CC BY
20
УДК 616.932:616-093/-098 ;;
Л.Р.Николеишвили, Л.С.Подосинникова
’ I
КОМПЛЕКСНОЕ ВЛИЯНИЕ НЕКОТОРЫХ АБИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
НА ПЕРЕХОД ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ В НЕКУЛЬТИВИРУЕМОЕ СОСТОЯНИЕ
1
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
•I
\\ ' :
Показано достоверно значимое влияние на скорость процесса образования некультивируемых форм холерных вибрионов совместного действия некоторых абиотических факторов в различных сочетаниях.
По мнению многих исследователей [1, 2 и др.], для холерных вибрионов как возбудителей кишечной инфекции пребывание во внешней среде: является неизбежным и «носит не случайный характер», а обусловлено взаимоотношениями микро- и макроорганизма.
Обнаружение у бактерий некультивируемого состояния (НС) обусловило возможность нового подхода к анализу экологических и молекулярногенетических механизмов существования возбудителей инфекций в природе. Знание этих механизмов необходимо для оценки факторов, обеспечивающих микроорганизмам существование в качестве естественных компонентов природных биоценозов, а это, в свою очередь, позволит понять природу эндемич-ности и резервации патогенных бактерий в мёжэпи-зоотические (межэпидемические) периоды. I
В связи с важностью изучения экологических аспектов перехода холерных вибрионов в некульти-вируемое состояние особого внимания заслуживают работы, посвященные роли биотических и абиотических факторов водоемов в этом процессе.
Считается, что сигналом для перехода бактерий в НС является ухудшение условий среды. В отдельных экспериментах для инициации перехода.! в НС холерных вибрионов используют воздействие пониженной температуры в сочетании с условиями голодания [3, 6, 8]. Имеются сведения о влиянии температуры на образование некультивируемых;;форм (НФ) независимо от содержания питательных веществ в среде [7]. Показан переход холерных вибрионов в НФ в морской, речной и дистиллированной воде [4, 5].
Многочисленные, но разрозненные сведения не позволяют определить закономерности формирования некультивируемых форм холерных вибрионов в объектах окружающей среды и объективно оценить их роль в сохранении возбудителя холеры в ,межэ-пидемический период.
Цель настоящей работы - изучение раздельного и комплексного влияния некоторых абиотических экологических факторов: температуры, освещенности и различной солености среды на переход в не-культивируемое состояние токсигенных и нетокси-генных холерных вибрионов.
Материалы и методы
В работе было использовано 9 типичных по родовым и видовым свойствам с1х+ и с1х" штаммов
V. сИо1егае 01 и V. сИ.о1егае 0139 серогруппы. Для получения НФ конструировали микрокосмы на основе автоклавированной речной и морской (Азовского и Черного моря) воды. В качестве контроля использовали дистиллированную воду и 0,85 % №С1. Для облегчения визуального контроля морфологии и подсчета клеток под микроскопом концентрацию холерных вибрионов доводили путем разведения в среде культивирования до 109 кл./мл. Пробы содержали при температуре 4-6 и 8-10 °С без освещения и в условиях постоянной искусственной освещенности в 300 люкс.
Высевы на агаровые среды производили ежедневно в течение 30 дней, затем один раз в неделю и в месяц. Некультивируемыми считали вибрионы в пробе, в высевах из которой на агаровых средах не обнаружено выросших колоний, но витальными методами окрашивания выявлены живые бактериальные клетки или ДНК с1х-гена методом ПЦР.
Полученные нами материалы анализировали с учетом влияния на скорость перехода холерных вибрионов в НС сочетанного действия двух и более факторов.
Результаты и обсуждение
Использование разного температурного режима содержания микрокосм показало, что наиболее быстрый переход холерных вибрионов в НС происходил при температуре 4-6 °С, как при постоянном искусственном освещении, так и без него (рис. 1).
В микрокосмах с речной водой при температуре 4-6 °С без искусственного освещения штаммы V. сИокгае 01 переходили в НС через 12-15 сут. У холерных вибрионов 0139 серогруппы время перехода в НС в тех же условиях колебалось от 30 до 50-60 сут. . . .
При инкубировании холерных вибрионов в микрокосмах с водой Азовского моря НФ холерных вибрионов 01 серогруппы получены в течение 60 сут, а О 139 серогруппы - 75-90. В воде из Черного моря в тех же условиях штаммы V. ско1егае О\ переходили в НС в более поздние сроки - 90-150 сут, а холерные вибрионы 0139 серогруппы в течение 180 сут сохраняли жизнеспособность (срок наблюдения). В 0,85 % растворе №С1 время перехода в НС колебалось у V. с!го1егае 01 от 30 до 40, а у холерных вибрионов 0139 серогруппы - от 40 до 75 сут. В дистиллированной воде при температуре 4-6 °С штаммы V. с1го1егае 01 переходили в НС че-
Рис. 1. Продолжительность сохранения в культивируемом состоянии холерных вибрионов и время образования НФ в микрокосмах при 4-6 °С (средние показатели):
I si - переход в НС,
I I - сохранение в культивируемом состоянии
рез 30-40 сут, холерные вибрионы 0139 серогруп-пы - в среднем через 45 сут, однако имели место и более поздние (до 120 сут) сроки.
В условиях постоянного искусственного освещения в микрокосмах с речной водой при температуре 4-6 °С время перехода в НС, в отличие от аналогичных микрокосм без освещенности, было более продолжительным: в 4,1 раза в речной воде (V. cho-lerae 01 - 90, а V. cholerae 0139 - 120-180 сут), в воде Азовского моря в 1,7 раз (V. cholerae 01 - 120, V. cholerae 0139 - 100-150 сут), в 0,85 % растворе NaCl в 2,3 раза (V. cholerae 01 - 120-130, V. cholerae 0139 - 120-150 сут). В воде Черного моря НФ V. cholerae 01 в течение 190-210 сут сохраняли жизнеспособность. У холерных вибрионов 0139 серогруппы имел место переход в НС через 120— 270 сут. В дистиллированной воде время перехода в НС V. cholerae 01 так же, как и без освещения, колебалось в пределах 30—45 сут, а холерных вибрионов 0139 серогруппы - 60 сут.
Повышение температуры культивирования до 8-10 °С выявило увеличение сроков перехода в НС холерных вибрионов (рис. 2).
Культивирование холерных вибрионов разных серогрупп и токсигенности при 8—10 °С без искусственного освещения увеличило сроки перехода в НС в микрокосмах с речной водой в 7,4 раза (V. cholerae 01 - 150-180, V. cholerae 0139 - 240-300 сут), в воде Черного моря в 1,6 раза (V. cholerae 01 и 0139 - 210-230 сут), в 0,85% растворе NaCl в 1,8 раза (V. cholerae 01 - 75—80, V. cholerae 0139 — 114— 120 сут). В дистиллированной воде независимо от токсигенности V. cholerae обоих серогрупп переходили в НС через 30-40 сут.
Освещение микрокосм и при 8-10 °С еще более увеличило время перехода холерных вибрионов в НС, в речной воде в 1,3 раза (V. cholerae 01 - 240-260, V. cholerae 0139 - 290-360 сут), в воде из Черного моря в 1,3 раза (V. cholerae 01 - 275-280, V. cholerae 0139 - 280-340 сут), в 0,85% растворе
ИаС1 в 2,8 раза (V. с/го/егае 01 - 240-260, V. сИо1е-гае 0139 - 250-270 сут). В дистиллированной воде V. сЬо1егае 01 переходили в НС через 28^5 сут, а холерные вибрионы 0139 серогруппы независимо от токсигенности - через 30 сут.
Несмотря на наиболее короткие сроки перехода холерных вибрионов в НС при температуре 4—6 °С выявлено влияние на их продолжительность освещенности и состава среды. Например, в микрокосмах речной воды, гДе соленость гораздо ниже, чем из воды Черного моря, при постоянном искусственном освещении время перехода V. сЬо1егае 01 в НС оказывается в 6,8, а V. сНо1егае 0139 в 3,7 раза больше, чем без нее. В микрокосмах с водой Азовского моря освещенность в среднем в 1,7 раза увеличивала эти сроки, а в воде из Черного моря - в 1,2 раза. При культивировании холерных вибрионов в 0,85 % растворе ИаС1 сроки перехода в НС в условиях освещенности увеличивались в 2,3 раза. В дистиллированной воде не выявлено влияния ни освещенности, ни повышения температуры до 8-10 .°С на переход холерных вибрионов в НС.
В условиях микрокосм с различной соленостью среды, температурой содержания и освещенностью не выявлено зависимости перехода в НС холерных вибрионов от их токсигенности. Обнаружено лишь различие в скорости образования НФ холерными вибрионами разных серогрупп. Различия в скорости перехода в НС V. сЬо1егае 01 и 0139 особенно выражены в микрокосмах с морской и речной водой. Так, например V. сЬо1егае 01 в микрокосмах с1 речной водой без освещения в 3,1 раза быстрее переходили в НС, чем V. сИо1егае 0139, с освещением сроки перехода в НС у V. сЬо1егае 0139 увеличились в 1,2-1,7 раза (рис. 3).
В микрокосмах с водой из Черного моря образования НФ у V. сЬо1егае 0139 серогруппы не зарегистрировано, но продолжительность сохранения в культивируемом состоянии была в 1,7 раза больше, чем у V. сИо1егае 01. При искусственном освещении НФ у V. сЬо1егае 01 в воде из Черного моря не получено, а сроки образования НФ у V. сЬо1егае 0139
Рис. 2. Скорость образования НФ холерных вибрионов в микрокосмах при 8-10 °С (средние показатели)
Рис. 3. Сравнительный анализ скорости перехода в;НС в различных микрокосмах холерных вибрионов О Г и 0139 серогруппы при 4 °С без освещения '■
были более продолжительными. ,
Таким образом, наряду с выявлением значимости в переходе в НС холерных вибрионов каждого из перечисленных выше факторов, показано ^достоверно значимое влияние на скорость процесса совместного действия их в различных сочетаниях. Сроки перехода в НС холерных вибрионов ^увеличивало как повышение температуры содержания микрокосм (1,6—7,4 раза), так и искусственная их освещенность (1,3-2,8 раза), что в сочетанном их влиянии оказывалось еще более выраженным (2,0-9,8 раза). Сочетанное влияние различной солености среды и температуры показало зависимость ббразо-вания НФ холерных вибрионов от солености, сред, что выразилось в более продолжительных .сроках формирования НФ холерных вибрионов во всех средах, содержащих микроэлементы по сравнению с дистиллированной водой без освещения как при 4-6 °С (1,8-3,7 раза), так и при 8-10 °С (2,8—6,4 раза). Сочетанное действие двух упомянутых выше факторов с искусственной освещенностью еще| более (7,7 раза) увеличило сроки формирования НФ холерных вибрионов.
Из изученных микрокосм в дистиллированной воде образование НФ холерных вибрионов при низких температурах происходило приблизительно в одинаковые сроки, не сказывались на их образовании ни освещенность,, ни температура содержания, что, очевидно, связано с минимальным содержанием в этой среде солей и добавлением питательного субстрата только в результате гибели и распада вибрионов.
Сложный или более разнообразный минераль-
ный состав воды Черного моря по сравнению с другими экспериментальными экосистемами способствовал более продолжительному сохранению в культивируемом состоянии холерных вибрионов, имеющих в основном прототрофный тип питания, что может косвенно свидетельствовать о значении минерализации среды в поддержании культивируемого состояния вибрионов.
Заключение
Низкие температуры, являющиеся основным фактором, запускающим переход холерных вибрионов в НС, в зависимости от состава экосистем реализуют индуцирующее действие в различные сроки. В дистиллированной воде, не содержащей солей и других факторов, влияющих на продолжительность сохранения холерных вибрионов в культивируемом состоянии, повышение температуры содержания микрокосм с 4-6 до 8-10 °С не удлиняло сроки перехода их в НС. Оценивая значимость экспериментальных данных о влиянии температуры на переход холерных вибрионов в НС, следует учитывать, что в летнее время наиболее теплые слои воды располагаются у поверхности, а холодные - у дна. Зимой с понижением температуры поверхностные холодные воды с температурой ниже 4 °С располагаются над сравнительно теплыми. По всей вероятности, температура 4-5 °С является пограничной зоной в формировании некультивируемых форм у микроорганизмов, что коррелирует с получением экспериментальных НФ именно при этой температуре [4, 5].
. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бароян О.В., Бургасов П.Н., Гайлонская И.Н., Мединский Г.М. // Вест. АМН. - 1975. - № 2. -С. 45-53.- 2. Литвин В.Ю.//ЖМЭИ. - 1995. - №6-С. 30-31. - З.Романова Ю.М., Чегаева Е.В., Гинцбург А.Л.// Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1998. - №3. -С. 3-8. - 4. Савельев В.Н., Грижебовский Г.Н., Брюханов А.Ф. // Пробл. комиссия «Холера и патоген, для человека вибрионы». - Ростов н/Д, 2001. - №14. - С. 24-26. -5. Соколенко . А.В. Морфология, ультраструктура, метаболизм некультивируемых форм холерных вибрионов.: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Ростов н/Д, 2000. - 18 с. - 6:Colwell R.R., Brayton P.R.., Grimes D.I. et al. // BioTechnology. -1985. - Vol. 3.. - P. 817-820,- 7. Oliver J.D:, Bockian R.// Appl. Envirion. Microbiol. - 1995. - Vol. 61, N7..- P. 2620-2627.- 8. Roszak D.B., Colwell R.B. // Microbiol. Rev. -1987.-Vol. 51, N3. - P. 365-379. - •
L.R.Nikoleishvili, L.S.Podosinnikova
Complex Influence of Certain Abiotic Factors Upon Transition of Cholera Vibrios into the Non-Culturing Form
Rostov-On-Dort Anti-Plague Research Institute
Various combinations of soriie abiotic factors acting simultaneously, were shown to produce significantly important effects upon the speed of the development of non-culturing cholera vibrio forms.
Поступила 10.11.03
