CC BY
43
экологическая генетика трансгенных организмов
© И. В. леппянен т. о. Артамонова 2, С. А. Лопатин 3, В. П. Варламов 3, И. А. Тихонович ', Е. А. Долгих1
1 Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии, Санкт-Петербург;
2 Санкт-Петербургский государственный политехнический университет;
3 Центр «Биоинженерия» РАН, Москва
C Хитоолигосахариды находят широкое практическое применение, что определяет интерес к изучению возможности биосинтеза этих соединений. В данной работе осуществлен синтез гекса-1-аце-тилхитогексаозы и пента-11-аце-тилхитопентаозы в клетках Е. coli с использованием уникального фермента N-ацетилглюкозаминилтранс-феразы клубеньковых бактерий Rhizobium sp. GRH2 и m. loti. При культивировании бактерий е. coli, экспрессирующих рекомбинантные ферменты, в присутствии субстрата N-ацетилглюкозамина, уровень синтеза хитоолигосахаридов достигал нескольких миллиграмм на литр жидкой культуры. Анализ полученных соединений с помощью методов ВЭЖХ и масс-спектро-метрии подтвердил их соответствие стандартам.
C Ключевые слова: хитоолигосахариды; ферментативный синтез; N-аце-тилглюкозаминилтрансфераза.
Поступила в редакцию 03.10.2012 Принята к публикации 06.03.2013
УДК 577.2
БИОСИНТЕЗ ГЕКСА- И ПЕНТАМЕРНЫХ
хитоолигосахаридов с помощью n-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобиальных бактерий
ВВЕДЕНИЕ
Значительный интерес к изучению олигосахаридов (как конъюгирован-ных, так и свободных) связан с их особой ролью в процессах межклеточного взаимодействия, в основе которых лежит узнавание этих соединений поверхностными рецепторами клеток у различных организмов (Gagneux, Varki, 1999). Конъюгированные олигосахариды входят в состав гликопротеинов и гликолипидов, углеводные части которых являются специфическими ли-гандами для многих рецепторов. Свободные олигосахариды также вовлечены в лиганд-рецепторные взаимодействия, выполняя во многих случаях функцию сигнальных молекул, регулирующих различные биохимические, иммунологические и морфогенетические процессы. Отдельную группу составляют олигосахариды, которые содержат в своем составе аминосахара D-глюкоза-мин, D-галактозамин, а также ^ацетил^-глюкозамин и ^ацетил^-га-лактозамин. Эти соединения выполняют ряд важных функций у различных организмов, поэтому им будет уделено основное внимание в данной работе.
У человека и позвоночных животных конъюгированные с гликопротеина-ми и гликолипидами мембран эритроцитов олигосахариды, состоящие из остатков ^ацетил^-галактозамина, определяют специфичность групп крови человека (ABO система). Олигосахариды грудного молока, содержащие в своем составе ^ацетил^-глюкозамин, действуют как ростовые факторы для Bifidobacterium bifidum и вместе с тем участвуют в подавлении развития патогенной микрофлоры Shigella sp., Helicobacter jejuni, Vibrio cholerae, Salmonella sp. (подавление адгезии бактерий в результате лиганд-рецеп-торных взаимодействий) (Kunz et al., 2000). Состоящие из остатков амино-сахаров олигосахариды, а также полисахариды (гиалуроновая кислота, хон-дроитин-сульфаты, дерматансульфаты, гепарин, кератин) входят в состав межклеточного вещества почти всех видов соединительной, костной и хрящевой тканей позвоночных животных и человека, они обнаружены в эпителиальной и нервной тканях. Эти соединения участвуют в регуляции гидродинамики тканей, иммунных реакциях, в ионном обмене, а также процессах миграции и пролиферации клеток, морфогенезе тканей (McAuliffe, Hindsgaul, 2000).
У представителей высших растений семейства бобовых (сем. Leguminosae), олигосахариды, состоящие из трех — шести остатков ^ацетил^-глюкоза-мина и декорированные жирной кислотой на невосстанавливающем конце молекулы (Nod-факторы), выполняют роль сигнальных молекул. Олиго-сахаридная часть Nod-фактора представляет собой хитоолигосахарид, поскольку содержит в своем составе подобно полимеру хитину только остатки ^ацетил^-глюкозамина. Синтезируемые симбиотическими бактериями Nod-факторы способны стимулировать развитие специализированных органов — азотфиксирующих корневых клубеньков, действуя в наномолярных концентрациях (Spaink et al., 1991). В результате связывания этих соединений со специфичными рецепторами растений активируется целый комплекс регуляторных белков и гормонов, что приводит к органогенезу клубеньков.
Возможность активации внеклеточными олигосахари-дами рецепторов самого растения указывает на наличие у них сходных по структуре эндогенных соединений, влияющих на морфогенез и дифференцировку тканей. Поиск таких олигосахаридов в растении в настоящее время продолжается.
Олигосахариды, состоящие из остатков N-ацетил-D-глюкозамина, играют важную роль в эмбриогенезе позвоночных животных (Semino et al., 1996; Bakkers et al., 1997). В геноме пресноводных рыб Danio rerio семейства карповых Cyprinidae, а также в геноме мышей были выявлены близкие гомологи гена DG42 Xenopus, контролирующего синтез олигосахаридов, состоящих из остатков ^ацетил^-глюкозамина (Semino et al., 1996; Kamst et al., 1999). Было показано, что выявленные гены влияли на раннее развитие эмбрионов. Сравнительный анализ показал гомологию между белком DG42 Xenopus, белком-ферментом ризобий NodC (N-ацетилглюкоза-минилтрансферазой, контролирующей синтез хитооли-госахаридных молекул Nod-факторов) (Sargent, Dawid, 1983; Geremia et al., 1994) и ферментом грибов хитин-синтазой (Bulawa, Wasco, 1991). Более того, введение гена ризобий NodC в эмбрионы рыб и мышей оказывало значительное влияние на их развитие, что подтвердило предположение об участии хитоолигосахаридов в контроле эмбриогенеза.
У низших растений, грибов и беспозвоночных животных (в основном членистоногих — насекомых и ракообразных) выявлены как олигосахариды, так и полисахариды, состоящие из остатков аминосахаров. Полисахариды представлены главным образом такими соединениями как хитин и его деацетилированное производное хитозан, мономерными единицами которых являются N-ацетил-D-глюкозамин и D-глюкозамин, связанные между собой Р-1,4-гликозидными связями. Эти соединения выполняют опорные и механические функции в организмах низших растений, грибов и беспозвоночных животных. Под влиянием целого комплекса ферментов полимеры хитин и хитозан могут быть расщеплены до низкомолекулярных производных, включая хитоолигосахариды (олиго-меры хитина и хитозана).
Хитоолигосахариды обладают рядом уникальных свойств, оказывая специфичное воздействие на бактерии, высшие растения, человека и позвоночных животных. Известно, что некоторые хитоолигосахариды обладают противовоспалительным, антибактериальным и противоопухолевым действием (Harish Prashanth, Tharanathan, 2005; Xu et al., 2008; Simunek et al., 2010; Venkatesan et al., 2010). Олигомеры хитозана (n = 10—30) используются в качестве носителей для транспортировки белков, ДНК и лекарственных соединений через мембрану (Thanou et al., 2002; Koping-Hoggard et al., 2004). Кроме того, хитоолигосахариды способны индуцировать защитные реакции при взаимодействии с растениями (являются сигнальными молекулами — элиситорами)
(Albersheim et al., 1983; Khan et al., 2003), а также обладают ростстимулирующим действием по отношению ко многим растениям. Применение этих соединений и их модифицированных аналогов для развития устойчивости растений к фитопатогенам и стимуляции роста является перспективным направлением в практике защиты растений. При этом хитоолигосахариды не токсичны в высоких концентрациях и легко утилизируются, что делает их применение предпочтительным по сравнению с химическими соединениями. Известно, что элиситорная и ростостимулирующая активность хитоолигосахаридов по отношению к растениям проявляется при степени полимеризации молекул не менее 5—6 остатков N-ацетил-D-глюкозамина.
Необходимость изучения олигосахаридов, состоящих из остатков аминосахаров, а также широкие возможности для практического использования этих соединений, определяют необходимость разработки подходов к их получению в достаточно больших количествах. Химический и ферментативный гидролиз полимеров малоэффективен для получения олигосахаридов с необходимой степенью полимеризации и определенными химическими модификациями, так как в результате этого процесса получают смесь соединений, часто с неопределенной структурой, что предполагает дальнейшие очистку и анализ структуры полученных соединений. Химический синтез оли-госахаридов является очень сложной задачей, так как в процессе синтеза необходимо проводить стабилизацию и защиту активных групп на всех этапах, что делает синтез соединений со степенью полимеризации больше трех нецелесообразным (Boons, 1996; Кочетков, 2000; Chang et al., 2004). Ряд преимуществ может иметь ферментативный синтез олигосахаридов (Ruffing et al., 2006a, b). В процессе биосинтеза могут быть решены такие проблемы синтеза олигосахаридов как региоспецифичность (формирование олигомеров, состоящих только из одного типа аномеров) и стереоспецифичность (образование только р-1,4-гликозидной связи между мономерами), что позволяет получать соединения со строго определенной структурой. Для биосинтеза преимущественно используют ферменты гликозилтрансферазы, контролирующие образование гликозидной связи в результате трансгликозилирования, при этом донорами гликозиль-ных остатков могут быть нуклеотиды и фосфаты сахаров (Endo, 2000; Perugino et al., 2004; Murata, Usui, 2006). Основные трудности при проведении ферментативного синтеза связаны с выделением ферментов из природных источников. Однако эффективная продукция гликозил-трансфераз в гетерологичных системах (клетках микроорганизмов, животных или растений) может решить проблему биосинтеза олигосахаридов (Ruffing et al., 2006).
Основной целью нашей работы являлась разработка подходов для биосинтетического получения хитоолигоса-харидов — соединений, имеющих важное практическое применение в медицине, биотехнологии, сельском хо-
зяйстве и других областях. Ранее у широкого круга микроорганизмов (бактерий, грибов) были выявлены ферменты гликозилтрансферазы, способные синтезировать полимер хитин. В частности, охарактеризована и наиболее полно изучена хитинсинтаза дрожжей Saccharomyces cerevisiae и некоторых других грибов (Candida ablicans, Neurospora crassa и др.) (Silverman, 1989; Bowen, 1992). Клонирование гена хитинсинтазы и его гетерологичная экспрессия позволили осуществить биосинтез хитина в трансгенных растениях (Dhugga et al., 2000). Другая уникальная гликозилтрансфераза — N-ацетилглюко-заминилтрансфераза, контролирующая синтез хитооли-госахаридных молекул Nod-факторов, была выявлена у бактерий семейства Rhizobiaceae (ризобий) (Spaink et al., 1991; Geremia, 1994; Kamst et al., 1995; Mergaert et al., 1995). Фермент способен катализировать синтез хитоолигосахаридов, состоящих из определенного числа остатков ^ацетил^-глюкозамина (n = 4—6), что может быть удобным для получения хитоолигосахаридов с необходимой степенью полимеризации. Как было отмечено ранее, хитоолигосахариды со степенью полимеризации 5 и 6 остатков ^ацетил^-глюкозамина проявляют элиситорную и ростстимулирующую активность по отношению к растениям. Фермент N-ацетил-глюкозаминил-трансфераза некоторых штаммов Rhizobium способен осуществлять синтез гекса- и пентамерных хитоолигоса-харидов, что можно использовать для биосинтетических целей. Для синтеза таких соединений мы предложили использовать фермент N-ацетилглюкозаминилтрансфе-разу двух видов ризобиальных бактерий — Rhizobium sp. GRH2 (симбионт акации) и Mesorhizobium loti. Rhizobium sp. GRH2 является единственным видом ризобий, который способен осуществлять синтез Nod-факто-ров, состоящих из шести остатков N-ацетилглюкозами-на (наряду с пентамерами), а M. loti синтезирует только пентамерные молекулы (Lopez-Lara et al., 1993, 1995). Ранее была осуществлена гетерологичная экспрессия фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы ризобий, синтезирующих преимущественно тетра- и пентамерные молекулы (Kamst et al., 1997; Samain et al., 1997; Bettler et al., 1999; Koizumi, 2003). Такие исследования позволили детально изучить свойства отдельных ферментов и показали, что биосинтез олигосахаридов в E. coli может быть эффективным (Samain et al., 1997; Bettler et al., 1999). В нашей экспериментальной работе впервые была предпринята попытка синтезировать гексамерные хитоолигосахариды, поскольку они непосредственно могут быть использованы в качестве эффективных эли-ситоров и стимуляторов для развития растений. Нами были изучены эффективность использования ферментов двух видов Rhizobium и количественный выход синтезируемых олигомеров хитина, состоящих из пяти и шести остатков ^ацетил^-глюкозамина. Применение реком-бинантных технологий для получения ферментов, обладающих синтетической активностью, позволило решить
задачу синтеза. В процессе контролируемого синтеза хитоолигосахаридов были получены вещества со степенями полимеризации пять и шесть остатков N-ацетил-глюкозамина и изучены некоторые свойства этих соединений, сходных по структуре, но отличающихся числом мономерных остатков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ШТАММЫ И ПЛАЗМИДЫ. Для экспериментальной работы были использованы штамм ризобий M. loti 1803 (Ведомственная коллекция полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россель-хозакадемии, WDCM 966, http://www.arriam.spb.ru/ rus/lab10/), а также Rhizobium sp. GRH2, любезно предоставленный профессором Van Brüssel (Нидерланды). Для стандартных процедур клонирования был использован штамм Escherichia coli DH5a. Для экспрессии белков использовали мутантный штамм E. coli С41 (Miroux, Walker, 1996), полученный на основе штамма BL21 (DE3) (Novagene, США). Для получения генетических конструкций была использована плазмида pRSET (Invitrogen, США), а также широко используемая для клонирования плазмида pUC19 (Invitrogen, США).
УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММОВ. Штаммы E. coli культивировали в жидкой среде LB (Bertani, 1951), содержащей ампициллин (100 мкг/мл) при 37 °С до достижения культурой необходимой плотности. Штаммы ризобий культивировали в жидкой среде TY (5 г/л триптона, 3 г/л дрожжевого экстракта, 0,5 г/л CaCl2), содержащей необходимый антибиотик, при 28 °С.
ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ФЕРМЕНТЫ. Олиго-нуклеотиды были синтезированы компанией «Евроген» (Москва). Были использованы эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигаза фага Т4, HF Phusion-полимераза производства компании Thermo Scientific (США).
ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ. Для клонирования гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2 (RhGRH2NodC), последовательность которого была неизвестна, был проведен сравнительный анализ последовательностей генов NodC близких видов ризобий и подобраны вырожденные праймеры (вариабельные позиции выделены) для амплификации фрагмента гена:
1. RhGRH2NodC F1: 5'-AYGTHGTYGAYGACGGTTC-3'
2. RhGRH2NodC R1: 5'-CGYGACARCCARTCGCTRTTG-3' На следующем этапе для амплификации 5'-и 3'-
концевых участков гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2 был использован адаптор Vectorette (Thermo Scientific, США) и следующий набор полностью комплементарных (специфичных) праймеров:
3. С20 — универсальный праймер к адаптору: 5'-CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA-3'
4. RhGRH2NodC F2: 5'-CCGTGCTTTCCTCTGTCCAG-3'
5. RhGRH2NodC R2: 5'-TCCTTCATCCGCTGTCTCGTT-3'
После определения последовательности полноразмерного гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2, была проведена его амплификация методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью специфичных прай-меров, содержащих сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI:
6. RhGRH2NodC F0:
5'-GGGGATCCGATGGACCTGCTCAACACAATCG-3'
7. RhGRH2NodC R0:
5'-GGGAATTCTCAGTCGTCGCTGTAGACACCG-3'
Последовательность полноразмерного гена NodC штамма M. loti 1803 (MlNodC) амплифицировали методом ПЦР с использованием вырожденных прайме-ров (вариабельные позиции выделены), в состав которых вводили сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI и EcoRI (отмечены подчеркиванием). Праймеры были подобраны на основании сравнительного анализа известных последовательностей генов NodC двух штаммов M. loti MAFF303099 (NCBI BA000012) и M. loti NZP2037 (NCBI X52958).
8. MlNodC прямой: 5'-GGGGATCCGATGAACCTRTTTG CCWCAGCCAGTAC-3'
9. MlNodC обратный: 5'-GGGAATTCCTATTGCTGTTCG CTGTAAGRMGC-3'
Амплификацию генов проводили методом ПЦР на матрице ДНК, выделенной из Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803, по следующей программе в процессе 30 циклов: 94 °С — 30 с, 55 °С (для полноразмерного гена RhGRH2NodC) или 51 °С (для полноразмерного гена MlNodC) — 30 с, 72 °С — 30 с. Полученный продукт выделяли из геля с помощью набора для выделения фрагментов ДНК компании Qiagen (США) по методике, предложенной производителем. Выделенные фрагменты клонировали в векторах pRSETb и pUC19 с сохранением рамки считывания с помощью T4 ДНК-лигазы в течение ночи при 4 °С. Полученной после лигирования реакционной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli DH5a по методике, предложенной Inoue и соавт. (Inoue et al., 1990). Отбор трансформантов производили на среде LB, содержащей индуктор изопропил-1 -тио^^-галактопиранозид(ИПТГ) и субстрат ß-галактозидазы (X-Gal).
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ ДНК БАКТЕРИЙ. Для выделения суммарной ДНК ризобий использовали 1,5 мл ночной культуры. Клетки ризобий центрифугировали при 14 000 об/мин (центрифуга MiniSpin Eppendorf, Германия) в течение 2 мин. Надосадочную жидкость удаляли, а клетки ресуспендировали в 500 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-HCl pH 8,0, 5 мМ этилендиаминтетраацетат (ЭДТА)). К суспензии добавляли 1 мкл раствора лизоцима (1 мг/мл) и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли ДСН до конечной концентрации 0,5 % и протеиназу К (Thermo Scientific, США) до концентрации 0,05 мг/мл и инкубировали при 37 °С в течение 1 ч. Для уменьшения вязкости образовавшийся прозрачный лизат замораживали при -20 °С, затем давали оттаять при комнатной температуре.
Дважды экстрагировали смесью фенол: хлороформ (1 : 1). ДНК осаждали двумя объемами этанола 5 мин при комнатной температуре. Раствор центрифугировали 2 мин при 14 000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, осадок промывали 70 % этанолом, подсушивали и растворяли в 50— 100 мкл деионизованной воды. Концентрация ДНК после выделения составляла в среднем около 0,5—1 мкг/мл.
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК. Плазмидную ДНК выделяли из 3 мл ночной культуры клеток E. coli методом щелочного лизиса (Lee, Rasheed, 1990). Выделенные плазмиды вводили в клетки DH5a или С41 методом химической трансформации (Inoue et al., 1990).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОВ NODC ДВУХ ШТАММОВ РИЗОБИЙ. Соответствие клонированных последовательностей генам NodC, а также сохранность рамки считывания подтверждали путем определения нуклеотидной последовательности. Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора GenomeLab DTCS Quick Start kit (Beckman Coulter, США). Реакцию проводили в объеме 10 мкл, содержавшем 200—300 нг плазмидной ДНК, 3,2 пМ специфического праймера и реакционную смесь, предоставленную компанией-производителем. Продукты реакции анализировали с использованием автоматического секвенатора CEQTM 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США).
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЭКСТРАКТОВ КЛЕТОК И ПОЛУЧЕНИЕ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ. Инкубированные в присутствии 0,5 мМ ИПТГ ночные культуры клеток E. coli DH5a или C41, несущие необходимые генетические конструкции, охлаждали в течение 20 мин на льду, затем осаждали центрифугированием при 3000 об/мин (Mikro 22R Hettich, Германия) в течение 20 мин при 4 °С. Осадки клеток ресуспендировали в 1 х буфере PBS, pH 8,0, содержащем 0,1 мМ фенилметил-сульфонилфторид (ФМСФ). Затем проводили трехкратную обработку ультразвуком по 30 с с интервалами по 20 с (клетки в перерывах между обработкой ультразвуком выдерживали на льду). Центрифугировали полученную после обработки ультразвуком суспензию при 4000 об/мин 20 мин (при такой скорости обычно оседают особые белковые образования — тельца включения (от англ. inclusion bodies)). Далее для получения других субклеточных фракций супернатант центрифугировали при 16 000 об/мин (Mikro 22R Hettich, Германия). Для выделения микросомальной фракции супернатант центрифугировали при 45000 об/мин (100000g, TL-100, Beckman, США). Полученные в результате центрифугирования различные субклеточные фракции ресуспен-дировали в буфере для нанесения на гель и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии 0,1 % ДСН.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПААГ И ВЕСТЕРН-БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ. Белковые пробы, уравновешенные по содержанию белка, были разделены
в 12-15 % ПААГ с 0,1 % ДСН в электрофорезной системе Mini Protein 3 Cell компании BioRad Laboratories (США). После разделения белков в геле, проводили их окрашивание Кумасси бриллиантовым синим G-250. При Вестерн-блот гибридизации белки после разделения в ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану (0,45 мкм). Для проверки полноты переноса белков проводили окрашивание мембран Понсо 4R. Далее проводили гибридизацию с антителами против полигистиди-новой (poly-His) последовательности.
СИНТЕЗ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ IN VIVO. Для стандартной процедуры синтеза хитоолигосахаридов в бактериях E. coli 100 мл среды LB, содержащей ампициллин (100 мг/л), инокулировали 1 мл ночной культуры бактерий E. coli, несущих необходимую генетическую конструкцию. Растили бактерии при температуре 37 °С до достижения культурой оптической плотности А600 = 0,6, затем индуцировали экспрессии белка при добавлении к среде 0,5 мМ ИПТГ. После культивирования в течение трех часов в присутствии ИПТГ при температуре 37 °С, добавляли в среду в качестве источника углерода глицерол до конечной концентрации 4 г/л, а также субстрат для синтеза хитоолигосахаридов — N-ацетилглюкозамин в концентрации 0,1 г/л (Samain et al., 1997). Синтез проводили в течение 24-48 часов при температуре 35 °С.
ВЫДЕЛЕНИЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ. После завершения процедуры синтеза хитоолигосахаридов клетки E. coli осаждали при 3000 об/мин (центрифуга Beckman J2-21, США) в течение 20 минут при температуре 4 °С, ресуспендировали осадок клеток в 2 мл воды и кипятили суспензию в течение 30 минут. Водную фазу, содержащую хитоолигосахариды, адсорбировали на активированном угле (Fluka, Германия) в течение 10 минут. Смыв хитоолигосахаридов с угля проводили 50 % этиловым спиртом. После выпаривания этанола осадок, содержащий хитоолигосахариды, ресуспендировали в необходимом объеме воды и использовали для анализа методом ВЭЖХ.
РАЗДЕЛЕНИЕ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ. Разделение хитоолигосахаридов проводили методом ВЭЖХ на колонке с аминофазой SUPELCOSIL LC-NH2 (Sigma, США) в системе аце-тонитрил : вода (70 : 30 %). Разделение проводили при скорости элюции 1 мл/мин. Идентификацию полученных соединений проводили посредством сравнения времени выхода пика анализируемого вещества со временем выхода с колонки пиков, соответствующих стандартам — пента^-ацетилхитопентаозы и гекса-^ацетилхито-гексаозы (Medacshop, Германия).
АНАЛИЗ СИНТЕЗИРОВАННыХ ХИТООЛИГО-САХАРИДОВ С ПОМОЩЬЮ МЕТОДА МАСС-СПЕК-ТРОМЕТРИИ. Масс-спектрометрический анализ проб проводили на ионно-циклотронном масс-спектрометре Varian 902-MS MALDI Mass Spectrometer (ICR FTMS)
со сверхпроводящим магнитом 9.4 Тесла. Десорбцию и ионизацию пробы осуществляли с помощью третьей гармоники Nd: YAG лазера (355 нм). Образцы растворяли в 2 мкл 0,1 % водного раствора трифторуксусной кислоты (ТФУ), 0,5 мкл раствора образца смешивали на мишени с равным объемом раствора матрицы 2,5-дигидрокси-бен-зойной кислоты (ДГБК, 20 мг/мл в растворе ацетонитрил: 0,1% ТФУ в воде (30 : 70%)) и сушили на воздухе. Далее образцы облучали сериями лазерных импульсов (по 5 импульсов в серии). Определение молекулярной массы пробы производили методом внешней калибровки с использованием стандартных образцов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1.1. КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА NODC RHIZOBIUM SP. GRH2
Ризобии Rhizobium sp. GRH2 способны выделять Nod-факторы, состоящие из шести и пяти остатков N-ацетилглюкозамина (Lopez-Lara et al., 2005). Фермент N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, кодируемый геном NodC, контролирует первый этап в процессе биосинтеза Nod-факторов — синтез хитоолигосахаридов, которые составляют олигосахаридную основу этих сигнальных молекул. Следовательно, фермент Rhizobium sp. GRH2 должен обладать уникальной способностью синтезировать два вида хитоолигосахаридов — гекса-N-ацетилхитогексаозу и пента^-ацетилхитопентаозу. Так как нуклеотидная последовательность гена NodC Rhizobium sp. GRH2 была неизвестна, на первом этапе исследований перед нами стояла задача клонировать ген NodC данного вида бактерий. С этой целью на основании сравнительного анализа последовательностей генов NodC нескольких видов ризобий были подобраны вырожденные праймеры к наиболее консервативным участкам гена. При проведении ПЦР с вырожденными праймера-ми на матрице ДНК ризобий Rhizobium sp. GRH2 был амплифицирован фрагмент гена NodC, соответствующий примерно 1000 п. о. (рис. 1 а). Нами была определена нуклеотидная последовательность этого фрагмента и подобраны полностью комплементарные специфичные праймеры для амплификации 5'- и 3'-концов гена NodC с помощью ПЦР, основанного на использовании адаптеров Vectorette (рис. 1 б). Адаптеры Vectorette позволяют амплифицировать неизвестные концевые участки генов с помощью только одного специфичного праймера, поскольку второй праймер является комплементарным адаптору. При использовании адапторов нам удалось определить последовательность концевых участков гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2. На следующем этапе нами были использованы специфичные праймеры, фланкирующие последовательность гена NodC, для амплифи-цикации полноразмерного гена (рис. 1 в). Длина полной последовательности гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2 составила 1332 п. о. Сравнительный анализ пос-
-1000 и.о.
-> <Г
NodC_F1 NodC RI
RhC.RHlXodC I
RhGRHIXodC
Адаптер
NodC R2
I-
Nodc F: ===>=
Лдиггор
' C20
I-1332 п.о.-1
в ^
Рис. 1. Схема амплификации гена NodC Rhizobium sp. GRH2. а — амплификация фрагмента гена NodC, соответствующего примерно 1000 п. о.; б — амплификация 5'- и 39 рЬконцов гена NodC с помощью адапторов Vectorette (при амплификации использован праймер С20 к адаптору); в — амплификация полноразмерного гена NodCRhizobium sp. GRH2
ледовательности выявленного гена с известными ранее последовательностями генов NodC других штаммов ри-зобий показал наиболее высокий процент сходства с геном NodC Sinorhizobium meliloti GVPV12 (76 % сходства), Sinorhizobium sp. BR816 (75,6 %), Rhizobium sp. N33 (74 %), M. loti MAFF303099 (70 %) (рис. 2). Таким образом, в результате проделанной работы нам удалось впервые клонировать ранее неизвестный уникальный ген ризобий Rhizobium sp. GRH2.
1.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА NODC ШТАММА РИЗОБИЙ M. LOTI 1803
В базе данных NCBI представлены полноразмерные последовательности генов NodC двух штаммов M. loti — MAFF303099 и NZP2037. Для работы нами был использован штамм M. loti 1803, последовательность гена NodC которого ранее была не известна. На основании сравнительного анализа двух последовательностей гена NodC M. loti MAFF303099 и M. loti NZP2037 были подобраны вырожденные праймеры для амплификации полноразмерного гена NodC штамма M. loti 1803. С использованием этих праймеров на матрице ДНК штамма M. loti 1803 был амплифицирован продукт размером 1275 п. о. и определена его нуклеотидная последовательность. При анализе наиболее высокий процент сходства (99 %) был выявлен между геном NodC штамма M. loti 1803 и M. loti MAFF303099 (данные не представлены).
1.3. ПОЛУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ КОНСТРУКЦИЙ В ВЕКТОРАХ PRSETB И PUC19, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛНОРАЗМЕРНЫЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНОВ NODC ДВУХ ВИДОВ РИЗОБИЙ
Для экспрессии фермента N-ацетилглюкозами-нилтрансферазы двух видов ризобий Rhizobium sp.
GRH2 и M. loti 1803 в клетках E. coli нами были получены генетические конструкции в векторах pRSETb и pUC19 (Invitrogen, США) (рис. 3). Амплифицирован-ные с помощью специфичных праймеров, содержащих сайты узнавания для рестриктаз BamHl и EcoRl, полноразмерные гены NodC M. loti 1803 (размером 1275 п. о.) и Rhizobium sp. GRH2 (размером 1332 п. о.) были встроены в векторы pRSETb и pUC19 по соответствующим сайтам с сохранением рамки считывания. В векторе pUC19 ген NodC находится под контролем промотора ß-галактозидазы (промотор гена lacZ), в то время как в векторе pRSET используется промотор для РНК-поли-меразы бактериофага Т7, определяющий более высокий уровень экспрессии генов. В последовательности вектора pRSET также находится полигиститидиновая (poly-His) последовательность (рис. 3), которая позволяет выявлять рекомбинантный белок с помощью анти-His антител и проводить очистку белка методом металл-хе-латной аффинной хроматографии. Таким образом, нами были получены конструкции в двух типах векторов, определяющих разный уровень экспрессии клонированных генов. Полученные конструкции pRSETb-RhGRH2NodC, pRSETb-MlNodC, а также pUC19-RhGRH2NodC, pUC19-MlNodC были использованы для трансформации штаммов E. coli C41 и DH5a.
1.4. ГЕТЕРОЛОГИЧНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ФЕРМЕНТА N-АЦЕТИЛГЛЮКОЗАМИНИЛТРАНСФЕ-РАЗЫ (NODC) ДВУХ ВИДОВ РИЗОБИЙ В КЛЕТКАХ E. COLI
Для гетерологичной экспрессии фермента ризобий N-ацетилглюкозаминил-трансферазы (NodC) нами были использованы два типа клеток E. coli — DH5a и С41. Штамм DH5a является универсальным штаммом, под-
\o o
o
«
U
ts §
X tx ü
o
Qi U
•ts §
CD ^
o o c X
U
о «
о &
С
Рис. 3. Схема экспрессирующих конструкций в векторах pRSETb и pUC19, содержащих последовательности генов NodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803. His6 — шесть остатков гистидина; RhGRH2NodC — последовательность гена NodC штамма Rhizobium sp. GRH2; MlNodC — последовательность гена NodC штамма M. loti 1803; T7 — промотор Т7; LacZ — промотор гена ß-галактозидазы
ходящим как для стандартных процедур клонирования генов, так и для экспрессии белков. Мутантный штамм С41 получен на основе штамма BL21 (DE3) и специально разработан для эффективной наработки мембранных белков, которые часто являются токсичными для клеток.
При экспрессии в штамме E. coli С41 генетических конструкций в векторе pRSETb, содержащих полноразмерные гены NodC Rhizobium sp. GRH2 и M. loti 1803, наблюдали синтез белков с молекулярной массой около 50 кДа (рис. 4 а, б), что соответствовало ожидаемой массе для N-ацетилглюкозаминилтрансферазы. Уровень экспрессии белков при этом был достаточно высоким. Максимальное содержание рекомбинантных белков, выделенных из клеток, культивируемых в присутствии ИПТГ, наблюдали в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 4000 об/мин (фракция 1 на рисунке 4 а, б). Обычно при такой скорости центрифугирования осаждаются особые белковые образования — тельца включения (от англ. inclusion bodies). Некоторое количество рекомбинантного белка присутствовало также в нерастворимой фракции, полученной при осаждении при 16000 об/мин (фракция 2 на рисунке 4 а, б). В этой фракции преимущественно находятся мембранные белки. В растворимой фракции (цитозоль) рекомбинант-ные белки выявлены не были (фракция 3 на рисунке 4 а, б). При Вестерн-блот анализе фракций 1 и 2 штамма Rhizobium sp. GRH2 наблюдали окрашивание дополнительной полосы белка с меньшей молекулярной массой, чем основной белок NodC. Появление такой полосы может быть связано с протеолизом синтезируемого белка.
Для оптимизации условий экспрессии фермента ри-зобий N-ацетилглюкозаминилрансферазы, кодируемого геном NodC, в бактериях E. coli нами были подобраны оптимальный температурный режим и время культивирования бактерий. В ходе проделанной работы был проведен сравнительный анализ уровня экспрессии белка при культивировании при 28 и 37 °С, а также в течение 2 и 24 часов после добавления в среду индуктора ИПТГ (рис. 5). Было показано, что уровень синтеза рекомби-нантного белка увеличивается при увеличении времени
Рис. 4. Экспрессия рекомбинантных белков NodC Rhizobium sp. GRH2 (I) и M. loti (II) в клетках E. coli С41, трансформированных генетическими конструкциями pRSETb-RhGRH2NodC и pRSETb-MlNodC. Бактерии E. coli культивировали в течение 24 часов в присутствии или отсутствии ИПТГ. Белки, экстрагированные из различных субклеточных фракций клеток E. coli, были разделены методом ДСН-электрофореза в ПААГ и окрашены красителем Кумасси бриллиантовым синим (а и в) или перенесены на нитроцеллюлозу и гибридизованы с анти-His антителами (б и г). контроль — нерастворимая фракция клеток, трансформированных вектором pRSETb без вставки, которая была получена при 16 000 об/мин; 1 — нерастворимая фракция, полученная при осаждении при 4000 об/м ин; 2 — нерастворимая фракция, полученная при осаждении при 16 000 об/ мин; 3 — растворимая фракция, полученная при 16 000 об/мин. «-» — экспрессия белка в отсутствии ИПТГ; « + » — экспрессия белка в присутствии ИПТГ
культивирования (рис. 5 а). При температуре культивирования 37 °С весь белок накапливается в виде белковых образований телец включения, независимо от времени культивирования. Однако при 28 °С часть белка остается в связанном с мембранами состоянии (рис. 5 б).
Уровень экспрессии рекомбинантных белков в клетках E. coli DH5a был также оценен при использовании генетических конструкций pUC19-MlNodC и pUC19-RhGRH2NodC, полученных в другом типе вектора (рис. 6 а, б). Так как в составе экспрессируемых рекомбинантных белков, полученных при этом, отсутствовала poly-His последовательность, мы проводили сравнение с белками, полученными с помощью конструкций в pRSETb. Было показано, что уровень синтеза рекомбинантного белка при использовании конструкций в векторе pUC19 был ниже по сравнению с тем, который наблюдался при экспрессии белка с помощью вектора pRSETb. Однако при этом белок не образовывал нерастворимых образований телец включения и был сосредоточен главным образом в мембранной фракции, полу-
ченной при 16 000 об/мин. Кроме того, было показано, что конструкции в векторе pUC19 не являются строго ИПТГ-индуцибельными.
Таким образом, в результате проведенных исследований мы оценили уровень экспрессии белка-фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы двух видов ризо-бий M. loti 1803 и Rhizobium sp. GRH2 в клетках E. coli с помощью созданных нами генетических конструкций, полученных на основе векторов pRSETb и pUC19. Это позволило нам приступить к биосинтезу хитоолигосаха-ридов в бактериях.
1.6. СИНТЕЗ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТКАХ E. COLI
Для оценки ферментативной активности экспресси-руемых в бактериях E. coli белков была изучена их способность синтезировать хитоолигосахариды. Для синтеза хитоолигосахаридов штаммы E. coli, несущие конструкции с клонированным полноразмерным геном NodC двух видов ризобий, инкубировали в среде с субстратом N-ацетилглюкозамином. Известно, что в бактериях
24 часе
супер 4000
осадок 4000
супер осадок 16000 16000
66
45
Эб
25
У
2 часа
супер 4000
осадок 4000
супер 16000
осадой 16000
116 66
45
24 часа
2 часа
супер осадок супер осадок 4000 4000 16000 16000
супер осадок супер осадок 4000 4000 16000 16000
/
116 66
45
35
35
25
25
Рис. 5. Анализ уровня экспрессии белка NodC M. loti 1803 в клетках бактерий E. coli C41 при температуре 37 °С (а) и 28 °С (б). Сн — супернатант (надосадочная жидкость)
присутствует фермент, катализирующий превращение ^ацетил^-глюкозамина в УДФ^-ацетилглюкозамин, который необходим бактериям для синтеза муреина клеточной стенки. Так как УДФ-^ацетил^-глюкозамин является также субстратом для синтеза хитоолигосахаридов, то удобство получения этих соединений в бактериях заключается в возможности использовать другой более дешевый субстрат N-ацетилглюкозамин вместо УДФ-^ацетилглюкозамина (Samain et al., 1997).
После завершения синтеза экстрагировали хитолиго-сахариды из клеток E. coli и проводили их предварительную очистку. Синтезированные соединения разделяли методом ВЭЖХ. О синтезе хитоолигосахаридов судили по появлению на хроматограммах соединений, время выхода которых соответствовало стандартам — гекса-N-ацетилхитогексаозе и пента-^ацетилхитопентаозе. Мы показали, что уровень синтеза хитоолигосахаридов отличается при использовании разных штаммов. При культивировании бактерий E. coli DH5a, несущих плаз-миду pUC19-RhGRH2NodC со встроенным геном NodC Rhizobium sp. GRH2, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина были синтезированы гекса-^аце-тилхитогексаоза и пента^-ацетилхитопентаоза (рис. 7).
После культивирования в течение 24 ч основным синтезируемым продуктом была пентаоза (рис. 7 а), а после 48 ч — гексаоза (рис. 7 б). Количество синтезируемых хитоолигосахаридов составляло до 20—50 миллиграмм на литр бактериальной культуры. При культивировании бактерий E. coli DH5a, несущих плазмиду pUC19-MlNodC со встроенным геном NodC M. loti 1803, в присутствии предшественника N-ацетилглюкозамина была синтезирована пента-Ы-ацетилхитопентаоза (рис. 8 в), количество которой в среднем составляло около 100—200 миллиграмм на литр бактериальной культуры. Таким образом, мы показали, что рекомбинантные ферменты обладают всеми свойствами нативных ферментов и могут быть использованы для синтеза двух типов хитоолигосахаридов — гек-са^-ацетилхитогексаозы и пента^-ацетилхитопентао-зы. Синтез хитоолигосахаридов происходил внутри клеток культивируемых бактерий, без выделения в среду.
Напротив, при использовании культуры клеток E. coli С41, содержащих плазмиду pRSETb-^GRH2NodC или pRSETb-MlNodC, нам не удалось выявить сколько-нибудь значительного синтеза хитоолигосахаридов (рис. 7 г). Мы полагаем, что возможная причина этого заключается в формировании белком телец включения. Рекомбинант-
Рис. 6. Экспрессия рекомбинантного белка NodC Rhizobium sp. GRH2 (а) и M. loti (б) в клетках E. coli DH5a, трансформированных генетическими конструкциями pUC19-RhGRH2NodC и pUC19-MlNodC. Бактерии E. coli культивировали в течение 24 часов в присутствии или отсутствии ИПТГ. Белки, экстрагированные из различных субклеточных фракций клеток E. coli, были разделены методом ДСН-электрофореза и окрашены красителем Кумасси бриллиантовым синим. Обозначения: 1 — нерастворимая фракция, выделенная из клеток E. coli С41 при экспрессии в них конструкции pRSETb-RhGRH2NodC и полученная при осаждении при 4000 об/мин; 2 — нерастворимая фракция, выделенная из клеток E. coli DH5a при экспрессии в них конструкции pUC19-RhGRH2NodC и полученная при осаждении при 4000 об/мин; 3 — нерастворимая фракция, выделенная из клеток E. coli DH5a при экспрессии в них конструкции pUC19-RhGRH2NodC и полученная при осаждении при 16 000 об/мин; «-» — экспрессия белка в отсутствии ИПТГ; « + » — экспрессия белка в присутствии ИПТГ. Аналогичные обозначения представлены на рисунке б для конструкций, содержащих ген MlNodC
ный белок синтезируется на высоком уровне при использовании конструкций в векторе pRSETb, но ферментативной активности он не проявляет из-за того, что формирует нерастворимые скопления и, следовательно, является неактивным. Таким образом, использование разных векторов для создания конструкций оказалось оправданным, поскольку уровень активности рекомбинантных белков при экспрессии в E. coli может быть разным.
1.7. МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ХИТООЛИГОСАХАРИДОВ, ПОЛУЧЕННЫХ БИОСИНТЕТИЧЕСКИМ СПОСОБОМ
Для подтверждения того, что синтезированные в клетках E. coli соединения являются гекса^-ацетил-хитогексаозой и пента-^ацетилхитопентаозой, нами был использован метод масс-спектрометрии. Проведенный анализ соединений, собранных после разделения на колонке и соответствующих времени выхода стандартов, показал присутствие на спектрограммах мажорных пиков с соотношением массы к заряду (m/z) равным 1259,5 для пробы, содержащей гекса^-ацетилхитогек-саозу (рис. 8 а), и 1056,7 для пробы, содержащей пента-N-ацетилхитопентаозу (рис. 8 б).
Молекулярная масса пента^-ацетилхитопентаозы составляет 1033, а гекса-^ацетилхитогексаозы — 1236. Однако в процессе масс-спектрометрического анализа, как правило, к исследуемому веществу присоединяется
катион — ион Na+ (молекулярная масса равна 23) или протон H+ (молекулярная масса равна 1). Следовательно, полученные массы веществ соответствуют катионам [mw + Na]+: 1033 + 23 = 1056 — для пента-^ацетил-хитопентаозы и 1236 + 23 = 1259 — для гекса-^аце-тилхитогексаозы. Проведенный анализ подтвердил, что синтезированные вещества являются пента-^ацетил-хитопентаозой и гекса^-ацетилхитогексаозой.
Таким образом, в результате выполненных нами исследований была изучена возможность ферментативного синтеза двух типов хитоолигосахаридов — гекса-^аце-тилхитогексаозы и пента^-ацетилхитопентаозы — с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы клубеньковых бактерий Rhizobium sp. GRH2 и M. loti. Были получены штаммы E. coli, содержащие генетические конструкции с клонированными генами RhGRH2NodC и MlNodC, кодирующими фермент N-ацетилглюкоза-минилтрансферазу двух видов ризобий. При культивировании полученных штаммов в присутствии субстрата N-ацетилглюкозамина были синтезированы олигомеры хитина со степенью полимеризации шесть и пять остатков N-ацетилглюкозамина (гекса-^ацетилхитогекса-оза и пента-^ацетилхитопентаоза), структура которых была подтверждена методом масс-спектрометрии. Количественный выход составил — 20-50 мг гекса-^ацетил-хитогексаозы и пента-^ацетилхитопентаозы на 1 литр
Рис. 7. Хроматограммы разделения хитоолигосахаридов, полученных при синтезе в культуре клеток штаммов E. coli DH5a (а, б, в) и C41 (г). а — разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы Rhizobium sp. GRH2 после культивирования в течение 24 часов; б — культивирование в течение 48 часов; в — разделение продуктов реакции, полученных с помощью фермента N-ацетилглюкозаминилтрансферазы M. loti 1803 после культивирования в течение 24 часов. Стрелками указаны пики, соответствующие пента-^ацетилхитопентаозе и гекса-^ацетилхито-гексаозе. 1 —6 — обозначения стандартов олигомеров (n = 1 —6)
бактериальной культуры штамма E. соИ, содержащего конструкцию pUC19-RhGRH2NodC, и 100-200 мг пен-та^-ацетилхитопентаозы — при использовании штамма E. соИ с конструкцией pUC19-MlNodС. Масс-спектромет-рический анализ подтвердил, что синтезированные соединения является хитоолигосахаридами со степенью полимеризации пять и шесть остатков ^ацетилглюкозамина.
Работа была выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки России ГК, № 16.512.11.2183 и соглашение № 8056 (выполнение исследований в рамках НОЦ), РФФИ 12-08-01044-а, Совета по грантам Президента РФ, № 16.120.11.337-НШ, с использованием оборудования ЦКП «Аналитический центр нано- и биотехнологий ГОУ СПбГПУ» на базе ФГБОУ ВПО «СПбГПУ».
ЛИТЕРАТУРА
1. КочетковН.К., 2000. Твердофазный синтез олиго-сахаридов и гликоконъюгатов // Успехи химии. Т. 69, № 9. С. 869-896.
2. Albersheim P., Darvill A. G., McNeil M, Valent B., Sharp J. K., 1983. Oligosaccarins, naturally occurring carbohydrates with biological regulatory functions // Structure and Function of Plant Genomes / Eds. Ciferri O., Dure I. L. New York, Plenum. P. 293-312.
3. Bettler E, Samain E., Chazalet V. et al., 1999. The living factory: in vivo production of N-acetyllactosamine containing carbohydrates in E. coli // Glycoconju-gate J. Vol. 16. P. 205-212.
4. Boons G.-J., 1996. Strategies in oligosaccharide synthesis // Tetrahedron. Vol. 52. P. 1095-1121.
5. BowenA.R, Chen-Wu J.L., MomanyM. et al., 1992. Classification of fungal chitin synthases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 89, N 2. P. 519-523.
6. Dhugga K. S., Anderson P. C, Nichols S. E, 2000. Expression of chitin synthase and chitin deacetylase genes in plants to alter the cell wall for industrial uses and improved disease resistance. W0/2000/009729, USA.
60 —
40 —
20 —
0 —I
ДГБК Q
MUwU
1259,5
ДГБК
ass sit
I | I I 1 Г | 1 I I 1
400
600
-Г | I I Г I р
800
1—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—|—I—I—I—I—Г
1000
1200
ДГБК
MassfCharge
1056.7
I
«UM
w!
I|*wo » J.....jl|l»iln 111 niHi 1.1 >|I ^
II I f 11 II 111Г t| П Г1| I Mil I MI 11 M I |l M If МП 11 ГМ| I [ M | II M |l I M 11 IM [П U г ni [ [ 11 M [11 M| I II I |M 1Г | N11 rn lljl I MI MI l| II M 111 El |Г| MT11 Г( 11 ГТ|| t III | II 11 |l
W SN M m III M 1IM !IM
Рис. 8. Спектрограммы веществ, анализ которых был проведен с помощью метода масс-спектрометрии. ДГБК — матрица
7. Gagneux P., Varki A., 1999. Evolutionary considerations in relating oligosaccharide diversity to biological function // Glycobiology. Vol. 9, N 8. P. 747-755.
8. Geremia R. A., Mergaert P., Geelen D. et al., 1994. The NodC protein of Azorhizobium caulinodans is an
N-acetylglucosaminyltransferase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 91. P. 2669-2673. 9. Endo T., Koizumi S., Tabata K., Ozaki A., 2000. Large-scale production of CMP-NeuAc and sialylated oligosaccharides through bacterial coupling // Appl. Microbiol. Biotech. Vol. 53. P. 257-261.
10. Inoue H., Nojima H., Okayama H., 1990. High efficiency transformation of E. coli with plasmids // Gene. Vol. 96. P. 23-28.
11. Harish Prashanth K. V., Tharanathan R. N, 2005. Depolymerized products of chitosan as potent inhibitors of tumor-induced angiogenesis // Biochim. Bio-physic. Acta. Vol. 1722. P. 22- 29.
12. Kamst E., vanderDrift K.M. G.M., Thomas-Oates J.E., Lugtenberg B.J., 1995. Mass spectrometric analysis of chitin oligosaccharides produced by Rhizobi-um NodC protein in E. coli // J. Bacteriol. Vol. 177. P. 6282-6285.
13. Kamst E, Pilling J., Raamsdonk L. M. et al., 1997. Rhizobium nodulation protein NodC is an important determinant of chitin oligosaccharide chain length in Nod factor biosynthesis // J. Bacteriol. Vol. 179. P. 2103.
14. Kamst E., Bakkers J., QuaedvliegN.E.M. et al., 1999. Chitin oligosaccharide synthesis by rhizobia and ze-brafish embryos starts by glycosyl transfer to O4 of the reducing-terminal residue // Biochemistry. Vol. 38. P. 4045-4052.
15. Khan W., Prithiviraj B., Smith D.L., 2003. Chitosan and chitin oligomers increase phenylalanineammonia-lyase and tyrosine ammonia-lyase activities in soybean leaves // J. Plant Physiol. Vol. 160. P. 859-863.
16. Koizumi S., 2003. Large-scale production of oligosaccharides using bacterial functions // Trends Glycosci. Glycotechnol. Vol.15, N 82. P. 65-74.
17. Koping-HoggardM., VarumK.M., IssaM. et al., 2004. Improved chitosan-mediated gene delivery based on easily dissociated chitosan polyplexes of highly defined chitosan oligomers // Gene Therapy. Vol. 11. P. 1441-1452.
18. Kunz C., Rudloff S., Baier W., Klein N., Strobel S., 2000. Oligosaccharides in human milk: structural, functional and metabolic aspects // Annu. Rev. Nutr. Vol. 20. P. 699-722.
19. Lee S. Y., Rasheed S., 1990. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. Vol. 9, N. 6. P. 676-679.
20. Lopez-Lara I.M., Orgambide G., Dazzo F.B. et al., 1993. Characterization and symbiotic importance of acidic extracellular polysaccharides of Rhizobium sp. strain GRH2 isolated from acacia nodules // J. Bacteriology. Vol. 175, N 10. P. 2826-2832.
21. Lopez-Lara I. M., van den Berg J. D. J., Thomas-Oates J.E. et al., 1995. Structural identification of the lipo-chitin oligosaccharide nodulation signals of Rhizobium loti // Molec. Microbiology. Vol. 15, N 4. P. 627-638.
22. McAuliffe J. C., Hindsgaul O., 2000. Carbohydrates in medicine // Molecular and cellular glycobiology / Eds. Fukuda M., Hindsgaul O., New York, Oxford University Press. P. 249-285.
23. Mergaert P., D'Haeze W., GeelenD. et al., 1995. Biosynthesis of Azorhizobium caulinodans Nod Factors // J. Biolog. Chem. Vol. 270, N. 49, P. 29217-29223.
24. Miroux B., Walker J. E., 1996. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels // J. Molecular Biology. Vol. 260. P 289-298.
25. Murata T., Usui T., 2006. Large-scale Production of Oligosaccharides Using Bacterial Functions // Biosci. Biotechnol. Biochem. Vol. 70, N 5. P. 1049-1059.
26. Parlato M. C., Kamat M.N., WangH. et al., 2008. Application of glycosyl thioimidates in solid-phase oligo-saccharide synthesis // J. Org. Chem. Vol. 73, N 5. P. 1716-1725.
27. Perugino G., Trincone A., Rossil M., Moraccil M., 2004. Oligosaccharide synthesis by glycosynthases // Trends in Biotechnology. Vol. 22, N 1. P. 31-37.
28. Priem G., Gilbert M., Wakarchuk W. W. et al., 1997. A new fermentation process allows large-scale production of human milk oligosaccharides by metabolically engineered bacteria // Carbohydrate Research. Vol. 302. P. 35-42.
29. Ruffing A., Chen R. R., 2006 a. Metabolic engineering of microbes for oligosaccharide and polysaccharide synthesis // Microbial Cell Factories. Vol. 5. P. 25.
30. Ruffing A., Mao Z., Chen R. R., 2006b. Metabolic engineering of Agrobacterium sp. for UDP-galactose regeneration and oligosaccharide synthesis // Metabolic Engineering. Vol. 8. P. 465-473.
31. Samain E., Drouillard S., Heyraud A. et al., 1997. Gram-scale synthesis of recombinant chitooligosac-charides in Escherichia coli // Carbohydrate Research. Vol. 302. P. 35-42.
32. Silverman S. J., 1989. Similar and different domains of chitin synthases 1 and 2 of Saccharomyces cerevisiae. Two isozymes with distinct functions // Yeast. Vol. 5. P. 459-467.
33. Simunek J., Koppova I., Filip L. et al., 2010. The antimicrobial action of low-molar-mass chitosan, chitosan derivatives and chitooligosaccharides on bifidobacteria // Folia Microbiologica. Vol. 55, N 4. P. 379-382.
34. Spaink H.P., SheeleyD.M., van BrusselA.A.N. et al., 1991. A novel highly unsaturated fatty acid moiety of lipooligosaccharide signals determines host specificity of Rhizobium // Nature. Vol. 354. P. 125-130.
35. ThanouM., FloreaB.I., Geldof M. et al., 2002. Quat-ernized chitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines // Biomaterials. Vol. 23, N 1. P. 153-159.
36. Venkatesan J., Pangestuti R., Qian Z.-J. et al., 2010. Biocompatibility and alkaline phosphatase activity of phosphorylated chitooligosaccharides on the osteosar-coma MG63 Cell Line // J. Func. Biomaterials. Vol. 1. P. 3-13.
37. Xu Q, Dou J., Wei P. et al., 2008. Chitooligosaccha-rides induce apoptosis of human hepatocellular carcinoma cells via up-regulation of Bax // Carbohydrate Polymers. Vol. 71. P. 509-514.
BIOSYNTHESIS OF HEXA- AND PENTAMERIC CHITOOLIGOSACCHARIDES USING N-ACETYL-GLUCOSEAMINYL TRANSFERASE FROM RHIZOBIAL BACTERIA
Leppyanen I. V., Artamonova T. O, Lopatin S. A., Varlamov V. P., Tikhonovich I. A., Dolgikh E.A.
C SUMMARY: Chitooligosaccharides find wide application that determines considerable interest in their use. Enzymatic synthesis of hexa-N-acetylchitohexaose and penta-W-acetylchitopentaose using N-acetyl-glucoseaminyl transferase enzyme possessing unique features from rhizobial bacteria Rhizobium sp. GRH2 and M. loti has been performed in E. coli cells. Cultivation of bacteria E. coli expressing the appropriate recombinant enzyme resulted in synthesis of significant amounts of desired chitooligosaccharides (milligrams per liter). Analysis of synthesized chitooligosacchairdes by methods of high performance liquid chromatography and mass-spectrometry confirmed the conformity of the synthesized compounds to standards.
C KEY WORDS: chitooligosaccharides; enzymatic synthesis; N-acetyl-glucoseaminyl transferase.
C Информация об авторах
Леппянен Ирина Викторовна — младший научный сотрудник. Лаборатория молекулярной и клеточной биологии. ГНУ ВНИИСХМ. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, Подбельского ш., д. 3. E-mail: [email protected].
Артамонова Татьяна Олеговна — научный сотрудник. Санкт-Петербургский государственный политехнический университет. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., д. 29. E-mail: [email protected].
Лопатин Сергей Александрович — к. х. н., старший научный сотрудник. Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН. 117312, Москва, 60-летия Октября пр-т, д. 7, корп. 1. E-mail: [email protected].
Варламов Валерий Петрович — д. х. н., заведующий лабораторией, профессор. Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН. 117312, Москва, 60-летия Октября пр-т, д. 7, корп. 1. E-mail: [email protected].
Тихонович Игорь Анатольевич — д. б. н., профессор, академик РАСХН. ГНУ ВНИИСХМ. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, Подбельского ш., д. 3. E-mail: [email protected].
Долгих Елена Анатольевна — к. б. н., ведущий научный сотрудник. Лаборатория молекулярной и клеточной биологии. ГНУ ВНИИСХМ. 196608, Санкт-Петербург, Пушкин, Подбельского ш., д. 3. E-mail: [email protected].
Leppyanen Irina Viktorovna — scientist. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelskiy chausse, 3, Saint-Petersburg, Pushkin, 196608, Russia. E-mail: [email protected].
Artamonova Tatyana Olegovna — scientist. St.Petersburg State Polytechnical University. Russia, 195251, St.Petersburg, Polytechnicheskaya, 29.. E-mail: [email protected].
Lopatin Sergey Aleksandrovich — PhD. Center "Bioengineering" of RAS. 7, building 1, Prospect 60-letia Oktyabrya, 117312, Moscow. E-mail: [email protected].
Varlamov Valeriy Petrovich — doctor of science. Center "Bioengineering" of RAS.
7, building 1, Prospect 60-letia Oktyabrya, 117312, Moscow. E-mail: [email protected].
Tikhonovich Igor Anatolyevich — doctor of science, professor, academician of RAAS. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelskiy chausse, 3, Saint-Petersburg, Pushkin, 196608, Russia. E-mail: [email protected].
Dolgikh Yelena Anatolyevna — PhD, group leader. All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology. Podbelskiy chausse, 3, Saint-Petersburg, Pushkin, 196608, Russia. E-mail: [email protected].
