CC BY
6УДК 573.6:579.64.071
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич
конъюгационный перенос генов деградации симазина
HERBASPIRILLUMHUTTIENSE в601 в родственные бактерии
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Хлорированные симм-триазиновые гербициды (симазин, атразин, пропазин) десятилетиями использовались в борьбе с сорняками на посевах кукурузы, ряда полевых и овощных культур. Широкое применение хлорированных симм-триазинов в практике интенсивного земледелия привело к их накоплению в обрабатываемых почвах, затруднив или сделав невозможным чередование культур [1]. Длительное использование этих гербицидов приводит к их проникновению в грунтовые воды [2]. Перспективный подход для восстановления загрязненных почв — применение биопрепаратов на основе микроорганизмов, осуществляющих минерализацию симм-триазинов, в том числе -рекомбинантных штаммов-деструкторов [3].
Ранее из ризосферы кукурузы нами была изолирована бактерия Herbaspirillum НиШете В601, способная к деградации симм-триазиновых гербицидов благодаря присут-
ствию генов smzA, -B и -C, локализованных на крупной плазмиде и гомологичных соответственно генам atzА, -В, и -С из Pseudomonas sp. ADP [4]. Известно, что плазмида утилизации атразина бактерии Pseudomonas sp. ADP легко переносится и экспрессируется в E.coli [5], а ключевые гены его деградации у различных бактерий обладают высокой степенью сходства [6]. Гены smzA, -B и -C при конъюгации передаются из штамма В601 в его Smz- производные как за счет мобилизации второй резидентной плазмидой меньшего размера, так и с помощью плазмиды pSa [7,8]. Тем не менее, перенос способности утилизовать симазин из H. huttiense В601 в неродственные грамотрица-тельные бактерии оказался затруднительным [9]. Целью данной работы было исследование закономерностей конъюгационного переноса smz генов H. huttiense В601 в бактерии других видов рода Herbaspirillum.
Материалы и методы
При проведении скрещиваний в качестве донора использовали минерализующую симазин бактерию Herbaspirillum huttiense В601 (дикий тип), в качестве реципиентов - спонтанные устойчивые к рифампицину (ШР) мутанты штаммов Herbaspirillum ЬпШете DSM 10281Т, Herbaspirillum seropedicae А95, Herbaspirillum seropedicae А57, Herbaspirillum seropopodicae SmcI [10] и Herbaspirillum frismgeme В416 [11].
Культуры бактерий рода Herbaspirillum выращивали в среде TY (триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 1 г/л, СаС12 - 0,2 г/л, рН 7,0) или S (глюкоза - 4 г/л, симазин - 0,5 г/л, К2НР04 -0,5 г/л, MgSO4•7H2O - 0,2 г/л, СаС12 - 0,02 г/л, рН 7,3-7,5) при 28°С. Для получения твердых сред использовали бактериологический агар Difco (15 г/л) или аналогичного качества.
Скрещивания проводили на твердой среде ТТ Смешивали свежие суточные культуры
донора и реципиента в логарифмической фазе роста в соотношении 1:10 и 50 мкл смеси переносили на стерильный фильтр Millipore (0 ~ 0,2ц), помещенный на поверхность среды. После инкубирования чашек при 28 °С в течение ночи бактерии с фильтров смывали 0,1 М раствором MgSO4. Для отбора трансконъю-гантов полученную суспензию и ее последовательные разведения высевали на селективную среду S с добавлением 50 мкг/мл рифампицина.
Идентификацию плазмид осуществляли по модифицированной методике Экхардта [12]. Очищенную ДНК плазмид получали путем ее вырезания из 0,7% агарозного геля и дальнейшей экстракции с помощью GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech).
Присутствие генов деградации симазина в плазмидной ДНК обнаруживали с помощью ПЦР, используя предложенные de Souza специ-
фичные праймеры [6]. Нуклеотидные последовательности, обладающие сходством с геном pilA из Pseudomonasputida WCS358 [13] обнаруживали с помощью ПЦР, используя праймеры pilAf (5' TCACCCTGATCGAACTGATG 3'), pilA-1r (5' GGTGCAGCCCCACCC 3') и pilA-3r (5' ATGGCTGTCTTCAGCGC 3').
Реакционная смесь (30 мкл) содержала 3 мкл 10Х буфера (Диалат Ltd., Россия), 200 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 60 пкмолей каждого из пары праймеров, 1 единицу BioTaq-полимеразы (Диалат Ltd., Россия) и 10 нг очищенной ДНК плазмид в качестве матрицы.
ПЦР проводили в термоциклере MJ MiniTM ("Bio-Rad") по следующей схеме: первичная
денатурация - 95 оС в течение 4 минут; затем 30 циклов, состоящих из инкубаций: 95 оС -30 секунд, 55 оС (65 оС при амплификации зшгЕ) - 30 секунд, 72 оС - 2 минуты; и завершающая элонгация - 72 оС в течение 10 минут. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле.
Генетическое типирование бактерий осуществляли с помощью ERIC-ПЦР, придерживаясь ранее изложенной нами методики [11].
Элиминацию Smz+ фенотипа при росте культур трансконъюгантов в бульоне TY определяли высевом на агар S. Smz- колонии отличались меньшими размерами и отсутствием зоны растворения суспензии симазина.
Результаты и обсуждение
В скрещиваниях между Smz+ штаммом H. huttiense В601 и Rif мутантами бактерий рода Herbaspirillum Smz+Rif трансконъюган-ты выявлялись лишь при использовании в качестве реципиента штамма H. huttiense DSM 10281T Частота переноса способности утилизировать симазин при этом составляла около 10-6 на клетку реципиента. Возникновение спонтанных Rifr мутантов донора наблюдали с частотой около 10-8, что в 100 раз меньше
частоты появления колоний Smz+ Rif транс-конъюгантов, морфологически неотличимых от колоний донора. В результате генотипиро-вания с помощью ERIC-ПЦР было установлено, что фингерпринты всех проверенных Smz+ Rif бактерий и реципиента полностью совпадали, но отличались от фингерпринтов донора присутствием дополнительного дифференцирующего единичного фрагмента размером около 1000 п.н. (рис. 1).
Д Р Т1Т2Т3Т4Т5М Т6 Т7 Т8 Т9Т10Т11 Д Р
Рис. 1. Генотипирование штаммов H. huttiense DSM 10281T (Р), H. huttiense В601 (Д) и Smz+ Rif трансконъюгантов (Т1-Т11) с помощью ERIC-ПЦР Дорожки: Д - донор H. huttiense В601; Р - реципиент H. huttiense DSM 10281T; Т1-Т10 — Smz+ Rif" трансконъю-ганты. Резидентные плазмиды донора: Smz — плазмида деградации симазина (210 т.п.н.); R2 — трансмиссивная плазмида (60 т.п.н.). М — маркер молекулярной массы - Gene Ruler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва).
При идентификации плазмид у всех Smz+ Rif" (рис.2). При этом в геноме реципиента при-
трансконъюгантов выявлялась крупная плаз- сутствия плазмид обнаружено не было, а у
мида размером около 210 т.п.н., что соот- донора выявлялись обе характерные для него
ветствовало размеру Smz плазмиды донора плазмиды [7].
Рис. 2. Идентификация плазмидной ДНК родительских штаммов и трансконъюгантов Дорожки: Д - донор H. huttiense В601; Р - реципиент H. huttiense DSM 10281T; Т1-Т10 — Smz+ Rif" трансконъю-ганты. Резидентные плазмиды донора: Smz — плазмида деградации симазина (210 т.п.н.); R2 — трансмиссивная плазмида (60 т.п.н.).
Д Р Т1 Т2 Т3 Т4 Т5 Т6 Т7 Т8 Т9 Т10
R2
Smz
В результате проведения геноспецифичной ПЦР амплификация всех трех фрагментов, соответствующих центральным областям генов ШгА, -В и -С, происходила лишь при использовании в качестве матрицы ДНК плаз-мид Smz+ Rifr трансконъюгантов либо Smz
плазмиды донора H. ИпШете В601 (рис. 3). Таким образом, появление у трансконъюган-тов способности к утилизации симазина в качестве единственного источника азота было обусловлено переносом плазмиды, несущей все три ключевые гены его деградации.
Рис. 3. Обнаружение генов деградации симазина в плазмидной ДНК с помощью ПЦР В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмид R2 (дорожки 1-3) и Smz донора H. huttiense В601 (дорожки
4-5), ДНК плазмиды Smz+ трансконъюгантов T1 (дорожки 8-10), T2 (дорожки 11-13), T3 (дорожки 14—16), Т4 (дорожки 17-19), Т5 (дорожки 20-22), Т6 (дорожки 23-25), Т7 (дорожки 26-28), Т8 (дорожки 30-32), Т9 (дорожки 33-35), Т10 (дорожки 36-38). Для анализа использовали специфичные праймеры к генам smzA (дорожки 1, 4, 8, 11, 14, 17, 20, 23, 26, 30, 33, 36), smzB (дорожки 2, 5, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 31, 34, 37), smzC (дорожки 3, 6, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28, 32, 35, 38). Дорожки 7 и 29 - маркер молекулярной массы - Gene Ruler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва).
При росте в среде с легко доступными ис- ность утилизировать симазин с частотой около точниками азота Smz+ Rifr трансконъюганты 5-6% за пассаж, что в 3-5 раз превышало ча-штамма H. huttiense 10281T теряли способ- стоту спонтанной элиминации этого признака
у бактерии Н. huttiense В601 дикого типа [4, 7].
Электрофоретический анализ независимых Smz- производных трансконъюгантов штамма Н. НиШеже 10281Т установил, что у всех исследованных штаммов потеря способности к утилизации симазина сопровождалась уменьшением размера приобретенной плаз-
миды, выраженным в различной степени (рис. 4). У двух из шестнадцати проанализированных Smz- производных размер уменьшенной приобретенной плазмиды соответствовал размеру трансмиссивной плазмиды донорного штамма Н. НиШете В601 (рис. 4, дорожки Э5, Э6).
Т1 Д Д Э1 Э2Э3 Э4 Э5 Э6 Э7Э8 Э9Э10Э11Э12Э13Э14Э15Э16
Smz —
R2 —
И»" "Ml* ^
Рис. 4. Идентификация плазмидной ДНК Smz- производных Smz+ Rif трансконъюгантов
H. huttiense DSM 10281T
T1 - Smz+ Rif" трансконъюгант штамма H. huttiense DSM 10281T; Д - донор H. huttiense В601; Э1-Э16 - Smz-спонтанные производные Smz+Rif трансконъюгантов. Резидентные плазмиды донора: Smz - плазмида деградации симазина (210 т.п.н.); R2- трансмиссивная плазмида (60 т.п.н.).
Уменьшение размера приобретенных плаз-мид свидетельствовало о том, что наиболее вероятной причиной утраты способности утилизовать симазин у Smz- производных трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T являлась делеция фрагмента, несущего гены утилизации симазина. Для проверки данного предположения провели сравнительный ПЦР-анализ ДНК плазмид с использованием праймеров, позволяющих избирательно амплифицировать центральные участки генов деградации симазина smz А, -В или -С.
При использовании в качестве матрицы ДНК наименьших по размеру плазмид Smz- производных Э5 и Э7 не было обнаружено амплификации фрагментов генов smzА, -В или -С, что свидетельствует об их сцепленной утрате (рис. 5, дорожки 7-12). В то же время, деле-ция в плазмиде штамма Э1 привела к утрате генов генов smzА и -С, но не затронула ген smzB (дорожки 4-6). В плазмиде штамма Э14 отсутствовал ген smzА, но сохранились smzВ и -С, а в плазмиде штамма Э15 были утрачены гены smzВ и -С но сохранился smzA.
Рис. 5. Обнаружение генов деградации симазина в ДНК плазмид Smz- производных Smz+ Rif" трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмиды Smz донора H. huttiense В601 (дорожки 1-3) и плазмид Smz- производных Smz+ Rif трансконъюгантов Э1 (дорожки 4-6), Э5 (дорожки 7-9), Э7 (дорожки 10-12), Э14 (дорожки 13-15) и Э15 (дорожки 16-18). Для анализа использовали специфичные праймеры к генам smzA (дорожки 1, 4, 7, 10, 13, 16), smzB (дорожки 2, 5, 8, 11, 14, 17), smzC (дорожки 3, 6, 9, 12, 15, 18). М - маркер молекулярной массы - Gene Ruler™ 100 bp Plus DNA Ladder (Fermentas, Литва). т.п.н.).
Обнаружение у части Smz- производных трансконьюгантов плазмиды размером около 60 т.п.н. указывало на возможность участия меньшей резидентной плазмиды H. huttiense В601, имеющей тот же размер, в мобилизации генов деградации симазина в H. huttiense DSM 10281T так же, как это было ранее обнаружено при их переносе в Smz- производные самого штамма В601 [4, 7]. Ранее с помощью блот-анализа было установлено, что эта плазмида имеет участки, гибридизующиеся с геном pilA из P. putida WCS358 [4, 7], что дает возможность
ее обнаружения в составе гибридных плазмид.
При проведении ПЦР со специфичными к гену pilA праймерами образование характерных продуктов происходило при использовании в качестве матриц экстрагированной из агароз-ного геля ДНК меньшей плазмиды бактерии H. huttiense B601, плазмид Smz+ Rif" транс-конъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T и их Smz- производных Э5 и Э6. (рис. 6). При использовании в качестве матрицы ДНК крупной Smz плазмиды штамма H. huttiense B601 продукты реакции выявлены не были.
Рис. 6. Обнаружение присутствия в плазмидной ДНК нуклеотидных последовательностей, обладающих сходством с геном pilA из P. putida WCS358, с помощью ПЦР В качестве матрицы для ПЦР использовали: ДНК плазмиды pAG2, несущей ген pilA из P. putida WCS358 (К); ДНК резидентной Smz плазмиды штамма H. huttiense B601 (Smz); ДНК резидентной трансмиссивной плазмиды (60 т.п.н.) штамма H. huttiense (R2); ДНК плазмид Smz+ Rif" трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T (T1-T10); ДНК плазмид спонтанных Smz- производных Smz+ Rif" трансконъюгантов штамма H. huttiense
DSM 10281T (Э5, Э6).
Для анализа использовали специфичные праймеры к гену pilA из P. putida WCS358: pilAf и pilA-1r (A)
или pilAf и pilA-3r (Б).
Таким образом, хотя плазмиды Smz+ Rif" трансконъюгантов штамма H. huttiense DSM 10281T сходны по размеру между собой и с Smz плазмидой донорного штамма H. huttiense B601,
перенос генов деградации симазина в H. huttiense DSM 10281T при конъюгации обусловлен не переносом Smz плазмиды, а их мобилизацией второй резидентной плазмидой донора.
заключение
Установлено, что способность использовать симазин в качестве единственного источника азота передается при конъюгации из бактерии H. huttiense В601 в типовой штамм вида H. huttiense DSM 10281T с частотой около 10-6 на клетку реципиента. Не удалось обнаружить передачи способности катаболизировать сима-зин из H. huttiense В601 в бактерии, принадлежащие к родственным видам H. frisingense
и H. seropedicae. Так же как и в скрещиваниях с Smz- производными самого штамма H. huttiense В601 [4,7] способность к утилизации симазина передавалась в H. huttiense DSM 10281T не вследствие самостоятельного переноса крупной Smz плазмиды донора, а за счет мобилизации расположенных на ней генов деградации smzА, -В и -С второй резидентной плазмидой.
Список использованных источников
1. Коляда, Т.И. Токсическое последействие симазина и атразина на сельскохозяйственные культуры / Т.И. Коляда, Н.И. Туренков, И.А. Добровольская // Почвоведение и агрохимия.
2. Chemical Contamination of California Drinking Water / H.H. Russell [et al.] // The Western Journal of Medicine. - 1987. - V. 147. -P. 615-622.
3. Field-scale remediation of atrazine contaminated soil using recombinant Escherichia coli expressing atrazine chlorohydrolase / L.S. Strong [et al.] // Environ. Microbiol. -1999. - № 2 - P. 91-98.
4. Бажанов, Д.П. Плазмидная локализация генов деградации хлорированных симм-триазинов / Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова // Тез. межд. симп. «Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология» (18-21 ноября 2001 г., г. Москва; 22-24 ноября 2001 г., г. Минск). - Минск, 2001. - С. 11-13.
5. De Souza, M.L. The atzABC genes encoding atrazine catabolism are located on a self-transmissible plasmid in Pseudomonas sp. strain ADP / ML. de Souza, LP. Wackett, M.J. Sad-owsky // Appl. Environm. Microbiol. - 1998. -V. 64. - P. 2323-2326.
6. The atrazine catabolizm genes atzABC are widespread and highly concerved / M.L. de Souza [et al.] // J. Bacteriol. - 1998. - V. 180. -P. 1951-1954.
7. Бажанов, Д.П. Плазмиды ризосферной бактерии В601, утилизирующей симазин /
Д.П. Бажанов, К.И. Забенькова // Генетика и селекция в XXI веке. Мат. VIII съезда генетиков и селекционеров Республики Беларусь. Минск, 23-25 июля 2002 г. - С. 239.
8. Бажанов, Д.П., Мобилизация генов деградации симазина плазмидой pSa / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич // Цитология и генетика. - 2007. - № 1. - С.16-22.
9. Яцевич, К.К. Перенос способности утилизировать симазин в грамотрицательные бактерии при конъюгации. / К.К. Яцевич, Д.П. Бажанов // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Мат. межд. конф. (26-28 мая 2004 г., Минск). - Минск, 2004. - С.176-177.
10. 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from Banana (Musa spp.) and Pineapple (Ananas comosus (L.) Merril). / L.M. Cruz [et al.] // Appl. Environm. Microbiol. - 2001. - V. 67. - P. 2375-2379.
11. Бажанов, Д.П. Филогенетическая идентификация трех штаммов ризосферных бактерий на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и генетического типирования / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич, А.А. Бажанова//Микробиология. -2010. - Т. 79, № 3. - С. 394-404.
12. Плазмиды. Методы / ред. К. Харди. -М.: Мир, 1990. - C. 82-83.
13. Characterization of type IV pilus genes in plant growth-promoting Pseudomonas putida WCS358 / A. de Groot [et al.] // J. Bacteriol. -1994. - V. 176. - P. 642-650.
Дата поступления статьи 15 ноября 2012 г.
