Определение стабильности плазмиды рOS19 Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ИЗВЕСТИЯ

ПЕНЗЕНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ПЕДАГОГИЧЕСКОГО УНИВЕРСИТЕТА имени В. Г. БЕЛИНСКОГО ЕСТЕСТВЕННЫЕ НАУКИ № 10 (14) 2008

IZVESTIA

PENZENSKOGO GOSUDARSTVENNOGO PEDAGOGICHESKOGO UNIVERSITETA imeni V. G. BELINSKOGO NATURAL SCIENCES № 10 (14) 2008

УДК 576.80

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ ПЛАЗМИДЫ pOS19

© Д. о. ГОРЮНОВА, л. А. ПШЕНИЦЫНА, И. А. КОШЕЛЕВА,

Ж. С. БАРДИНОВА, В. А. СМЕТАНИН, М. Т. ГЕНГИН Пензенский государственный педагогический университет им. В. Г. Белинского

кафедра биохимии e-mail: vsmeta@rambler.ru

Горюнова Д. О., Пшеницына Л. А., Кошелева И. А., Бардинова Ж. С., Сметанин В. А., Генгин М. Т. - Определение стабильности плазмиды pOS19. - Известия ПГПУ им. В. Г. Белинского. 2008. № 10 (14). - С. 46-48. - В работе исследована стабильность плазмид, содержащих ген, отвечающий за деградацию нафталина. В результате выяснено, что незначительная часть бактерий со временем теряет способность утилизировать нафталин. Возможно, это происходит из-за утраты этого гена, либо нарушений в регуляции экспрессии этого гена.

Ключевые слова: плазмиды, деградация нафталина.

Goryunova D. O., Pshenizina L. A., Kosheleva I. A., Bardinova Zh. S., Smetanin V. A., Gengin M. T. - Definition stability plasmid pOS19. - Izv. Penz. gos. pedagog. univ. im.i V. G. Belinskogo. 2008. № 10 (14). P. 46-48. - We

investigated stability of plasmids, containing a gene which is responsible for degradation of naphthalene. We have found out, that the insignificant part of bacteria loses the ability to utilize naphthalene. Probably it happens because of loss of this gene or infringements in regulation of an expression of this gene.

Keywords: plasmids, naphthalene degradation.

Проблема очистки окружающей среды от токсичных продуктов различных химических производств является актуальной в настоящее время. Один из самых распространенных классов загрязнителей -это полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). Они образуются при неполном сгорании углеводородного топлива, в результате интенсивной техногенной деятельности человека; переносятся воздушными потоками в виде аэрозолей и обнаруживаются повсеместно: в почвах, донных отложениях, водоёмах, воздухе, что представляет значительную опасность для живых организмов. В частности, ароматические углеводороды являются канцерогенами и мутагенами.

ПАУ могут окисляться фотолитически и химически, а затем включаться в пищевую цепь [4]. Однако главную роль в разложении этих соединений в окружающей среде играет микробная деградация. Несомненно, биологические методы очистки окружающей среды, основанные на способности микроорганизмов утилизировать ароматические субстраты, являются наиболее эффективными, часто внесение микроорганизмов-деструкторов в загрязненные почвы приводит к стимуляции процессов деградации [3].

Многие микроорганизмы обладают ферментными системами, за счет которых способны включать в метаболизм полициклические ароматические угле-

водороды (ПАУ), в том числе и нафталин. Эти микроорганизмы, а также различные аспекты деградации ароматических углеводородов исследуются на протяжении последних тридцати лет.

Способностью утилизировать соединения с расщеплением ароматического кольца обладают многие почвенные бактерии и грибы, но особенно хорошо изучены в этом плане представители рода Pseudomonas, обладающие большим метаболическим потенциалом. При этом необходимо отметить, что очень часто деградация ксенобиотиков контролируется плазмидами [2]. Поэтому всестороннее изучение плазмид биодеградации имеет важное значение. У штаммов флуоресцирующих псевдомонад гены утилизации нафталина - одного из представителей ПАУ и его производных могут иметь как плазмидную, так и хромосомную локализацию [5]. Катаболические гены организованы в два оперона: первый (nahl) кодирует превращение нафталина в салицилат, второй (nah2) - утилизацию салицилата через катехол до интермедиатов цикла трикарбоновых кислот. Экспрессия обоих оперонов находится под позитивным контролем регуляторного гена nahR [1].

Целью настоящей работы являлось изучение стабильности плазмид KT2442 pOS 19::Tc, которые являются деструкторами нафталина и салицилата.

БИОХИМИЯ ►►►►►

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали штаммы, содержащие плазмиды-деструкторы салицилата и нафталина, полученные путём скрещивания бесплазмидных штаммов P. putida КТ2442 с бактериями, содержащими плазмиды pOS 19::Tc. Все штаммы были способны к росту на салицилате и нафталине.

В работе применяли среду Эванса (ЕВ), среду Лурия-Бертани (LB), а так же агарозованную среду Эванса (ЕА) и агаризованную среду Лурия-Бертани (LA). для приготовления сред использовали антибиотики: канамицин (Km), рифампицин (Rif), стрептомицин (Sm), тетрациклин (Тс), а также раствор салицилата (Sal). Нафталин (Nah) добавляли на крышку чашки Петри.

для определения стабильности плазмид штаммы засевали в пробирку с LB и культивировали на качалке при температуре 24-26° С. Каждые сутки ино-кулят пересевали в свежую пробирку с LB и высевали на чашки с LA на 1,2,3 и 7 сутки. Полученные колонии переносили в ячейки репликатора: из них 96 опытных и 4 контрольные колонии. Реплицировали на чашки с LA, LT^ ENah, ESal и выражали количество выросших колоний в процентах. Чтобы убедиться в том, что колонии, не выросшие на среде с нафталином, действительно утратили определённый ген, проводили рестрикционный анализ и полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Результат оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты проведения опыта по определению стабильности и подсчёта количества колоний после каждой репликации представлены в таблице 1.

Таблица 1 Стабильность плазмиды pOS19

Среда культивирования Время культивирования

1 сутки 2 суток 3 суток 7 суток

Количество колоний

LA 100 % 100 % 100 % 100 %

LKmRifTc 100 % 100 % 100 % 100 %

EKmRifNah 100 % 97 % 91 % 85 %

ESal 100 % 100 % 100 % 100 %

Из результатов опыта (табл. 1) видно, что 85 % от общего числа колоний сохранили способность к использованию в качестве единственного источника углерода и энергии нафталин. Остальные 15% колоний потеряли устойчивость к нафталину. Это можно объяснить тем, что эти препараты бактерий со временем утратили ген, отвечающий за деструкцию нафталина.

Затем были отобраны колонии с генотипом Tc+Nah-Sal+ и Tc+Nah+Sal+. После выделения из этих колоний плазмидной ДНК проводили рестрикционный анализ в двух повторностях. Полученные результаты представлены на рисунке.

Hür Ы

Sai

У

1 2 3 4 М

Рис. Профиль рестрикции плазмид.

Дорожкам под номерами 1 и 2 соответствуют колонии бактерий с генотипом Tc+Nah+Sal+; под номерами 3 и 4 - бактерии с генотипом Tc+Nah-Sal+; М - маркер

Сравнивая по электрофореграмме (рис.) рестрикционные профили плазмид с генотипами Tc+Nah-Sal+ и Tc+Nah+Sal+. Видно, что препараты плазмидной ДНК под номерами 3, 4 содержат меньше участков рестрикции. Вероятно, именно в этих участках находится ген, ответственный за деградацию нафталина. Разница в рестрикционных профилях доказывает, что в плазмид-ной днк произошли значительные перестройки, а так же её делеция.

После амплификации гена Nah Ac на электрофореграмме видно, что в 3 и 4 препаратах есть небольшой сигнал на присутствие этого гена. Возможно, что ген, кодирующий нафталиндиоксикиназу, содержится в этих плазмидах, но не экспрессируется.

Можно предположить, что в процессе проведения опыта по определению стабильности плазмид, произошли какие-либо нарушения в регуляции экспрессии этого гена.

ВЫВОДЫ

Стабильность плазмид P. putida КТ2442pOS 19::Tc составляет 85 %. Уменьшение количества колоний, способных использовать нафталин в качестве единственного источника углерода и энергии, может быть связано с делецией и перестройками в плазмидной ДНК, на что указывают рестрикционный и ПЦР анализы.

список ЛИТЕРАТУРЫ

1. Мавроди Д. В., Коваленко Н. П., Соколов С. Л., Пар-фенюк В. Г., Кошелева И. А., Боронин А. М.. Идентификация ключевых генов катаболизма нафталина в почвенной ДНК // Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 597-604.

ИЗВЕСТИЯ ПГПУ им. В. Г. Белинского • Естественные науки • № 10 (14) 2008 г.

2. Davies J. I., Evans W. C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil pseudomonas: The ring-fission mechanism // J. Biochem. 1964. Vol. 91. P. 251-261.

3. Evans W. C., Fernley H. N. Griffiths E. Oxidative metabolism of phenantrene and anthracene by soil pseudomonads: the ring-fission mechanism // J Biochem. 1965. Vol. 95. P. 819-831.

4. Müller U., Lingens F. Degradation of 1, 4-naphthoquinones by Pseudomonas putida // Biol. Chem. Hoppe Seyler. 1988. Vol. 369(9). P. 1031-1043.

5. Shamsuzzaman K. M., Barnsley E. A. The regulation of naphthalene metabolism in pseudomonads // Biochem. Biophys. Rec. Comm. 1974. Vol. 60. P. 582-587.