CC BY
14
24. Kim, W. Y., Kaelin, W. G. (2004). The role of VHL mutation in human cancer. Journal of Clinical Oncology, 22 (24), 4991-5004. doi: 10.1200/jco.2004.05.061
25. Kudo, Y., Takata, T., Ogawa, I., Kaneda, T., Sato, S., Takekoshi, T., Zhao, M., Miyauchi, M., Nikai, H. (2000). p27Kip1 Accumulation by inhibition of proteasome function
induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma cells. Clin. Cancer Res., 6 (3), 916-923.
26. Tu, Y., Xu, J., Zhou, Z. G., Wang, C. Y. (2012). The ubiquitin proteasome pathway (UPP) in the regulation of cell cycle control and DNA damage repair and its implication in tumorigenesis. Int. J. Clin. Exp. Pathol., 5 (8), 726-738.
Дата надходження рукопису 15.10.2015
Сокур Олеся Вадимовна, доктор биологических наук, старший научный сотрудник, заведующая лаборатории, Научно-экспериментальная лаборатория «Физико-химической биологии» научно-учебного центра «Институт биологии», Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, ул. Владимирская, 60, г. Киев, Украина, 01601 E-mail: dolesya60@mail.ru
Тимошенко Мария Александровна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник, Научно-экспериментальная лаборатория «Физико-химической биологии» научно-учебного центра «Институт биологии», Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, ул. Владимирская, 60, г. Киев, Украина, 01601 E-mail: maria.bulavka@gmail.com
Коваль Татьяна Владимировна, ведущий инженер, Научно-экспериментальная лаборатория «Физико-химической биологии» научно-учебного центра «Институт биологии», Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, ул. Владимирская, 60, г. Киев, Украина, 01601 E-mail: stanya@bigmir.net
Богун Лариса Ивановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, Научно-экспериментальная лаборатория «Физико-химической биологии» научно-учебного центра «Институт биологии», Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко, ул. Владимирская, 60, г. Киев, Украина, 01601 E-mail: bogynal@gmail.com
УДК 602.6:577.1
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.53844
КОНСТРУЮВАННЯ 1МУНОФЕРМЕНТНОГО Д1АГНОСТИКУМУ ДЛЯ ВИЯВЛЕННЯ ГЛ1ФОСАТ-РЕЗИСТЕНТНО1 ГЕНЕТИЧНО-МОДИФ1КОВАНО1 СО1
© В. Г. Спиридонов, Я. В. Хоменко, В. Д. 1щенко, В. С. Гончаренко, Н. М. Шимко, Д. Ю. Рибальченко
В процесi роботи рекомбгнантним ензимом 5-енолтрувышитмат-3-фосфат синтазою (CP4 EPSPS), що надае ознаки толерантностi до глiфосату ГМ-сог, iмунiзовано домашню курку та отримання жовтковi специфiчнi антитша IgY. Представлен етапи конструювання iмуноферментного дiагностикуму, що дозволяе виявляти не менше 0,1 % генетично-модифкованог сог, сттког до глiфосату Ключовi слова: генетично модифжоваш рослини, 1ФА, 5-енолтрувышиюмат-3-фосфат синтаза, жо-втковi антитша
During research we have utilized recombinant enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EP-SPS), conferring resistance to glyphosate for GM soybean, for the hen immunization and obtaining specific yolk antibodies IgY. Stages of ELISA development that can detect at least 0,1 % of GM-soybean resistant to glypho-sate were present
Keywords: genetically modified plants, enzyme immunoassay, 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase, yolk antibodies
1. Вступ
Стшш до гербщид1в трансгенш культури скла-дають близько 60 % вс1х генетично-модиф1кованих с.-г. культур, серед яких перше м1сце посщае гл1фо-сат-резистентна соя, обсяги р1чного виробництва
яко! сягають бшьше 260 мшьйошв тон. Сьогодш крашами лшерами у виробнищга со! е Сполучеш Штати, Бразил1я та Аргентина в яких депоновано бшьше 80 % свггового виробництва со! [1]. Зростан-ня виробництва соевих боб1в в основному обумов-
лено високою рентабельною культури, державною тдтримкою та високим попитом для тваринницько! галуз1 в якосп корм1в з високим вмютом проте!шв. З урахуванням постшного зростання попиту на про-дукцш тваринництва у свт соя розглядаеться як стратепчна культура для продовольчо! безпеки у майбутньому [2].
2. Аналiз лiтературних даних i постановка проблеми
На початку 90-х минулого стотття вчеш компа-нп Монсанто запатентували толерантний до шпбгго-ру тфосату ензим EPSPS, ген якого було видшено з агробактери (Agrobacterium tumefaciens sp., штам CP4), що мешкала у спчних водах заводу з виробни-цтва тфосату. Бютехнолопчним шляхом ген CP4 EPSPS було привнесено у геном со!, утворюючи при цьому стшку до гл1фосату лшш 40-3-2. Це було початком ново! ери комерщал1зацп трансгенних лшш стшких до герб1цид1в альськогосподарських рослин, таких як, соя, кукурудза, ршак, бавовна, цукровий буряк, тощо [3].
В Укра!ш 1нтерес до виробництва со! зростае з кожним роком, так за даними Держкомстат Укра!ни у 2013 рощ валовий зб1р со! становив 2,7 млн. т., а до 2016 року плануеться з1брати до 4,5 млн. т. При цьому, за неофщшними даними, в Укра!ш близько 60 % нелегально вирощуеться гл1фосат резистентна генетично-модифжована соя, лши 40-3-2 [4].
Враховуючи той факт, що за останшми даними показано онкогенну властив1сть тфосату на здоров'я людини, що збшьшуе ризики виникнення Неходжкшсько! л1мфоми, в европейських кра!нах вже д1е заборона на використання тфосату, а його сл1дов1 кшькосп жорстко регламентуються у кш-цевш с.-г. продукцп. Таким чином, необхщшсть проведення постшного мониторингу за розповсю-дженням тфосат-резистентних ГМ-рослин е без-перечним [5].
Вщповщно до постанови КМУ «Про затвер-дження Порядку етикетування харчових продуклв, як1 мютять генетично модифжоваш оргашзми або вироблеш з !х використанням та вводиться в обт» ввд 13.05.2009 № 468, якщо харчов1 продукти мютять ГМО бшьше 0,9 %, виробник зобов'язаний зазначати ввдповщну шформацш на етикетщ [6]. У зв'язку з цим МОЗ Укра!ни затвердило «Перелж харчових продукпв, щодо яких здшснюеться контроль вмюту генетично модифжованих орган1зм1в [7]. Для забез-печення виконання вказаних нормативних докумен-пв передбачено створення мереж акредитованих лабораторш з питань випробування ГМО методом пол1меразно! ланцюгово! реакцл в реальному часг Проте на даний час така мережа лабораторш е недо-статньо розвинута у зв'язку з високою вартютю ма-тер1ально1-техн1чно! бази для проведення таких дос-лвджень.
Альтернативним шдходом до виявлення ГМО, е методи яш грунтуються на детекци чужорвдних про-те!шв наприклад 1муноферментний анал1з (1ФА). Ос-новт принципи якого викладеш у м1жнародному стандарт! ISO 21572:2004 [8]. Реал1защя 1ФА перед-
бачае меншу кшькють етатв, що зменшуе вплив р1з-номаштних фактор1в, в том числ1 i людського, на результат дослiдження. Метод рекомендуеться як першочерговий iнструмент для скришнгу рослинно! сировини.
3. Мета та задачi дослiдження
Метою ще! роботи була розробка iмуноферме-нтного (1ФА) дiагностикуму для виявлення генети-чно-модифжовано! со! (RoundUp Ready 40-3-2). Для реалiзацi! поставлено! мети було вирiшено таш за-вдання:
1. Провести iмунiзацiю курки (Gallus gallus) ре-комбшантним ензимом СР4 EPSPS та отримати жов-тковi специфiчнi антитiла IgY.
2. Синтезувати iмуноферментний кон'югат спе-цифiчних афiнних IgY з пероксидазою хрону.
3. Сконструювати конкурентний iмунофермент-ний аналiз для виявлення ГМ-со!, стiйко!' до гербщи-ду глiфосату.
4. Матерiали i методи
Реагенти та обладнання
Реактиви:
Рекомбшантний ензим СР4 EPSPS, отримано ра-тше в лабораторних умовах (неопублiкованi дат). Хiмiчнi реактиви, квалiфiкацi!' «Molecular biology grade» ввд компанiй Sigma (США), Carl Roth (Шмеч-чина), Amresco (США); поживнi середовища Difco (BD Group); полiстирольнi 96-ти лунковi планшети Sarstedt, (Нiмеччина); анти видовий кон'югат з пероксидазою хрону AbD Serotec (Великобританiя), та iншi.
Зразки:
Позитивш зразки: листя ГМ-со! (RoundUp Ready 40-3-2), попередньо перевiренi у ПЛР; сертифiкованi референс зразки со! RoundUp Ready 40-3-2, кат. № ERM-BF410 bk, ERM-BF410 dk, ERM-BF410 gk вмiст ГМО 0,1, 1,0 та 10,0 %, вiдповiдно (IRMM, Бельпя);
Негативнi зразки: насiння со!, сорт Черемош;
Для дослiдження перехресно! реактивностi, дос-лiджували насiння ГМ-со! А2704-12 (Liberty Link), толерантно! до iншого гербiциду Liberty, дiючо!' ре-човиною якого е фосфiнотрицин.
Методи:
1.1мушзац1я курки рекомбтантним антигеном СР4 EPSPS
Для iмунiзацi! використовували 5-ти мюячну курку породи бший леггорн масою 1,5 кг, яку утри-мували в стандартних умовах у вiварiю факультету ветеринарно! медицини НУБ!П Укра!ни. Iмунiзацiю проводили тричг перша iз використанням повного ад'юванта Фрейнда (Thermo Scientific, США), двi послiдуючi з iнтервалом 10 дiб iз використанням неповного ад'юванта Фрейнда (Thermo Scientific, США). Для кожно! iмунiзацi! використовували реко-мбiнантним антиген СР4 EPSPS у кшькосп 200 мкг, препарат антигену вводили внутршньом'язово, в курячу грудку (грудний мяз). З метою визначення титру iмуноглобулiнiв специфiчних до СР4 EPSPS у курки вщбирали сироватку кровi iз плечово! (щдкри-
лово!) вени до та тсля кожно! 1мун1зацИ i перев1ряли в непрямому 1ФА.
2. Видшення жовткових антитш
Жовтковi антитiла (Ig Y) видели методом ПЕГ-прецишгацп [9] Очищену фракцiю сумарних Ig Y розчиняли у фосфатно-сольовому буферi, визнача-ли концентрацш та перевiряли у непрямому 1ФА.
3. Непрямий 1ФА mumpie специфгчних антитш проти СР4 EPSPS
Рекомбшантний антиген СР4 EPSPS в концент-рацп 10 мкг/мл сорбували у 96-лунковi полiстироловi планшети фiрми „Sarstedt" (Нiмеччина) в 0,05 М кар-бонатно-бiкарбонатному буферi, рН 9,6 та витриму-вали у холодильнику при температури 4 °С протягом 16-18 год. Пiсля законченна шкубаци вмiст лунок витрушували та промивали планшети розчином для ввдмивання (25 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, 3 мМ NaCl та 0,05 % Tween-20).
Зразки сироватки кровi розводили 1:20 розчи-ном для розведення зразшв (25 мМ Na2HPO4, 4 мМ NaH2PO4, 3 мМ NaCl, 3 мМ KCl, 2 М сечовина, 12,5 % сухе знежирене молоко та 0,05 % Tween-20). При дослщженш жовткових антитш, робили ряд двох-кратних розведень (50, 25, 12,5, 6,25, та 3,12 мкг/мл). Зразки сироватки кровi або жовтковi антитша вносили у лунки планшету та витримували в термостат протягом 60 хв при 37 °C. Пiсля завершения шкубаци для видалення антитш, що не зв'язалися, лунки чотирикратно промивали розчином для вадми-вання при використанш автоматичного промивача планшет.
Специфiчнi антитша, що зв'язалися з рекомбь нантним антигеном СР4 EPSPS виявляли антивидо-вим кон'югатом фiрми AbD Serotec (Великобрита-шя), що представляв собою вториннi козячi антитiла проти антитiл курки, мiченi пероксидазою хрону. Кон'югат вносили в лунки планшету у робочому роз-веденнi 1:4000 та шкубували 30 хв у термостат при 37 °C. Пiсля чого лунки планшету знову промивали розчином для вшмивання при використанш автоматичного промивача планшет.
Специфiчнi iмуннi комплекси проявляли iз ви-користанням розчину хромогену тетраметилбензиди-ну (ТМБ) (Clinical Science Products Inc., США). Роз-чин хромогену вносили по 100 мкл у кожну лунку та iнкубували упродовж 30 хв при шмнатнш температу-рi у темному мiсцi.
Кольорову ферментативну реакцш зупиняли, вносячи в лунки планшета по 50 мкл стоп-реагенту (2 М сiрчана кислота). Облк реакцй' проводили за допомогою автоматичного спектрофотометру у двох-вильовому режимi при 450 та 620 нм.
4. Синтез афтного сорбенту та видшення спе-цuфiчнuх жовткових антитш проти СР4 EPSPS
Суспензш сефарози-6В (Sigma, США), об'емом 1,0 мл ввдмивали 0,5 М карбонатним буфером (рН= = 11,2), тсля чого додавали 0,25 мл дившш сульфону. Реакцшну сумiш перемiшували на орбiтальному шейкерi протягом 60 хвилин. Активовану сефарозу ввдмивали водою до нейтрального значення рН та ресуспендували у 5,0 мл 0,1 М карбонатного буферу рН 9,0, що мютив 20 мг рекомбшантного бшку СР4
EPSPS. Реакцшну сумш iнкубували протягом 1520 годин на орбiтальному шейкерг Пiсля закiнчення термiну реакцй' конденсаци до реакцiйноi сумiшi додавали 20 мкл етанолашну для блокування надлиш-кових активованих груп сефарози та перемiшували протягом 2 годин при шмнатнш температурь Отри-маний афшний носiй ввдмитий водою до нейтрального значення рН використовували для видшення спе-цифiчних полшлональних жовткових антитiл. Видь лення проводили використовуючи хроматографiчну систему низького тиску BioLogic LP (Bio-Rad, США). Для цього колонку з афшним ноаем, об'емом 1,0 мл врiвноважували 50 мМ розчином Трис-НО, (pH 7,3 при 22 °C) та наносили 5,0 мл видшених жовткових антитш з конце нтращею 5,5 мг/мл. Колонку промивали 45 мл 50 мМ розчину Трис-НО. Елюцш афш-них антитiл проводили 0,1 М розчином глщину (рН 2,5) при цьому проводили нейтралiзацiю фракцiй елюцп додаючи 1 М Трис- На, (pH 8,8 при 22 °C) та 3 М KCl у сшввшношенш 1:20 та 1:10, вшповшно.
5. Кон'югацiя афтних жовткових антитш проти СР4 EPSPS з пероксидазою хрону та конструю-вання конкурентного 1ФА.
Для синтезу iмуноферментного кон'югату афш-них курячих жовткових антитш проти трансгенного ензиму CP4 EPSPS з пероксидазою хрону застосову-вали класичний перйодатний метод [8]. Специфiч-шсть отриманого кон'югату (IgY-HRP) перевiряли шляхом титрування у конкурентному iмунофермент-ному аналiзi iз використанням водного екстракту з насiння 100 % позитивно! ГМ-со! (RoundUp Ready 40-3-2) та негативно! со!, статус яких був попередньо шдтверджений у ПЛР-РЧ.
6. Проведення конкурентного 1ФА i3 використанням референс зразюв
Зразки для дослвдження зважували по 100 мг та додавали 1000 мкл дистильовано! води. Для досль дження чутливосп методу, дослвджували сертифжо-ваний референc-матерiал з рiзним вмютом ГМО, а саме: 0,1, 1,0, 10 та 100 %. При цьому ва зразки ана-лiзували у трьох повторах, для визначення вщгворю-ваностi розроблено! методики. Зразки ретельно пере-мiшували та шкубували при шмнатнш температурi 5-10 хв. По зашнченню iнкубацii воднi екстракти центрифугували при 3000 об/хв протягом 1 хвилини. Надосад використовували для дослiдження у конкурентному 1ФА.
Рекомбiнантний антиген СР4 EPSPS в концент-рацп 10 мкг/мл сорбували у 96-лунковi полiстироловi планшети як i при непрямому варiантi 1ФА.
У лунки сенсибшзованого планшету вносили по 50 мкл водних екстракпв дослвджуваних зразшв на-сiння, пiсля чого додавали по 50 мкл синтезованого кон'югату (IgY-HRP) iз визначеним заздалепдь титром (1:1600). Планшет шкубували в термостап 60 хв при 37 °C. Шсля завершення iнкубацi! лунки планшету чотирикратно промивали розчином для ввдмиван-ня при використанш автоматичного промивача планшет. Для визначення фонового сигналу 1ФА ви-користовували контроль кон'югату (КК) - в лунки планшету вносили пльки розчин кон'югату, без до-давання дослвджуваних зразк1в.
Розчин хромогену вносили по 100 мкл у кожну лунку та шкубували упродовж 30 хв при шмнатнш температур1 у темному мющ.
Кольорову ферментативну реакщю зупиняли, вносячи в лунки планшета по 50 мкл стоп-реагенту (2 М арчана кислота). Облк реакцп проводили за допомогою автоматичного спектрофотометра у двох-вильовому режим1 при 450 та 620 нм.
1нтерпретащю результапв конкурентного 1ФА проводили i3 використанням показника - вщсоток 1нг1б1цИ" (В1), який розраховували за формулою:
ОГ КК - ОГзразка
BI =-
ОГ КК
де ОГ КК - оптична густина контролю кон'югату.
Статистичну обробку даних проводили за допомогою пакету програм Microsoft Excel. Вщмш-нiсть показникiв порiвняно з контролем (бланком) ощнювалися ста-ндартним методом варiацiйноï статистики та вважалися достовiрни-ми при Р<0,05.
5. Результати та обгово-рення
1ФА високочутливий метод дослщження, який дозволяе вияв-ляти аналии-антигени на субна-номолярному рiвнi, при цьому, ключовим компонентом у будь-якому варiантi 1ФА е використання специфiчних антитiл. Тому, першим кроком розробки 1ФА дiаг-ностикуму для виявлення ГМ-рослин стшких до тфосату, було отримання специфiчних антитш проти ензиму СР4 EPSPS. Для цього ми видшили, клонували ген та отримали рекомбiнантний аналог ензиму СР4 EPSPS (неопублжоваш данi). Рекомбь нантний ензим СР4 EPSPS використовували як антиген для iмунiзацiï домашньоï курки -несучки (Gallus gallus) та отримання специфiчних жовтко-вих антитш (IgY). Ми провели 3 раунди iмунiзацiï курки рекомбiнантним антигеном СР4 EPSPS, з штервалом у 10 дiб пiд контролем ти^в IgG у непрямому 1ФА. На 30 -у добу дослшження концент-рацiя IgY (50 мг/мл) в яйщ за результатами непрямого 1ФА дорiвнювало титру IgG в сироватщ кровi у розведенш 1/20 (рис. 1).
Вирiвнювання концентрацп IgY в жовтку iз титрами IgG в сироватщ кровi курки дало нам шдста-ву для подальшого афiнного видiлення специфiчних IgY. Для цього нами було синтезовано афшний сорбент, об'емом 1,0 мл, який ми використовували для нанесення 5 мл розчину IgY (5,5 мг/мл). Шсля про-мивання афiного сорбенту проводили елющю спе-цифiчних IgY, на рис. 2 представлений профшь хроматограми афшного видiлення специфiчних IgY. В цшому ми отримали 7,2 мг афшних IgY, що ста-новить близько 26 % ввд тотально! кшькосп жовт-кових антитiл.
IgG Титри IgY
1,4 1.2 ю 1,0 ? 0,8 О 0,6 0,4 0,2
1
1
>
10 20 доба 30 50 25 12,5 6,25 3.12 мкг/мл
Рис. 1. Дослшження титрiв курячих антитiл (IgG та IgY) проти рекомбшантного трансгенного ензиму СР4 EPSPS у непрямому 1ФА
Афшш антитiла IgY проти рекомбшантного ензиму СР4 EPSPS ми використовували для синтезу кон'югату з пероксидазою хрону та конструювання конкурентного варiанту 1ФА.
На рис. 3 представлена схема конкурентного 1ФА, де трансгенний ензим СР4 EPSPS, що експресу-еться ГМ-рослинами (зелеш трикутники) конкуруе з рекомбiнантним протешом (сiрi трикутники), який засорбований на полютироловому планшетi, за мiсця зв'язування з специфiчним кон'югатом. У разi вшсу-тностi у рослинному екстракп трансгенного ензиму СР4 EPSPS (рис. 3, а) кон'югат взаемодiе з рекомбь нантним ензимом, на планшет та ензиматична акти-внiсть пероксидази хрону проявляеться у виглядi ко-льорово! реакцii на кiнцевiй стади аналiзу. У проти-лежному випадку, якщо в рослинному екстрактi при-сутнiй трансгенний ензим СР4 EPSPS, тобто рослина мiстить ознаки ГМО, кон'югат взаемодiе з трансген-ним ензимом та частково вимиваеться з лунок планшету шд час промивання, при цьому кольорова реак-цiя не проявляеться (рис. 3, б).
Критичним параметром при розробщ конкурентного 1ФА е певний титр кон'югату, який визнача-еться експериментально з використанням позитивних та негативних зразшв. Шляхом титрування у 1ФА вибираеться таке розведення кон'югату, яке мае мак-симальне значения оптичноi' густини (ОГ) при досль дженнi негативного зразку та мiнiмальне значення ОГ при дослвдженш позитивного. На рис. 4 представ-
5
0 0 0 0 ^ 0 0 5550454035- Г IgY проти rCP4EPSPS Г -0 -0 -0 3 2 0 9 £ S Î 1
0 25- iff® (J 1_ 5
0 0 0 201510- Г \ -0 -0 -0 3 2
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 Time [minutes]
Рис. 2. Хроматограмма очищення жовткових антитiл (IgY) на афшному cop6eHTi Сефароза-6В:гСР4 EPSPS
лет крив! титрування кон'югату афтних антитш IgY з пероксидазою хрону при дослвджент позитивного зра-зку 100 % ГМ-соя (Roundup Ready 40-3-2) та негативного зразку со! (сорт Черемош). В даному випадку нами було обрано розведення кон'югату 1/1600.
б
Рис. 3. Принцип конкурентного 1ФА (схема): а - у раз1 вщсутносп дослщжуваного аналпу; б - у раз1 присутносп дослщжуваного анал1зу (пояснення у текст!)
3,5
3
2,5 соя
Й 2 о t —«- позитивна
1- 1.5 О негативна
1
0,5 *"——-«-» «-»
0 1 2 3 4 5 6 7 8 титрування кон'югату
Рис. 4. Титрування кон'югату жовткових антитш проти CP4 EPSPS, мчених пероксидазою хрону у конкурентному 1ФА 1з використанням позитивна ГМ-со1 (RoundUp Ready, 40-3-2) та негативна со1. Розведення кон'югату: 1 - 1/100; 2 - 1/200; 3 - 1/400; 4 - 1/800; 5 - 1/1600; 6 - 1/3200; 7 - 1/6400; 8 - 1/12800
Пюля того як нами було визначено титр кон'югату, який дозволяе впевнено дискришнувати 100 % позитивну ГМ-сою ввд негативно!, нами було проанал1зовано здатшсть розробленого конкурентного 1ФА к1льк1сно визначати р1зний вмют ГМО !з використанням референс стандартних зра-зк1в. Зпдно директиви ЕС1829/ 2003 вмют ГМО в негативних зра-зках не повинен перевищувати 0,9 %, що е певною межею нижче яко! визначення ГМО не мае сенсу, осшльки розглядаеться як випад-кове або техтчно неминуче [10].
В табл. 1 представлен! дан! кшьшсного визначення ГМ-со! у вадсотках шпбування (В1), за до-помогою розроблено! тест-системи при використанн! сертиф!кованих стандарпв у широкому концентра-ц!йному д!апазот (в!д 0,1-100 %). Продемонстровано, що межею для юльюсного визначення вмюту ГМО б!льше 1,0 % е значення 77,27±1,29 В1. Отриман! данш у 3-х повторах не перевищуе 10 %, що вказуе на в!дтворюван!сть розроблено! методики. При цьому р!зниця мгж 1,0 % стандартом ГМ-со! та нега-тивним зразком знаходиться в д!а-пазон! 20 % В1, що дозволяе впевнено дискрим!нувати негативний зразок со! ввд со! !з 1,0 % вмютом ГМ-со! (Roundup Ready, 40-3-2). При цьому ми не спостертали пе-рехресно! реактивност! !з зразками ГМ-со!, лшп А2704-12 толерантно! до шшого герб!циду - фосфшот-рицину.
Таблиця 1
Результати к!льк!сного визначення
ГМ-со! Roundup Ready, 40-3-2 за допомогою розроблено! методики конкурентного 1ФА
Рослина Матриця Л!н!я/сорт СВ1±СКВ* 1нтерпретащя, % ГМО
Референс ст.-т ERM-BF410а Roundup Ready (Бланк) 57,26±4,29 Негатив
Референс ст.-т ERM-BF410bk Roundup Ready 68,27±2,64 Позитив 0,1
Референс ст.-т ERM-BF410c Roundup Ready 70,49±1,27 Позитив 0,5
Референс ст.-т ERM-BF410dk Roundup Ready 77,27±1,29 Позитив 1,0
Соя Референс ст.-т ERM-BF410е Roundup Ready 85,40±1,99 Позитив 2,0
Референс ст.-т ERM-BF410f Roundup Ready 90,07±0,73 Позитив 5,0
Референс ст.-т ERM-BF410gk Roundup Ready 94,18±0,04 Позитив 10,0
Референс ст.-т AOCS 0906-B GenuityRoundup Ready 2 Yield 96,76±0,25 Позитив 100
Насшня Liberty Link 60,89±5,56 Негатив
Насшня «Черемош» 57,27±0,71 Негатив
Примтка: * - середтй В1 ± середньоквадратичне вiдхилення
а
6. Висновки
Таким чином, нами розроблений протокол шль-к1сного 1ФА i3 використанням жовткових антитш для виявлення ГМ-со! (Roundup Ready, 40-3-2), стшко! до гл1фосату з мшмальним граничним значениям 0,1 %.
З огляду на це розроблена методика пропонуеться як першорядний шструмеш' для скритнгу ГМ-со!, то-лераигноi до гафосату (Roundup Ready 40-3-2), яка вирощуеться на теренах Украни та стане при нагод1 впчизняним виробникам орган1чно! продукци «GMO-free» зпдно ISO 21572:2004 налагодити систему контролю та зайняти одне з провщних мюць в цш галуз1 [8].
Робота виконана в рамках НДР 110/31л-пр «Роз-робка 1муноферментних д1агностикум1в для виявлення та щентифжацп генетично модифжованих гербь цидостшких сшьськогосподарських рослин» № державно! реестрацп 00493706 №0113U00382
Лiтература
1. James, C. Global Status of Commercialized Bio-tech/GM crops: 2011. Vol. 43 [Text] / C. James. - ISAAA Brief. - Ithaca, N. Y., 2011. - 325 р. - Available at: http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/43/download/ isaaa-brief-43-2011 .pdf
2. Funke, T. Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops [Text] / T. Funke, H. Han, M. Healy-Fried, M. Fischer, E. Schonbrunn // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006. - Vol. 103, Issue 35. - P. 1301013015. doi: 10.1073/pnas.0603638103
3. Barry, G. Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases: United States Patent US5633435A [Text] / Barry G., Kishore G., Padgette S., Stallings W.; Assignee: Monsanto Company. - US 08/306,063; Filed: Sep. 13, 1994; Date of Patent: May 27, 1997. - 1997. - 154 p. - Available at: http://docs.google.com/viewer?url=patentimages. stor-age.googleapis.com/pdfs/US5633435.pdf
4. Шдсумки збору врожаю основних сшьськогоспо-дарських культур, плодш, ягiд та винограду у 2014 рощ [Електронний ресурс]. - Експрес-випуск Державно! служби статистики Украши, 2015. - Режим доступу: http://www. ukrstat.gov.ua/express/expr2015/01/06pdf.zip
5. Guyton, K. Z. Carcinogenicity of tetrachlorvinphos, par-athion, malathion, diazinon, and glyphosate [Text] / K. Z. Guyton, D. Loomis, Y. Grosse, F. El Ghissassi, L. Benbrahim-Tallaa, N. Guha et. al. // The Lancet Oncology. - 2015. - Vol. 16, Issue 5. - P. 490-491. doi: 10.1016/s1470-2045(15)70134-8
6. Постанова КМУ № 468 вщ 13.05.2009 р. «Про затвер-дження Порядку етикетування харчових продуктш, якi мiстять генетично модифжоваш оргатзми або виробленi з !х використанням та вводяться в обю> (зi змнами) [Електронний ресурс]. - Кабшет Мiнiстрiв Украши, 2009. - Режим доступу: http://zakon2.rada.gov.ua/laws/show/468-2009-%D0%BF
7. Наказ МОЗ № 971 вщ 09.11. 2010 р. «Перелж харчових продуктш, щодо яких здшснюетъся контроль вмтсту генетично модифжованих оргатзмш» [Електронний ресурс]. - Мшстерство охорони здоров'я Украши, 2010. - Режим доступу: http://zakon4.rada.gov.ua/laws/show/z1248-10
8. ISO 21572:2004 Foodstuffs - Methods for the detection of genetically modified organisms and derived products -Protein based methods [Text]. - Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization, 2004.
9. Pauly, D. IgY technology: extraction of chicken antibodies from egg yolk by polyethylene glycol (PEG) precipitation [Text] / D. Pauly, P. A. Chacana, E. G. Calzado, B. Brembs, R. Schade // Journal of Visualized Experiments. -2011. - Issue. 51. doi: 10.3791/3084
10. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed (Text with EEA relevance) [Electronic resource]. - Official Journal of the European Union. - 2003. - P. 0001-00023. - Available at: http://eur-lex.europa.eu/ legal-content/EN/TXT/?uri=celex:32003R1829
References
1. James, C. (2011). Global Status of Commercialized Biotech/GM crops: 2011. Vol. 43. ISAAA Brief. Ithaca, N. Y., 325. Available at: http://www.isaaa.org/resources/publications/ briefs/43/download/isaaa-brief-43-2011 .pdf
2. Funke, T., Han, H., Healy-Fried, M. L., Fischer, M., Schonbrunn, E. (2006). Molecular basis for the herbicide resistance of Roundup Ready crops. Proceedings of the National Academy of Sciences, 103 (35), 13010-13015. doi: 10.1073/ pnas.0603638103
3. Barry, G., Kishore, G., Padgette, S., Stallings, W. (1997). Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phospha-te synthases: United States Patent US5633435A. US 08/306,063; Filed: Sep. 13, 1994; Date of Patent: May 27, 1997, 154. Available at: http://docs.google.com/viewer?url=patent-images.storage. googleapis.com/pdfs/US5633435.pdf
4. Pidsumky zboru vrozhaju osnovnyh sil's'kogospodars'kyh kul'tur, plodiv, jagid ta vynogradu u 2014 roci (2015). Ekspres-vypusk Derzhavnoi' sluzhby statystyky Ukrai'ny. Available at: http://www.ukrstat.gov.ua/express/ expr2015/01/06pdf.zip
5. Guyton, K. Z., Loomis, D., Grosse, Y., El Ghissassi, F., Benbrahim-Tallaa, L., Guha, N. et. al (2015). Carcinogenicity of tetrachlorvinphos, parathion, malathion, diazinon, and glypho-sate. The Lancet Oncology, 16 (5), 490-491. doi: 10.1016/ s1470-2045(15)70134-8
6. Postanova KMU № 468 vid 13.05.2009 r. «Pro zatverdzhennja Porjadku etyketuvannja harchovyh produktiv, jaki mistjat' genetychno modyfikovani organizmy abo vyrobleni z i'h vykorystannjam ta vvodjat'sja v obig» (zi zminamy) (2009). Kabinet Ministriv Ukrai'ny. Available at: http://zakon2.rada.gov.ua/laws/show/468-2009-%D0%BF
7. Nakaz MOZ № 971 vid 09.11. 2010 r. «Perelik harchovyh produktiv, shhodo jakyh zdijsnjujet'sja kontrol' vmistu genetychno modyfikovanyh organizmiv» (2010). Ministerstvo ohorony zdorov'ja Ukrai'ny. Available at: http://zakon4.rada. gov.ua/laws/show/z1248-10
8. ISO 21572:2004 Foodstuffs - Methods for the detection of genetically modified organisms and derived products - Protein based methods (2004). Geneva, Switzerland: International Organization for Standardization.
9. Pauly, D., Chacana, P. A., Calzado, E. G., Brembs, B., Schade, R. (2011). IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation. Journal of Visualized Experiments, 51. doi: 10. 3791/3084
10. Regulation (EC) No 1829/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on genetically modified food and feed (Text with EEA relevance) (2003). Official Journal of the European Union, 0001-00023. Available at: http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/? uri=celex:32003R1829
Дата надходження рукопису 19.10.2015
Спиридонов Владислав Геннадшович, доктор сшьськогосподарських наук, заступник директора, Украшська лабораторiя якосп i безпеки продукцп АПК, Нащональний ушверситет бюресурав i приро-докористування Укра!ни, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Ки!в, Укра!на, 03041 E-mail: spyrydonov@ukr.net
Хоменко Ярослав Васильович, астрант, провщний фах1вець, Укра!нська лаборатор1я якосп i безпеки продукци АПК, Нацiональний ушверситет бiоресурсiв i природокористування Укра!ни, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Ки1в, Украша, 03041 E-mail: iarikkiev7@gmail.com
1щенко Вадим Дмитрович, кандидат ветеринарних наук, доцент, кафедра фармакологи та токсикологи, Нацюнальний ушверситет бюресурав i природокористування Укра!ни, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Кшв, Укра!на, 03041
E-mail: ischenko_vd@nubip.edu.ua
Гончаренко Василь Сергшович, старший науковий сшвробггник, Укра!нська лабораторiя якостi i безпеки продукци АПК, Нацюнальний ушверситет бюресурав i природокористування Украши, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Ки1в, Укра!на, 03041 E-mail: goncharenko_vs@ukr.net
Шимко Наталiя Микола!вна, старший науковий сшвробгтник, Укра!нська лабораторiя якостi i безпеки продукци АПК, Нацiональний ушверситет бюресурав i природокористування Укра!ни, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Ки1в, Украша, 03041 E-mail: natashim@ukr.net
Рибальченко Дмитро Юрiйович, науковий сшвробггаик, Украшська лаборатория якостi i безпеки про-дукцii АПК, Нацiональний ушверситет бюресурав i природокористування Укра!ни, вул. Геро!в Оборони, 15, м. Ки!в, Украша, 03041 E-mail: doctordimafish@gmail.com
УДК 608.5:577.171.4
DOI: 10.15587/2313-8416.2015.53805
ВПЛИВ Ф1ЗИКО-Х1М1ЧНИХ ФАКТОР1В НА ЗБЕРЕЖЕННЯ АКТИВНОСТ1 ХГЛ ВПРОДОВЖ ТРИВАЛОГО ЗБЕР1ГАННЯ В РОЗЧИНЕНОМУ ВИГЛЯД1
© Ю. I. Сливчук, I. О. Матюха, В. Я. Сирватка, I. I. Гевкан, О. В. Штапенко, Н. I. Брода
До^джено активнкть нових форм лтарських препаратiв стабтзованих гонадотропiнiв при тривало-му зберiганнi. Встановлено, що диспергування призводить до втрати 10-12 % активностi гонадо-тротну проте, тривалiсть диспергування на нег не впливае. Додам стабШзатори i лтосомальна форма препарату зберiгають активтсть ХГл при температурi 18-20 та 2-4 °С на рiвнi 80 % Ключовi слова: хорютчний гонадотротн, стабiлiзацiя, сахароза, L^imrn лiпосомальна емульая, актив-нкть гормону
The activity of new forms of drugs stabilized gonadotropins during prolonged storage was studied. It is established that dispersion leads to loss of 10-12 % the activity of gonadotropin, but the duration of dispersion is not affected. Added stabilizers and liposomal form of the drug maintains the hCG activity at a temperature of 18-20 °C and at 2-4 at the level near 80 %
Keywords: chorionic gonadotropin, stabilization, sucrose, L - lysine, liposomal emulsion, hormone activity
1. Вступ
У повсякденному процеа корекци безплщдя очевидним вагомим компонентом е гормональна стимуляция та терашя. Ранш вщкриття з виявлення фiзiологiчноi ди гонадотрошшв у нормальному цикт яечнишв спонукали багатьох вчених шукати гонадо-тропш екстракти достатньо! чистоти, щоб забезпечи-ти лжування безплщдя [1, 2]. Корекщя репродуктив-них процеав виникла з перших спроб отримати i очистити гонадотропш препарати тваринного i люд-ського походження. Першi спроби лiкування без-плщдя були зробленi майже 100 рошв назад. Еволю-цiйний процес розвитку гонадотропно! терапii був обумовлений необхвдшстю зробити гонадотропнi препарати безпечними, максимально очищеними i
ефективними не лише в лжуванш, але й в простоя використання, щоб звести до мшмуму безлiч можли-вих вщмшностей у лiкуваннi безплщдя [3].
2. Аналiз лiтературних даних та постановка проблеми
До групи гонадотрошшв ввдносять хорюшч-ний гонадотропiн (ХГ), фолiкулостимулюючий гормон (ФСГ; фолшэтрошн), люте1шзуючий гормон (ЛГ; лютропiн). ФСГ i ЛГ синтезуються гiпофiзом бшьшосл ссавцiв, тодi як ХГ синтезуеться плацента-рною тканиною приматiв i коней. В останнi роки, структура гонадотропних гормонiв була декодована для рiзних видiв риб, тварин i людини [1-7]. Молеку-ли гонадотрошшв рiзних видiв тварин i людини, во-
