CC BY
9К.К. Яцевич, Д.П. Бажанов
КОНСТРУИРОВАНИЕ IN VITRO РЕКОМБИНАНТНЫХ ШТАММОВ-
ДЕСТРУКТОРОВ СИМАЗИНА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220027, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Широкое применение хлорированных симм-триазинов (симазин, атразин, пропазин) в качестве эффективных средств борьбы с сорняками в практике интенсивного земледелия привело к накоплению их в обрабатываемых почвах, затруднив или сделав невозможным чередование культур [1]. Эти соединения крайне медленно разлагаются естественными сообществами микроорганизмов. Поэтому проблема восстановления загрязненных симм-триазинами почв остается актуальной и в настоящее время. Перспективным подходом для очистки загрязненных почв представляется применение биопрепаратов на основе микроорганизмов, осуществляющих минерализацию симм-триазинов. Для этих целей возможно также использование рекомбинантных штаммов-деструкторов [2].
Ранее из ризосферы кукурузы была изолирована бактерия Herbaspirillum huttiense В601, способная к деградации симм-триазиновых гербицидов благодаря присутствию генов smzA, -B и -C, локализованных на крупной плазмиде и гомологичных соответственно генам atzА, -В, и -С из Pseudomonas sp. ADP [3]. Известно, что плазмида утилизации атразина бактерии Pseudomonas sp. ADP легко перено-
сится и экспрессируется в E.coli [4], а ключевые гены его деградации у различных бактерий обладают высокой степенью сходства [5]. Гены smzA, -B и -C при конъюгации передаются из штамма Herbaspirillum huttiense В601 в его Smz- производные как за счет мобилизации второй резидентной плазмидой меньшего размера, так и с помощью плазмиды pSa [6, 7]. Тем не менее, конъюгационный перенос способности утилизовать симазин из H. huttiense В601 в неродственные грамотрицательные бактерии оказался затруднительным [8]. В ходе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей установлена высокая степень сходства структурных областей smz и atz генов и выявлены существенные различия между промоторными областями генов smzB и atzB [9]. Скорее всего, именно особенности функционирования регуляторной области гена smzB затруднили его экспрессию в неродственных штамму H. huttiense В601 хозяевах и привели к невозможности утилизировать симазин при переносе in vivo.
Целью данной работы было получение in vitro рекомбинантных штаммов-деструкторов симазина и исследование экспрессии smz генов такими бактериями.
Материалы и методы
В работе использовали штаммы бактерий: E.coli DH5a, E.coli C600, несущий плазми-ду pRK600, Herbaspirillum huttiense В601, Herbaspirillum frisingense B416, Burkholderia sp. 418; плазмиды: pCB182 (Apr) для клонирования промоторов в клетках E. coli [10], pBluescript II KS (+) (Apr) для клонирования фрагментов ДНК в клетках E. coli [11], са-моэлиминирущийся вектор pUT-Km1 (Apr, Kmr) для клонирования последовательностей в пределах транспозона Tn5 и включения гибридной конструкции в хромосому различных
грамотрицательных бактерий [12]. Использованные в работе праймеры представлены в табл. 1.
Культуры E.coli выращивали в среде L (трип-тон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl -5 г/л) при 37 °С. Культуры Herbaspirillum spp., Burkholderia sp. выращивали в среде TY (трип-тон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л, CaCl2 -0,2 г/л) или среде Г (глюкоза - 4 г/л, глютаминовая кислота - 50 мг/л, KH2PO4 - 0,5 г/л, MgSO4 -0,2 г/л, NaCl - 0,2 г/л, CaCl2 - 0,02 г/л, Fe-ЭДТА -0,066 г/л, Na2MoO4 - 0,002 г/л, H3BO3 - 0,03 г/л,
ZnSO4•7H2O - 0,022 г/л, СоЗО^7Н2О - 0,014 г/л, при 28 °С. Для получения твердых сред исполь-CuSO4•5H2O - 0,001 г/л, МпС12-4Н20 - 0,0008 г/л) зовали бактериологический агар Difco (15 г/л).
Таблица 1
Характеристика использованных в работе праймеров
Праймер Название праймера Оптимальная T, °С
ProAf 5' TTGAACTCGGGGAACTTCTTGA 3' 55
ProAr 5' GATATGTATCCAATAGTGTGTTACACGT 3' 55
atzAfull-f 5' TGGAGACATATCATGCAAACGC 3' 55
atzAfull-r 5' AGCAACGGCGTCATTTCCTAG 3' 55
PROsmzBf_l 5' GCATGTACGCCTTGCGCAT 3' 60
ProBr 5' GGTGGTTGCTCCCGTCGAATC 3' 60
pCB182f 5' GCAGAACGAAACCGTCG 3' 55
pCB182r 5' CCTTTCATTATTAATACCCTCTAGC 3' 55
ERIC2 5' AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG 3' 51
Культуры E.coli выращивали в среде L (трип-тон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, №С1 -5 г/л) при 37 °С. Культуры Herbaspirillum spp., Burkholderia sp. выращивали в среде TY (трип-тон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л, СаС12 -0,2 г/л) или среде Г (глюкоза - 4 г/л, глютаминовая кислота - 50 мг/л, КН2Р04 - 0,5 г/л, MgSO4 -0,2 г/л, №С1 - 0,2 г/л, СаС12 - 0,02 г/л, Fe-ЭДТА -0,066 г/л, №2Мо04 - 0,002г/л, Н3ВО3 - 0,03 г/л, ZnSO4•7H2O - 0,022 г/л, СоЗО^^О - 0,014 г/л, ^О45Н2О - 0,001 г/л, МпС12-4Н20 - 0,0008 г/л) при 28 °С. Для получения твердых сред использовали бактериологический агар Difco (15 г/л).
Исследование дехлорирования симазина штаммами E.coli проводили в среде следующего состава: глюкоза - 4 г/л, Ш2НРО4 - 6 г/л, КН2РО4 - 3 г/л, №4)2ЗО4 - 12,3 г/л, MgSO4 -0,12 г/л, триптон - 0,1 г/л, дрожжевой экстракт - 0,01 г/л, симазин - 1 г/л, а для штаммов Herbaspirillum spp. и Burkholderia sp. использовали среду состава: глюкоза - 4 г/л, глютами-новая кислота - 50 мг/л, К2НРО4 - 0,5 г/л, Mg-ЗО4 - 0,2 г/л, СаЗО4 - 0,02 г/л, триптон - 0,1 г/л, дрожжевой экстракт - 0,01 г/л, симазин - 1 г/л.
Наработку фрагментов с smz генами из Нег-baspirillum huttiense В601 осуществляли с помощью ПЦР с использованием праймеров, перечисленных в табл. 1. С помощью ПЦР-анализа с использованием праймеров pCB182f и рС-В182г обнаруживали наличие рекомбинантных плазмид в клетках трансформантов при клонировании промоторных участков smz генов из Herbaspirillum huttiense В601 в вектор рСВ182.
Реакционная смесь (30 мкл) содержала 3 мкл 10Х буфера (Диалат Ltd., Россия), 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 60 пкмолей каждого из пары праймеров, 1 единицу BioTaq-полимеразы (Диалат Ltd., Россия), 100 нг общей ДНК или 1мкл лизата клеток в качестве матрицы.
ПЦР проводили в термоциклере MJ MiniTM (Bio-Rad) по схеме: первоначальное инкубирование реакционной смеси при 95 °С в течение 4 мин; затем 30 циклов, состоящих из инкубаций: 95 °С - 30 с, отжиг при оптимальной температуре для праймеров - 30 с, 72 °С - 2 мин; и завершающее инкубирование смеси при 72 °С в течение 10 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле.
Генетическое типирование бактерий осуществляли с помощью ERIC-ПЦР, придерживаясь ранее изложенной нами методики [13].
Плазмидную ДНК из бактерий E. coli выделяли методом щелочного лизиса [14]. Рестрикцию плазмидной ДНК, довешивание T-концов, обработку полимеразой T4, фосфатазой и последующее лигирование фрагментов осуществляли в условиях, рекомендуемых фирмой-изготовителем ферментов MBI Fermentas (Литва). Трансформацию бактерий E. coli проводили согласно рекомендациям, приведенным в руководстве J. Sambrook et al. [15].
Трехродительские скрещивания проводили на твердой среде TY в соответствии с ранее приведенной методикой [16]. Для отбора трансконъюгантов полученную суспензию и
ее последовательные разведения высевали на селективную среду Г с добавлением канами-цина (Кт) - 30 мкг/мл.
Продукт трансформации симазина бактериальными культурами определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Непосредственно ВЭЖХ-МС анализ выполняли сотрудники НИЛ физико-химических методов исследований Белорусского государственного технологического университета. Подготовка проб для ВЭЖХ-МС анализа проводилась нами. Питательную жидкую TY среду объемом 0,3 мл с концентрацией симазина 1 г/л инокулировали свежей тестируемой суточной культурой в соотношении 1:100 и инкубировали в термостате при 28 °С в течение 5 дней. После окончания инкубирования культур высушивали культуральную жидкость с клетками досуха. Сухой остаток подвергали экстракции этиловым спиртом объемом 2 мл в течении ночи. После спиртовой экстракции образцы центрифугировали 10 мин при 8000 об/
мин и отбирали по 1 мл супернатанта в новую пробирку. Спиртовой экстракт высушивали досуха и отдавали на ВЭЖХ-МС анализ.
Для исследования дехлорирования симазина бактериальными штаммами ночные культуры бактерий инокулировали в соотношении 1:100 в свежие жидкие среды и инкубировали в течение 7 дней при 28 °С. Пробы культуральной жидкости объемом 20 мл отбирали через каждые сутки с соблюдением правил асептики. Перед проведением измерения клетки отделяли от культу-ральной жидкости центрифугированием при 8000 об/мин в течение 5 мин. Затем проводили измерения величины электродвижущей силы (ЭДС) культуральной жидкости на ионометре ЭВ-74, оснащенном хлорселективным электродом. Для построения калибровочного графика готовили стандартные растворы KCl с концентрациями в моль/ кг H2O: 3-10"4, 5-10"4, Ы0"3, 1 • 10-2, 1 • 10-1, 1,0. График зависимости значений потенциометра от концентрации Cl-ионов был линейным во всем интервале концентраций.
Результаты и обсуждение
На первом этапе работы изучали промотор- На втором этапе работы выясняли влияние ную активность вышележащих участков ге- промоторных областей на экспрессию smzA нов smzA и smzB из бактерии Herbaspirillum гена в неродственных бактериях путем иссле-huttiense B601 в клетках E. шli. С этой целью дования активности считывания данного гена получили серию генетических конструкций с индуцибельного промотора лактозного опе-на основе вектора pCB182, где вышележащие рона Plac и с собственного промотора в клет-фрагменты открытых рамок считывания ге- ках E. coli. С этой целью была получена серия нов smzA и smzB были клонированы по сайту генетических конструкций на основе вектора SmaI перед репортерным геном lacZ. Для этого pBluescript II KS(+), где полноразмерный ген амплификаты, полученные с использованием smzA штамма H. huttiense B601 в клетках E.coli праймеров ProAf и ProAr (240 п.о.), ProBf_l DH5a считывался с собственного промотора и ProBr (398 п.о.) и геномной ДНК штамма либо с индуцибельного промотора лактозно-H. huttiense В601, лигировали с линеаризо- го оперона P Для этого амплификаты, полуванным рестриктазой SmaI вектором pCB182, ченные с использованием праймеров ProAf и к которому с помощью Taq-полимеразы бы- atzAfull-r (1665 п.о.) или atzAfull-f и atzAfull-r ли довешены тиминовые концы. С помощью (1425 п.о.) и геномной ДНК штамма H. huttiense сине-белого теста в клетках E. coli DH5a бы- В601, лигировали с линеаризованным рестрик-ла продемонстрирована промоторная актив- тазой EcoRv вектором pBluescript II KS(+), к ность только для вышележащего фрагмента которому с помощью Taq-полимеразы были открытой рамки считывания гена smzA штамма довешены тиминовые концы. Полученные ре-H. huttiense B601, но не для соответствующего комбинантные плазмиды были обозначены как участка гена smzB. Скорее всего, именно осо- pBl-Afull-F (вставка полноразмерной открытой бенности функционирования регуляторной об- рамки считывания гена smzA штамма H. hut-ласти гена smzB затруднили его экспрессию в tiense В601 в прямой ориентации к промотору неродственных штамму H. huttiense B601 бак- лактозного оперона P), pBl-Afull-R (вставка териях и привели к невозможности утилизиро- полноразмерной открытой рамки считывания вать симазин при конъюгационном переносе. гена smzA штамма H. huttiense В601 в обратной
ориентации к промотору лактозного оперона Р1ас), рВ1-РшАШ1-Р (вставка полноразмерного гена smzA с собственным промотором штамма H. huttiense В601 в прямой ориентации к промотору лактозного оперона Р) и рВ1-РгоА&11-К (вставка полноразмерного гена smzA с собственным промотором штамма H. huttiense В601 в обратной ориентации к промотору лактозного оперона Р1ас). Клоны, несущие рекомбинантные плазмиды, были реплицированы на TY среды с симазином (2 г/л) с отсутствием или добавлением изопропил-Р^-1 -тиогалактопиранозида
(ИПТГ) для индукции экспрессии трансгена с промотора Р и ее визуализации (рис. 1). Проявление Smz+ фенотипа у трансформантов E.coli DH5a, несущих гибридные плазмиды рВ1-АМ-^ рВ1-РгоАМ-Р и рВ1-РгоАМ-К, наблюдали на 4-5 день инкубации. Особенностью фенотипического проявления активности гена smzA было просветление среды с образованием непрозрачной зоны под Smz+ колониями за счет накопления гидроксисимазина, образуемого в ходе реакции гидролитического дехлорирования симазина (рис. 1).
плазмида pBl-ProAfull-R без добавления ИПТГ плазмида pBl-ProAfull-R с добавлением ИПТГ плазмида pBl-ProAfull-F без добавления ИПТГ
плазмида рВ1-РгоАШ1^ с добавлением ИПТГ плазмида рВ1-РгоАШ1^ без добавления ИПТГ
плазмида рВ1-РгоАШ1^ с добавлением ИПТГ плазмида рВ1-РгоАШ1^ без добавления ИПТГ плазмида рВ1-РгоАШ1^ с добавлением ИПТГ
Рис. 1. Экспрессия гена smzA из Herbaspirillum huttiense B601 с различных промоторов в клетках E. coli: а - реплики клонов трансформантов E.coli DH5a, несущих гибридные плазмиды на основе вектора pBluescript II KS(+), пятый день инкубации; б - те же реплики клонов трансформантов E.coli DH5a, что и в столбце а,
но с удаленной биомассой бактерий
Как и ожидалось, экспрессия гена smzA с собственного промотора в клетках E.coli DH5a наблюдалась независимо от наличия или отсутствия ИПТГ в среде и ориентации клонированной последовательности по отношению к промотору Р1ас (рис. 1).
В результате исследования хлорогидролаз-ной активности показано, что конститутивная экспрессия гена smzA с собственного промотора в клетках E.coli DH5a идет на уровне не ниже такового, обеспечивающегося промотором Р1ас после его индукции ИПТГ (табл. 2).
Таблица 2
Динамика дехлорирования симазина
Вариант День
0 3 5 7
Среда без инокуляции Высвобождение ионов С1-, ммоль/л 0 0 0 0
% трансформации симазина 0 0 0 0
Herbaspirillum huttiense B601 Высвобождение ионов С1-, ммоль/л 0 1,58±0,05 2,22±0,05 2,36±0,05
% трансформации симазина 0 31,9±1 44,8±1 47,7±1
E.coli pBluescript II KS+ Высвобождение ионов С1-, ммоль/л 0 0 0 0
% трансформации симазина 0 0 0 0
E.coli pBl-Afull-F (с добавлением ИПТГ) Высвобождение ионов С1-, ммоль/л 0 1,16±0,05 1,16±0,05 1,16±0,05
% трансформации симазина 0 23,4±1 23,4±1 23,4±1
Продолжение табл. 1
Вариант Д ень
0 3 5 7
E.coli pBl-ProAfull-F (без добавления ИПТГ) Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 1,82±0,05 2,22±0,05 2,22±0,05
% трансформации симазина 0 36,8±1 44,8±1 44,8±1
E.coli pUT-Km1 Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 0 0 0
% трансформации симазина 0 0 0 0
E.coli pUT-smzA Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 2,22±0,05 2,51±0,05 2,51±0,05
% трансформации симазина 0 44,8±1 50,7±1 50,7±1
Herbaspirillum frisingense B416 Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 0 0 0
% трансформации симазина 0 0 0 0
Herbaspirillum frisingense B416-smzA Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 2,08±0,05 2,08±0,05 2,22±0,05
% трансформации симазина 0 42±1 42±1 44,8±1
Burkholderia sp. 418 Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 0 0 0
% трансформации симазина 0 0 0 0
Burkholderia sp.418-smzA Высвобождение ионов Cl-, ммоль/л 0 1,26±0,05 2,36±0,05 2,51±0,05
% трансформации симазина 0 25,5±1 47,7±1 50,7±1
Для переноса в биотехнологически ценные штаммы Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum frisingense B416 способности трансформировать симазин была сконструирована самоэлиминирующаяся плазмида pUT-smzA, где ген smzA из H. huttiense B601, находящийся под контролем собственного промотора, был клонирован по сайту NotI вектора pUT-Km 1 в состав транспозо-на Tn5. Перенос гена хлорогидролазы симазина в штаммы Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum
frisingense B416 осуществляли методом трехро-дительских скрещиваний, используя в качестве «помощника» штамм E.coli С600, несущий плаз-миду pRK600. Культуры Kmr трансконъюгантов Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum frisingense В416 были реплицированы на поверхность TY агара с симазином (2 г/л). Под всеми реплици-рованными клонами трансконъюгантов обнаруживали зоны просветления среды в результате трансформации симазина (рис. 2).
г«' J ***• »i. /
1 А Б A Б J
Burkholderia sp. 418 Smz+ производный
Burkholderia sp. 418
V>
1 А Б 1 A Б
Herbaspirillumfrisingense В416 Smz+ проюводный
Herbaspirillum frisingense В416
Рис. 2. Экспрессия гена smzA из Herbaspirillum huttiense B601 в клетках Smz+ производных Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum frisingense В416: а - реплики клонов на агаризованной среде TY с симазином, пятый день инкубации; б - те же реплики клонов, что и в столбце а, но с удаленной биомассой бактерий
Для подтверждения наличия в геноме Smz+ трансконъюгантов Burkholderia sp. 418 и Her-baspirillum frisingense В416 гена симазинхлор-
гидролазы (smzA) из Herbaspirillum huttiense B601 использовали геноспецифичную ПЦР с праймерами ProAf и atzAfull-r. (рис. 3а).
Рис. 3. ПЦР-анализ Smz+ производных Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum frisingense В416: а - электрофоре-грамма продуктов амплификации с праймерами ProAf и atzAfull-r; б - генотипирование с помощью Rep-ПЦР
с использованием праймера ERIC2. Дорожки: 1 - штамм Burkholderia sp. 418; 2-3 - Smz+ производные Burkholderia sp. 418; 4 - штамм Herbaspirillum frisingense В416; 5-6 - Smz+ производные Herbaspirillum frisingense В416; М - маркер молекулярной массы Gene Ruler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas); К - контроль без добавления матрицы
Для всех протестированных Smz+ клонов было характерно появление на электрофоре-грамме специфического фрагмента длиной 1665 п.о., что свидетельствовало о присутствии целевого трансгена в геноме Smz+ трансконъюгантов ВтШо^па sp. 418 и Herbaspirillum frismgeme В416 (рис. 3а). Генотипирование с помощью праймера ЕЫС2 Smz+ трансконъюгантов Burkholderia sp. 418 и Herbaspirillum frisingense В416 подтвердило соответствующую родовую принадлежность отобранных Smz+ клонов (рис. 3б). Полученные Smz+ производные штаммов Burkholderia sp. 418 и Нег-baspirillum frisingense В416 были обозначены как Вт^о^та sp. 418-smzA и Herbaspirillum frisingense В416-smzA, соответственно.
При росте культур ВигШо^па sp. 418-smzA и Herbaspirillum frisingense В416-smzA в TY среде без селективного давления (отсутствовал симазин и канамицин) сохранялась 100% наследуемость способности к трансформации симазина и через 20 пассажей.
С помощью хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС) подтвердили образование ги-
дроксисимазина при трансформации симазина рекомбинантными штаммами Burkholderia sp. 418-smzA и Herbaspirillum frisingense В416-smzA (рис. 4).
В результате исследования хлорогидролаз-ной активности показано, что рекомбинант-ные штаммы Burkholderia sp. 418-smzA и Herbaspirillum frisingense B416-smzA, как и бактерия Herbaspirillum huttiense В601, трансформируют до 50% содержащегося в среде симазина в течении 5 суток (табл. 2).
Известно, что штаммы Herbaspirillum fris-ingense В416 и Вт^о^На sp. 418 обладают способностью к конкурентному заселению корней различных сельскохозяйственных культур, низкотемпературной фиксации молекулярного азота и стимуляции роста растений. Перенос гена smzA из Herbaspirillum huttiense В601в штаммы ВигШо^па sp. 418 и Herbaspirillum frismgeme В416 определяет у них новое свойство - способность трансформировать симазин в менее токсичный продукт, что позволяет использовать данные штаммы для биоремедиации загрязненных симм-триазинами почв.
Рис. 4. Хроматограммы экстрактов культуральной среды после 5 дней инкубации штаммов: а - E.coli pUT-smzA; б - Burkholderia sp. 418-smzA; в - Herbaspirillum frisingense B416-smzA
Заключение
Таким образом, исследована экспрессия генов катаболизма симазина бактерии Herbaspirillum huttiense B601 в клетках E. coli. Продемонстрирована конститутивная экспрессия гена симазинхлоргидролазы с собственного промотора в клетках гетерологичных хозяев. На основе хозяйственно-ценных бактерий скон-
струированы in vitro рекомбинантные штаммы-деструкторы симазина Burkholderia sp. 418-smzA и Herbaspirillum frisingense B416-smzA. Придание указанным штаммам способности дехлорировать симазин расширяет спектр их полезных качеств, что дает возможность применять их и на загрязненных симм-триазинами почвах.
Список использованных источников
1. Коляда, Т.И. Токсическое последействие симазина и атразина на сельскохозяйственные культуры/ТИ. Коляда,Н.И. Туренков,И.А. Добровольская // Почвоведение и агрохимия: сб. науч. трудов. - Вып. 25. - Минск: Ураджай, 1989. - C. 122-127.
2. Field-scale remediation of atrazine contaminated soil using recombinant Escherichia coli expressing atrazine chlorohydrolase / L.S. Strong [et al.] // Environ. Microbiol. - 1999. - № 2 -P. 91-98.
3. Бажанов, Д.П. Плазмидная локализация генов деградации хлорированных симм-триазинов / Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова // Тез. межд. симп. «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (18-21 ноября 2001 г., г. Москва; 22-24 ноября 2001 г., г. Минск). - Минск, 2001. - С. 11-13.
4. De Souza, M.L. The atzABC genes encoding atrazine catabolism are located on a self-transmissible plasmid in Pseudomonas sp. strain ADP / M L. de Souza, L P. Wackett, M.J. Sa-dowsky // Appl. Environm. Microbiol. - 1998. -V. 64. - P. 2323-2326.
5. The atrazine catabolizm genes atzABC are widespread and highly concerved / M.L. de Souza [et al] // J. Bacteriol. - 1998. - V. 180. -P. 1951-1954.
6. Бажанов, Д.П. Плазмиды ризосферной бактерии В601, утилизирующей симазин / Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова // Генетика и селекция в XXI веке: мат. VIII съезда генетиков и селекционеров Республики Беларусь. Минск, 23-25 июля 2002 г. - Минск, 2002. -С. 239.
7. Бажанов, Д.П. Мобилизация генов деградации симазина плазмидой pSa / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич // Цитология и генетика. -2007, № 1. - С. 16-22.
8. Яцевич, К.К. Перенос способности утилизировать симазин в грамотрицательные
бактерии при конъюгации. / К.К. Яцевич, Д.П. Бажанов // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: мат. межд. конф. (26-28 мая 2004 г., Минск) - г. Минск, 2004. - С. 176-177.
9. Яцевич, К.К. Сравнительная характеристика генов катаболизма симазина ризосферной бактерии Herbaspirillum sp. B601 / К.К. Яцевич, Д.Г. Ярмолинский, Д.П. Бажанов // Весц НАН Беларуси Сер бiял. навук. - 2006, № 5. - С. 238-244.
10. Schneider, K. Promotor-probe vectors for the analysis of divergently arranged promoters / K. Schneider, C.F. Beck // Gene. - 1986. -Vol. 42. - P. 37-48.
11. Alting-Mees, M.A. pBluescript II: gene mapping vectors / M.A. Alting-Mees, J.M. Short // Nucl. Acids Res. - 1989. - V. 17 - P. 9494.
12. Mini-Tn5 transposon derivatives for insertion mutagenesis, promoter probing, and chromosomal insertion of cloned DNA in gramnegative eubacteria / V. Lorenzo [et al.] // J. Bacteriol. - 1990. - V. 172. - P. 6568-6572.
13. Бажанов, Д.П. Филогенетическая идентификация трех штаммов ризосферных бактерий на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и генетического типирования / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич, А.А. Бажанова // Микробиология. 2010. - Т. 79. № 3. - С. 394-404.
14. Birnboim, H.L. A rapid alkaline extraction procedure for screening of recombinant plasmid DNA / H.L. Birnboim, J. Doly // Nucl. Acids. Res. - 1979. - Vol. 7. - P. 1513-1523.
15. Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. / J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis / Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Publications, NY - 1989. - 468 p.
16. Бажанов, Д.П. Экспрессия гена nifA Klebsiella pneumoniae в диазотрофных ризо-бактериях / Д.П. Бажанов, Н.А. Троицкий // Генетика - 1992. - T. 28, № 10. - С. 40-47.
Дата поступления статьи 26 июня 2013 г.
