF/PI3K/AKT, ни LIF/SHP2/MAPK сигнальные каскады не активируются в плюрипотентных клетках крысы в ответ на индукцию LIF. При этом LIF/SHP2/MAPK активируется аутокринно с помощью FGF4.
Обсуждение
Культивируемые плюрипотентные клетки являются одним из наиболее перспективных объектов для исследования ряда фундаментальных вопросов
генетики и биологии развития, а также в таких областях как создание моделей для изучения молекулярных основ патогенеза заболеваний in vitro и разработки методов и подходов к терапии болезней [22—26]. В настоящее время в исследованиях используются два типа плюрипотентных клеток — ЭСК и ИПСК. Несмотря на то, что лабораторная крыса является одним из старейших и наиболее изученных объектов физиологии и экспериментальной медицины, плюрипотентные клетки крысы были получены сравнительно недавно и сильно отстают от таковых мыши и человека в плане изучения их свойств, как в фундаментальных, так и в практических областях.
В данной работе мы более подробно исследовали молекулярные механизмы, обуславливающие поддержание свойств самообновления и плюрипо-тентности в клетках крыс, главным образом, роль сигнального каскада LIF-STAT3 в этих процессах. На первом этапе работы было показано, что репрессия LIF-STAT3 каскада путем ингибирования Янус-киназ приводит к гибели клеток крысы по некротическому типу. Стоит отметить, что у мыши репрессия LIF-STAT3 каскада путем исключения интерлейкина LIF из культуральной среды приводит к дифферен-цировке плюрипотентных стволовых клеток мыши. Таким образом, можно заключить, что, во-первых, активность LIF-STAT3 каскада необходима для поддержания самообновления в клетках крысы и, во-вторых, имеются видоспецифические особенности. Также, мы показали, что репрессия сигнального каскада LIF-STAT3 приводит к изменениям в клеточном цикле. В результате ингибирования киназ Янус-семейства происходит значительное обогащение клеточной популяции на стадии G2, что свидетельствует о важной роли каскада LIF-STAT3 в регуляции клеточного цикла, а именно G2-M перехода. Похожий эффект на ингибирование Янус-киназ был описан также и для культуры клеток лейкемии промиелоцитарной линии человека HL-60 [13]. Сходные эффекты влияния активности Янус-киназ на клеточный цикл для разных типов клеток у разных видов говорят о консервативности данного процесса.
Далее, используя данные транскриптома, мы провели сравнительный анализ уровня транскрипции отдельных компонентов LIF-STAT каскада в ЭСК, ИПСК крысы и в линиях соматических клеток (эмбриональных фибробластов). В результате, было показано, что на транскрипционном уровне компоненты LIF-STAT3 каскада являются активными. Однако неожиданным оказалась репрессия в ЭСК и ИПСК генов Jak1 и Jak2, кодирующих ключевые киназы, фосфорилирующие STAT3 у мыши [27]. Одним из возможных объяснений этого феномена может быть достаточность детектированного количества транскрипта генов Jaks для активации и передачи сигнала. Дело в том, что JAK1, JAK2 и TYK2 ассоциированы с gp130 конститутивно [28, 29] и активируются в ответ на индукцию лигандов ИЛ-6 семейства. Поэтому, возможно предположить, что в плюрипотентных клетках крысы при данном уровне транскрипции генов образуется достаточно функциональных белковых молекул JAKs для ответа на индукцию цитокина LIF. Другим возможным объяснением может быть то, что функцию активации STAT3 в ЭСК и ИПСК выполняет киназа TYK2. В пользу данного предположения свидетельствует, во-первых, наиболее высокий уровень мРНК гена
Tyk2 среди всех киназ Янус-семейства. Во-вторых, для некоторых линий ЭСК и ИПСК по сравнению с фибробластами было показано увеличение уровня мРНК Tyk2, примерно в 2 раза. В-третьих, описано, что TYK2 способна приводить к активации STAT3 и также подвергается негативной регуляции с участием SOCS3 [30], что согласуется с нашими данными по увеличению транскрипции Socs3 в плюрипотентных клетках крысы. В-четвертых, согласно литературным данным, в клетках ВКМ на предымплантационных стадиях развития у крысы экспрессия гена Jak1 подвергается специфической репрессии [17], что также свидетельствует в пользу того, что активация STAT3 происходит без участия JAK1.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292(5819): 154-6.
2. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. PNAS USA 1981; 78(12): 7634-8.
3. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001; 17: 435-62.
4. Медведев С.П., Шевченко А.И., Закиян С.М. Молекулярные основы поддержания самообновления и плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток млекопитающих. Acta Naturae 2010; 2(3): 38-57.
5. James D., Levine A.J., Besser D. et al. TGFbeta/activin/nodal signaling is necessary for the maintenance of pluripotency in human embryonic stem cells. Development 2005; 132(6): 1273-82.
6. Vallier L., Alexander M., Pedersen R.A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 2005; 118(Pt 19): 4495-509.
7. Wang G., Zhang H., Zhao Y. et al. Noggin and bFGF cooperate to maintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005; 330(3): 934-42.
8. Xiao L., Yuan X., Sharkis S.J. Activin A maintains self-renewal and regulates fibroblast growth factor, Wnt, and bone morphogenic protein pathways in human embryonic stem cells. Stem Cells 2006; 24(6): 1476-86.
9. Xu R.H., Peck R.M., Li D.S. et al. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nat. Methods 2005; 2(3): 185-90.
10. Buehr M., Meek S., Blair K. et al. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts. Cell 2008; 135(7): 1287-98.
11. Li P., Tong C., Mehrian-Shai R. et al. Germline competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell 2008; 135(7): 1299-310.
12. Vaskova E.A., Medvedev S.P., Sorokina A.E. et al. Transcriptome Characteristics and X-Chromosome Inactivation Status in Cultured Rat Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Dev. 2015; 24(24): 2912-24.
13. Reiterer G., Yen A. Inhibition of the janus kinase family increases extracellular signal-regulated kinase 1/2 phosphorylation and causes endoreduplication. Cancer Res. 2006; 66(18): 9083-9.
14. Hirai H., Karian P., Kikyo N. Regulation of embryonic stem cell self-renewal and pluripotency by leukaemia inhibitory factor. Biochem. J. 2011; 438(1): 11-23.
15. Tang Y., Tian X.C. JAK-STAT3 and somatic cell reprogramming. JAKSTAT 2013; 2(4): e24935.
16. Doble B.W., Woodgett J.R. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J. Cell Sci. 2003; 116(Pt 7): 1175-86.
Таким образом, на основании полученных данных можно заключить, что в поддержании самообновления в плюрипотентных клетках крысы задействован сигнальный каскад LIF-STAT3, регуляция которого имеет видоспецифичный характер.
Благодарности
Анализ влияния ингибирования Янус-киназ на плюрипотентное состояние и самообновление в клетках крыс выполнен за счет бюджетного проекта № 0324-2015-0003.
Исследование анализа данных транскриптома выполнено за счет гранта Российского научного фонда (грант №14-14-00271).
17. Casanova E.A., Okoniewski M.J., Cinelli P. Cross-species genome wide expression analysis during pluripotent cell determination in mouse and rat preimplantation embryos. PLoS One 2012; 7(10): e47107.
18. Hamazaki T., Kehoe S.M., Nakano T. et al. The Grb2/Mek pathway represses Nanog in murine embryonic stem cells. Mol. Cell Biol. 2006; 26(20): 7539-49.
19. Stavridis M.P., Lunn J.S., Collins B.J. et al. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development 2007; 134(16): 2889-94.
20. Kunath T., Saba-El-Leil M.K., Almousailleakh M. et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development 2007; 134(16): 2895-902.
21. Hao J., Li T.G., Qi X. et al. WNT/beta-catenin pathway up-regulates Stat3 and converges on LIF to prevent differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev. Biol. 2006; 290(1): 81-91.
22. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas — инструменты открытий. Acta Naturae 2014; 6(3): 20-42.
23. Medvedev S.P., Grigor>eva E.V., Shevchenko A.I. et al. Human induced pluripotent stem cells derived from fetal neural stem cells successfully undergo directed differentiation into cartilage. Stem Cells Dev. 2011; 20(6): 1099-112.
24. Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Модельные системы болезней двигательный нейронов — платформа для изучения механизмов патогенеза и поиска терапевтических средств. Acta Naturae 2015; 7(1): 21-38.
25. Bayzigitov D.R., Medvedev S.P., Dementyeva E.V. et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes afford new opportunities in inherited cardiovascular disease modeling. Cardiol. Res. Pract. 2016; 2016: 3582380.
26. Медведев С.П., Шевченко А.И., Закиян С.М. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки: проблемы и перспективы применения в заместительной клеточно терапии. Acta Naturae 2010; 2(5): 18-28.
27. Kisseleva T., Bhattacharya S., Braunstein J. et al. Signaling through the JAK/STAT pathway, recent advances and future challenges. Gene 2002; 285(1-2): 1-24.
28. Lutticken C., Wegenka U.M., Yuan J. et al. Association of transcription factor APRF and protein kinase Jak1 with the interleukin-6 signal transducer gp130. Science 1994; 263(5143): 89-92.
29. Stahl N., Boulton T.G., Farruggella T. et al. Association and activation of Jak-Tyk kinases by CNTF-LIF-OSM-IL-6 beta receptor components. Science 1994; 263(5143): 92-5.
30. Babon J.J., Varghese L.N., Nicola N.A. Inhibition of IL-6 family cytokines by SOCS3. Semin. Immunol. 2014; 26(1): 13-9.
Поступила: 16.05.2016
