CC BY
53
Экспериментальная биология и медицина УДК 616-093/-098:576.8
ТРАНСФОРМАЦИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПРОФИЛЯ VIBRIO CHOLERAE O1/O139 В ПРОЦЕССЕ ОБРАТИМОГО ПЕРЕХОДА В НЕКУЛЬТИВИРУЕМОЕ СОСТОЯНИЕ
© Соколенко А.В.1, Миронов А.Ю.
Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова, Москва;
1 НИИ биологии Южного федерального университета, Ростов-на-Дону
E-mail: profmironov@mmascience. ru
На модели некультивируемых форм (НФ) Vibrio cholerae О1/О139 изучено изменение ферментативного профиля в процессе обратимой некультивируемой трансформации. Объект исследования - активность ферментов, ассоциируемых с вирулентностью (протеаза, лецитиназа, нейраминидаза, липаза, гемолизин), и ключевого фермент цикла Кальвина (характерного для метаболизма сапрофитов) - рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК). В процессе перехода в некультивируемое состояние (НС) происходит снижение активности ферментов, коррелирующих с вирулентностью, вплоть до утраты признака в НС. Ревертанты отличаются низким уровнем протеазной и липазной активности, что можно использовать для их дифференциации от вегетативных культур. При переходе в НС наблюдается экспрессия активности РДФК, причем как в токсигенных культурах, выделенных от человека, так и в атоксигенных, выделенных из окружающей среды. В НФ функционируют альтернативные метаболические пути, свойственные сапрофитам. Трансформация ферментативного профиля при обратимом переходе в НС носит регуляторный характер.
Ключевые слова: некультивируемые формы, холерные вибрионы, ферментативный профиль, трансформация.
TRANSFORMATION OF ENZYMATIC PROFILE OF VIBRIO CHOLERAE O1/O139 IN THE PROCESS OF REVERSIBLE TRANSITION TO THE UNCULTIVATED STATE Sokolenko A. V.1, Mironov A. Yu.
I.M. Setchenov First Moscow State Medical University, Moscow;
1 Research Institute of Biology of Southern Federal University, Rostov-on-Don The change of the enzymatic profile of Vibrio cholerae O^O139 in the process of reversible uncultivated transformation was studied. Protease, lecithinase (phospholipase), neuraminidase (sialidase), lipase, hemolysin are associated with virulence of V. cholerae. Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (RuBisCO) are the carbon-fixing key enzyme of the Calvin cycle distinguishing for saprophyte metabolism. All of these enzymes were the objects of our study. It was found that the activity of enzymes associated with virulence was reduced in the process of uncultivated transformation and was lost in the uncultivated state. The recovered cells have the low level of protease and lipase activity and it can be used to differentiate vegetative cells. RuBisCO were expressed in the process of reversible the uncultivated state both in toxigenic strains isolated from human and nontoxigenic aquatic environmental strains. The current investigation confirmed the alternative metabolic pathways distinguishing for saprophytes function in uncultivated cells. The transformation of enzymatic profile in the process of the reversible uncultivated cells is that of the regulatory character.
Keywords: uncultivated forms, Vibrio cholerae, enzymatic profile, transformation.
Некультивируемыми называют формы бактерий (НФ), которые при наступлении неблагоприятных условий утрачивают способность расти на питательных средах, но остаются жизнеспособными и возобновляют деление при улучшении условий культивирования. Некультивируемое состояние (НС) обнаружено более чем у 85 видов микроорганизмов, многие из которых являются патогенными для человека, животных, растений. Этим обусловлен интерес исследователей к феномену некультивируемости и биологическим свойствам НФ [3, 10, 11, 18].
В НФ наблюдаются количественные и качественные изменения метаболизма. На 20-80% снижается интенсивность, активируются альтернативные метаболические пути [12, 13, 17, 21], что затрудняет обнаружение возбудителей в ана-лите, усложняет характеристику НФ и их ревер-тантов. Изучение изменений ферментативного
профиля в процессе обратимого перехода в НС способствует пониманию механизмов образования НФ и направлено на разработку новых методов дифференциации вегетативных, НФ и ревер-тантов.
На модели НФ V. cholerae и других вибрионов изучены условия индукции НС и некоторые биологические свойства [8, 14, 15]. Сведений об изменении ферментативного профиля в НС V. cholerae О1/О1ЗД мы не обнаружили. В процессе перехода в НС происходит замедление ферментативной активности на средах с углеводами и аминокислотами, сокращается число утилизируемых субстратов вплоть до полной утраты признака, наблюдается гиперфункция ключевых ферментов дыхательной цепи: NADH-дегидрогеназы и сук-цинатдегидрогеназы, маркерных ферментов ЦПМ - АТФ-азы и 5-нуклеотидазы [6]. Изменения диссимиляции глюкозы позволили предпо-
ложить перестройку метаболизма, увеличение доли гликолитических реакций и разрыв цикла Кребса, что характерно для автотрофов.
Цель работы - выяснить, действительно ли в некультивируемых клетках холерных вибрионов протекают реакции цикла Кальвина (пентозофос-фатного пути), характерные для бактерий-сапрофитов, изучить изменение активности ферментов, ассоциируемых с вирулентностью (протеаза, лецитиназа, липаза, нейраминидаза, гемолизин) в вегетативных, некультивируемых популяциях и их ревертантах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Использовались штаммы V. смієте 01 и 0139 серогруппы из музея живых культур РостНИП-ЧИ. Штамм V. смієте 01 17551, єЬог, сґх+ выделен от больного холерой, V. смієте 01 13790 єі-^г, сґх~, V. смієте 0139 17673, сґх~ выделены из поверхностных водоемов. НФ получали в микрокосмах с водой разного происхождения [7]. Использовались вегетативные, переходные, НФ, ре-вертанты I и/или II порядка. Вегетативная культура - взвесь бактерий, выросших в течение 18 часов на агаре Мартена, рН 7,6-7,8 при t 37оС, суспендированных в 0,85% растворе №С1 или в воде различного состава (в зависимости от целей эксперимента). Переходная культура - высев 0,1 мл бактериальной взвеси из микрокосма на агар Мартена, рН 7,6-7,8, число КОЕ составляет 10-100 кл/мл, в то время как окрашивание акридиновым оранжевым или непрямой прижизненный подсчет фиксировали жизнеспособные клетки в концентрации 5х10х9-10х9 кл/мл. НФ - при высеве на агар Мартена 0,1 мл взвеси из микрокосма рост не обнаруживается, но непрямые методы выявляют жизнеспособные особи в концентрации 10х7-10х8 кл/мл. Ревертанты I порядка -видоспецифическия культура, выросшая на плотной питательной среде после индукции реверсии. Ревертанты II порядка - ревертанты I порядка после пассажа на жидкой питательной среде с последующим высевом на плотную питательную среду. Перед проведением экспериментов бактериальные взвеси разных форм выравнивали по ОП Е560 на спектрофотометре ^-77.
Активность липазы (твиназы), протеазы, ле-цитиназы определялась на агаре Мартена, рН 7,67,8, с добавлением соответствующих субстратов. Культуры высевали газоном d 10 мм. Субстрат для липазы - 1% твин-20, твин-60, твин-80 + 0,01% СаС12; для протеазы - обезжиренное коровье молоко в конечной концентрации 10%; для лецитиназы - желток куриного яйца, суспендированный в 10 мл 0,85% №С1 в конечной концен-
трации 25%. О наличии протеазной активности свидетельствовала зона помутнения вокруг посева, протеазной и лецитиназной - зоны лизиса.
Активность нейраминидазы: 20 мкл гриппозного диагностикума (Санкт-Петербургский НИИ вакцин и сывороток) разводили 1:2 0,85% NaCl (6 ГЕ) + 20 мкл исследуемой бактериальной взвеси + 20 мкл эритроцитов морской свинки. Бактериальные взвеси титровали двукратно до 1/8 титра. Инкубировали 45 мин 37оС, затем 18 часов при 20-22оС. При наличии в пробе нейрамини-дазной активности эритроциты оседали на дно лунки в виде «пуговки», в отрицательных пробах - в виде «зонтика».
Гемолитическую активность определяли в пробе Грейга, как описано в п. 1.6.5.2. «Инструкции по организации и проведению противохолерных мероприятий» № 01-19/50-11 от 09.06.95. Полуколичественный учет активности проводили в соответствии с методикой.
Для определения активности рибулозодифос-фаткарбоксилазы (РДФК) [2] 50 мл переходных или НФ центрифугировали 10 мин при 10 тыс. об/мин, осадок ресуспендировали в 50 мМ трис-SO4 буфера, еще раз центрифугировали. Осадок разрушали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 10 мин на холоду. Реакционная смесь содержала: 18 мМ трис-Cl буфер, pH 8,0, 20 мМ MgCl2 x 6H2O; 10 мМ дитиотреитола, 4 мМ рибозо-5-фосфата и 500 мкл суспенизии разрушенных клеток. Пробы инкубировались при 30оС в течение 30 мин с целью ферментативного превращения рибозо-5-фосфата в рибулозо-5-фосфат. Затем в реакционную смесь добавляли 0,026 мМ NaH14CO3, 6 мМ АТФ;
0,6 мМ NADH и инкубировали 5 мин. Останавливали реакцию 0,02 мл 100% ТХУ. Подсчет активности фермента вели в сцинтилляционном счетчике Mark-II. Поскольку содержание белка в пробах могло существенно варьировать, активность фермента выражали в условных единицах, которые получали делением тыс. импульсов в минуту на мкг/белка.
Для индукции реверсии НФ in vitro 5 мл НФ из микрокосмов переносили в стерильные стеклянные пробирки, инкубировали при 20-22оС или 37о С 1-10 сут в присутствии: 1% пептонной воды (0,2 мл на 1 мл среды) или 0,2 мл/мл бульона Мартена, 5 мкл/мл (1400 ЕД/л) каталазы из бычьей печени, 15 мкл /мл рабочего раствора липоевой кислоты (250 мг на 5мл ДМСО), ежедневно высевая по 0,1 мл взвеси на агар Мартена, рН 7,6-7,8. При обнаружении специфических колоний на плотной питательной среде проводили основные и дополнительные видоспецифические тесты в соответствии с «Инструкцией по организации и
проведению противохолерных мероприятий» № 01-19/50-11 от 09.06.95.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась с применением методов вариационной статистики, рекомендованных для медико-биологических исследований, на 1ВМ РС АТ Репйит IV. Результаты обработаны при помощи пакета программ BioStat 2008 5.8.4.З. для Windows 98. Показатели представлены в виде средней арифметической вариационного рядя и ее стандартной ошибки (М±т). Достоверность различий средних величин оценивалась с использованием ^критерия Стьюдента. «Нулевая гипотеза» об отсутствии различий между сравниваемыми выборками отвергалась при уровне значимости р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Факторами вирулентности холерных вибрионов многие называют различные гидролитические ферменты: лецитиназу (КФ З.1.4.З. и З.1.4.4.), липазу (КФ 3.1.) протеазу (КФ 3.4.21-24), нейра-минидазу (КФ 3.2.1.18) и другие [1, 5, 9, 19, 20]. Изменения ферментативной активности на разных этапах некультивируемости приведены в табл. 1. При добавлении в агар Мартена эфиров лауриновой, пальмитиновой и олеиновой кислот (твин-20, твин-60, твин-80) в присутствии СаС12 в случае положительной реакции вокруг бактериальных газонов формировалась зона помутнения из кристаллов кальциевого мыла. Используемые в работе вегетативные культуры утилизировали твины с разной интенсивностью: 100% штаммов проявляли липазную активность на среде с твин-20 через 72 часа культивирования.
При добавлении в агар твинов с более длинной цепью жирной кислоты (твин-60, твин-80), уменьшалось количество штаммов, специфически гидролизирующих субстрат. Утилизация твинов в
переходных культурах атоксигенного штамма серогруппы О]39 не выявлена, токсигенной культуры серогруппы О1 - замедлена, проявляется только в присутствии твин-20. Водный атокси-генный штамм эльтор сохранял в переходном состоянии способность утилизировать твины, за исключением твин-80.
Вегетативные культуры используемых в работе штаммов проявляли лецитиназную и проте-азную активность. Под действием ферментов на чашках с агаром Мартена с добавлением субстрата вокруг газонов формировалась зона просветления, различной ширины и степени прозрачности, в зависимости от штамма.
В переходных культурах протеазная активность сохранялась на уровне, сравнимом с вегетативными популяциями. Лецитиназная - в полном объеме выявлена только у штамма V. с^1егае О1 13790 и его устойчивого к пероксиду водорода клона, причем как в переходных культурах, так и у ревертантов. Переходные популяции V. с^1егае
О1 17551 утрачивали лецитиназную активность, а у штамма V. с^1егае Ош 17673 активность на средах с желтком замедлена и проявлялась на 3 сутки. Утилизация твинов в культурах атоксиген-ного штамма сергоруппы О^9 не выявлена, токси-генной культуры биовара эльтор - замедлена и только в отношении твина-20. Водный атокси-генный штамм эльтор сохранял в переходном состоянии способность утилизировать твины, за исключением твин-80.
Изучение активности ферментов в культурах ревертантов исходных штаммов позволило выявить отличия от вегетативных клеток и предложить дифференциальный тест. В первые сутки ревертанты I порядка не гидролизуют молоко, а через трое суток ширина зоны лизиса в 4-7 раз меньше, чем у вегетативных культур. Аналогичные результаты получены в присутствии твин-20. В первые сутки вокруг газонов не формировался ореол помутнения, а через трое суток средняя
Таблица 1
Активность протеазы, лецитиназы, липазы V. с^ієтє Оі/Оі39 на этапах обратимой трансформации в НС
протеаза лецитиназа твин-20 твин-60 твин-80
Штаммы Форма зона, мм зона, мм зона, мм зона, мм зона мм
24 ч 72 ч 24 ч 72 ч 24 ч 72 ч 24 ч 72 ч 24 ч 72 ч
V. cholerae O117551 исходная 2 8 1 7 2 6 4 12 - 3
переходная 2 10 - - - 4 - - - -
ревертант - 2 1 6 - 2 2 7 - -
V. cholerae O139 17673 исходная 2 7 1 5 2 7 - - - 3*
переходная 2 12 - 3 - - - - - -
ревертант - 1 1 4 - 1 - 1 - -
V. cholerae O1 13790 исходная 5 10 3 5 3 11 - 12 - 4
переходная 3 10 1 6 - 5 4 11 - -
ревертант - 2 - 3 - 3 - - - -
ширина зоны составила 2 мм, против 8 мм у вегетативной культуры. В отношении твин-60 не получено четких дифференцирующих данных. Ре-вертанты токсигенного штамма эльтор гидролизовали субстрат, а серогруппы О139 - замедленно и с меньшей интенсивностью. Ревертанты I порядка атоксигенного штамма эльтор не возобновили утилизации твина-60. Дифференциальные свойства твина-80 близки твину-20, однако в некоторых случаях у вегетативных форм штамма серогруппы О139 зона помутнения не выявлялась, что снижает достоверность показателей. При пассажах на питательных средах (бульон-чашка) протеазная и липазная активность восстанавливались после второго пересева (ревертанты II порядка). НФ из микрокосмов с речной водой на агаре Мартена с добавлением различных твинов, обезжиренного молока и желтка не проявляли специфической ферментативной активности и не возобновляли рост, причем как при 4оС, так и при 22оС и 37оС.
В процессе обратимого перехода в НС происходит репрессия активности ферментов, ассоциируемых с вирулентностью: протеазы, лецитиназы, липазы, гемолизина. Активность изученных ферментов снижается в ряду: вегетативные формы -переходные формы - НФ, вплоть до полной утраты признака. У ревертантов гидролазная активность возобновляется, но на более низком уровне.
В некоторых случаях НФ могут подвергаться делению только на жидких питательных средах. Чтобы исключить влияние на результаты агрегатного состояния среды, проведены дополнительные исследования. Переходные популяции из микрокосмов с речной водой и НФ разного возраста, полученные в речной и морской воде, оса-
ждали центрифугированием 15 мин при 10 тыс. g, отмывали фосфатным буфером, еще раз центрифугировали и ресуспендировали в 4 мл мясо-пептонного бульона. Полученные микробные взвеси использовали параллельно с вегетативными агаровыми культурами для постановки пробы Грейга (табл. 2).
Переходные культуры замедлено и слабо ге-молизировали эритроциты. В некультивируемых популяциях гемолитической активности не выявлено. В отличие от слабо активных переходных культур и инактивных НФ ревертанты, полученные in vitro, демонстрировали восстановление характерных для данного штамма гемолитических свойств, за исключением штамма V. cholerae O1 17551, который в переходной форме, наряду с культурой ревертанта, лизировал эритроциты барана.
Изучение активности нейраминидазы направлено на получение информации об изменении активности фермента, кодируемого генами не входящими в состав VPI-I, а VPI-2. Вегетативные культуры проявляли нейраминидазную активность (табл. 3). В культуре V. cholerae O1 до % титра, в культуре атоксигенного штамма V. chol-erae O139 - до 1/8 титра.
В переходных культурах обоих штаммов активность фермента снижалась до V титра. В НФ, независимо от возраста и среды микрокосма, ней-раминидазная активность не выявлена. В популяциях ревертантов наблюдалось возобновление функционирования фермента, но на более низком уровне, чем в вегетативных пробах. Лабораторный клон V. cholerae, устойчивый к перекиси водорода, не проявлял нейраминидазной активности ни в одной из исследуемых биологических форм.
Таблица 2
Гемолитическая активности в пробе Грейга V. с^1егае О1/О1ЗД на разных этапах перехода в НС
Штамм Форма Г емолиз
V. cholerae O1 17551 вегетативная -
переходная ++
НФ, 1 мес., речная вода -
НФ, 1 мес., морская вода -
НФ, 2 мес., дистиллированная вода -
ревертант I порядка +++
V. cholerae O1 13790 вегетативная ++++
переходная ++
НФ, 1 мес., речная вода -
НФ, 1 мес., морская вода -
НФ 2 мес., дистиллированная вода -
ревертант I порядка ++++
V. cholerae O139 17673 вегетативная ++++
переходная ++
НФ 1 мес., речная вода -
НФ 3 мес., дистиллированная вода -
ревертант I порядка ++++
Таблица 3
Нейраминидазная активность V. с^1егае О1/О1ЗД в процессе обратимого перехода в НС
Штаммы Форма/возраст Активность нейраминидазы / титры
V. cholerae O1 17551 вегетативная 1/4
переходная, речная вода 1/2
НФ, речная вода, 1 мес. -
НФ, дистиллированная вода, 3 мес. -
НФ, морская вода, 1 мес. -
ревертант I порядка 1/4
V. cholerae O1 17551 R H2O2 вегетативная -
НФ дистиллированная вода, 1 мес. -
ревертант I порядка
V. cholerae O139 17673 вегетативная 1/8
переходная, речная вода 1/2
НФ, речная вода, 1 мес. -
НФ, дистиллированная вода, 3 мес. -
НФ, морская вода, 1 мес. -
ревертант I порядка 1/4
сут. сут.
Активность РДФК на разных этапах перехода в НС.
Рис. 1.
Вероятным объяснением выявленного снижения активности ферментов вирулентности в переходных культурах и утрата признака в НС является регуляторное изменение метаболизма и перестройка его по сапрофитическому типу в оли-готрофных, низкотемпературных условиях.
Множество факторов окружающей среды (температура, кислотность, осмолярность и др.) стимулируют регуляцию генов вирулентности [16; 22]. Для проверки этого предположения проведены эксперименты по изучению активности ключевого фермента сапрофитического цикла Кальвина - рибулозодифосфаткарбоксилазы (РДФК) (4.1.1.39).
РДФК катализирует в цикле Кальвина две различные реакции: фиксацию СО2, в результате которой происходит образование двух молекул 3-фосфоглицерата и фиксацию О2, в результате которой синтезируются две молекулы 2-
фосфогликолата. Акцептором СО2 в этом цикле является активированная молекула пентозы. РДФК катализирует акцептирование рибулозо-1,5-дифосфатом молекулы СО2 и последующее расщепление образовавшейся гексозы на 2 молекулы 3-ФГК (3-фосфоглицераткиназы) [4]. Это наиболее экономичный метаболический процесс, который свойственен микроорганизмам, живущим в олиготрофных условиях.
Активность РДФК изучали в вегетативных, переходных и НФ, полученных в микрокосмах разного состава. В переходных и некультивируе-мых популяциях содержание белка существенно варьировало, достигая максимальных значений через 7 суток НС, минимальных - в НФ старше 30 суток. В связи с тем, что экспериментальные образцы выравнивались по концентрации клеток микроорганизмов, активность РДФК выражали в имп/мин/мкг белка (рис. 1).
В вегетативных популяциях обоих штаммов радиоактивность образцов не превышала значений фона, что указывает на отсутствие экспрессии фермента. В переходной культуре V. сЫ1ете
О1 17551 радиоактивность образца увеличилась по сравнению с фоновыми значениями в 2,1 раза, в аналогичных по возрасту пробах V. с^1егае О^9 17673 не обнаружено достоверных изменений. Через 15 суток в пробе токсигенного штамма эль-тор активность РДФК превышала исходный уровень в 3,2 раза. В образцах атоксигенной культуры серогруппы О]39 также произошло увеличение радиоактивности, превысив фоновые значения 1,9 раза. В некультивируемых популяциях обоих штаммов активность РДФК продолжала расти, достигнув максимальных значений в 30-суточных популяциях.
В процессе перехода в НС в клетках холерных вибрионов активируются альтернативные, более экономичные метаболический пути, в частности цикл Кальвина. Активность ключевого фермента восстановительного петнозофосфатного пути -РДФК - зависит от длительности пребывания в условиях микрокосма и не имеет прямых коррелятивных связей с концентрацией белка в переходных и некультивируемых клетках, так как об-
щее содержание протеинов в клетке отражает тотальный уровень процессов адаптации.
Изучалось влияние состава среды микрокосма на активность РДФК в НФ (табл. 4).
Концентрация белка варьировала в зависимости от возраста популяции. Максимальные значения отмечены в пробах с витамином Е. Из микрокосма с НФ V. cholerae 17551 получена реверсия in vitro, в этих же пробах увеличение активности РДФК минимально. Это указывает на защитное действие антиоксиданта на биосинтетические структуры клетки в НС.
Активность РДФК в вегетативных образцах обоих штаммов не превышала фоновых значений. После перехода в НС отмечена экспрессия активности фермента. Пик в функционировании наблюдали в 30-суточных НФ. Максимальные показатели активности РДФК зафиксированы в 30-суточных токсигенных культурах из микрокосмов с дистиллированной водой (30,685 имп/мин/мкг белка) и в пробах такого же возраста с добавлением каталазы (27,930 имп/мин/мкг белка). В образцах атоксигенного штамма через 30 суток пребывания в НС в дистиллированной воде активность РДФК возрастала в 11,2 раза, в микрокосмах с добавлением янтарной кислоты -
Таблица 4
Активность РДФК V. cholerae O1/O139 в НФ, полученных в микрокосмах разного состава
Штаммы Среда микрокосма Форма / возраст Белок, мкг/мл Имп / мин / мкг белка
Контроль (фон) - - 2,000
физ. раствор вегетативная 70 1,833
дистиллированная вода НФ 7 суток 100 4,118
НФ 30 суток 20 30,685
НФ 60 суток 18 7,716
витамин Е НФ 7 суток 110 4,862
V. cholerae O1 17551 НФ 30 суток 38 9,210
НФ 60 суток 20 2,668
каталаза НФ 30 суток 30 27,930
НФ 60 суток 25 3,969
N^0 НФ 7 суток 57 4,505
янтарная кислота НФ 60 суток 20 12,075
физ. раствор вегетативная 70 2,311
дистиллированная вода НФ 7 суток 85 4,073
НФ 30 суток 20 22,418
НФ 60 суток <20 3,634
НФ 7 суток 95 5,627
витамин Е НФ 30 суток 40 7, 325
V. cholerae O139 17673 НФ 60 суток 30 1,404
каталаза НФ 30 суток 30 13,531
НФ 60 суток 20 8,606
янтарная кислота НФ 30 суток <20 37,333
НФ 60 суток <20 11,201
N^0 НФ 7 суток 90 4,073
КШ3 НФ 30 суток 35 13,531
в 18,6 раза. Через 60 суток радиоактивность некультивируемых образцов V. cholerae Oi 17551 превышала фоновые значения в 1,5-4,2 раза, V. cholerae O139 - в 1,8-6,7 раза, за исключением двухмесячной пробы с витамином Е, в которой значения ниже фоновых.
Таким образом, выявлена экспрессия РДФК в процессе перехода в НС, что указывает на функционирование автотрофного метаболического пути - цикла Кальвина. Активность фермента в НС выявлена как у токсигенного штамма серо-группы О1, в свое время выделенного от человека, так и у водного атоксигенного серогруппы О139. В процессе некультивируемой трансформации в переходных популяциях происходит экспрессия активности фермента, которая достигает своего максимума в 30-суточных популяциях, утративших рост на питательных средах. По мере старения культур активность РДФК снижается, что, вероятно, связано с уменьшением уровня внутриклеточного АТФ, поскольку снижение концентрации аллостерических регуляторов, не зависимо от концентрации субстрата, приводит к замедлению фиксации СО2. Истощение внутриклеточных ресурсов и низкая интенсивность фиксации углекислого газа должны неминуемо привести к гибели клетки.
На фоне экспрессии РДФК, активность секре-тируемых ферментов вирулентности (протеазы, липазы, лецитиназы, нейраминидазы, гемолизина) постепенно снижается вплоть до утраты в НС. Выявленные различия протеазной и липазной активности позволяют не только получить представление о функционировании метаболических процессов некультивируемых популяций, но и дифференцировать ревертанты и вегетативные формы холерных вибрионов. Данный тест может быть использован при мониторинге водных объектов окружающей среды, в экспериментальной работе с некультивируемыми микроорганизмами. Динамика активности функционирования РДФК на фоне депротеинизации клетки в стареющих популяциях и репрессии секреции гидролаз указывают на уменьшение биологического потенциала холерных вибрионов в НС и объясняет отсутствие вирулентности НФ на моделях in vivo. Функционирование альтернативных метаболических путей в популяциях некультивируемых холерных вибрионов носит временный характер и ограничивается пулом внутриклеточных энергетических соединений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бугоркова Т.В., Шмеркевич Д.Л., Наумшина М.С. Характеристика штаммов холерных вибрионов биовара эльтор по протеолитической и лецити-назной активности // Биохимия, патофизиология и
микробиология особо опасных инфекций. - Саратов, 1983. - С. 76-82.
2. Бурша О.С., Каграманов B.C., Соколенко A.B. Определение активности рибулозодифосфаткар-боксилазы у инактивных вариантов V. cholerae el-tor // Журн. микробиол., эпидемиол. и вирусол. -1999. - № б. - С. 90-91.
3. Гинцбург A.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапронозов во внешней среде // Журн. микробиол., эпидемол. и иммунобиол. - 1997. - № 3. -С. 116-121.
4. Гусев М.В., Минеева ЛЛ. Микробиология. - М. : Изд-во МГУ. - 2006. - 464 с.
5. Смирнова Н. И. Основные факторы патогенности холерных вибрионов и их генетический контроль // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1987. - № 7. - С. 102-108.
6. Соколенко A.B., Каграманов В.С., Aсеева Л.Е., Бурша О.С., Саямов С.Р. Морфология и ферментативная активность некультивируемых форм холерных вибрионов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2002. - № 5. - С. 15-21.
7. Соколенко A.B., Aлексеева Л.П., Ломов Ю.М., Че-мисова О.С. Изучение взаимодействия некультивируемых форм холерных вибрионов с моноклональными антителами к липополисахариду О1 и О139 серогрупп // Биотехнология. - 2004. - № 3. -С. 87-92.
8. Тафельштейн Э.Е., Голубинский Е.П., Марамо-вич A.С., Урбанович Л.Я., Буренина Л.Ф., Миронова Л.В., Саппо С.Г., Марков Е.Ю., Капустин Ю.М., Белобородов Ю.В. Экспериментальное получение некультивируемых форм Vibrio cholerae eltor и характеристика их биологических свойств // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. -№ 1. - С. 13-18.
9. Уралева В.С., Черепахина И.Я., Фецайлова О.П. Оценка значимости некоторых свойств для вирулентности Vibrio cholerae и выявления их коррелятивных связей // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1984. - № 10. - С. 58-63.
10. Четина Е.В., Грижебовский Г.М., Брюханов A.Ф., Хайтович A.B., Курбанов Ш.К., Гинцбург A.Л. О возможном механизме эндемичности современной холеры (роль некультивируемых форм Vibrio cholerae O1) // Молек. генет., микробиол. и вирусол. -1993. - № б. - С. 18-22.
11. Colwell R.R. Nonculturable but still viable and potentially pathogenic // Int. J. Med. МюгоЬю1. Virol. Para-sitol. Infect. Dis. - 1993. - Vol. 279, N 2. - P. 154156.
12. Forsman M., Henningson E. W, Larsson E., Johansson T., Sandstrom G. Francisella tularensis does not manifest virulence in viable but non-culturable state // FEMS МюгоЬю1 Ecol. - 2000. - Vol. 31, N 3. -P. 217-224.
13. Heim S., Lleo M.M., Bonato B., Guzman C.A., Canepari P. The viable but nonculturable state and starvation are different stress responses of Enterococcus faecalis, as determined by proteome analysis // J. Bacteriol. - 2002. - V. 184, N 23. -P. 6739-6745.
14. Islam M.S., Rahim Z., Alam M.J. Association of Vibrio cholerae O1 with the cyanobacterium, Anabaena sp., elucidated by polymerase chain reaction and transmission electron microscopy // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 1999. - V. 93, N 1. - P. 36-40.
15. Islam M.S., Jahid M.I., Rahman M.M., Rahman M.Z., Islam M.S., Kabir M.S., Sack D.A., School-nik G.K. Biofilm acts as a microenvironment for plankton-associated Vibrio cholerae in the aquatic environment of Bangladesh // МісгоЬюі. Immunol. -2007. - V. 51, N 4. - P. 369-379.
16. Liu Z., Stirling F.R., Zhu J. Temporal quorum-sensing induction regulates Vibrio cholerae biofilm architecture // Infect. Immun. - 2007. - V. 75, N 1. - P. 122126.
17. Lowder M., Oliver J.D. The Use of Modified GFP as a Reporter for Metabolic Activity in Pseudomonas putida // Міа-ob. Ecol. - 2001. - V. 41, N 4. - P. 310313.
18. Oliver J.D. The viable but nonculturable state in bacteria // J. of МісгоЬюі. - 2005. - V. 43. - P. 93-100.
19. Oliver V., Haines G.K.3rd., Tan Y., Satchell K.L. Hemolysin and the multifunctional autoprocessing RTX toxin are virulence factors during intestinal infection of mice with Vibrio cholerae ElTor Oi strains // Infect. Immun. - 2007. - V. 75, N 10. - P. 5035-5042.
20. Vaitkevicius K., Lindmark B., Ou G., Song T., Toma C., Iwanaga M., Zhu J., Andersson
A., Hammarstrom M.L., Tuck S., Wai S.N. A Vibrio cholerae protease needed for killing of Caenorhabditis elegans has a role in protection from natural predator grazing // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2006. -V. 103, N 24. - P. 9280-9285.
21. Villarino A., Rager M.N., Grimont P.A., Bouvet O.M. Are UV-induced nonculturable Escherichia coli K-12 cells alive or dead? // Eur. J. Biochem. - 2003. -V. 270, N 12. - P. 2689-2695.
22. Zhu J., Miller M., Vance R. Dziejman M., Bassler
B.L., Mekalanos J.J. Quorum sensing regulations control virulence gene expression in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2002. - V. 99, N 5. -P. 3129-3134.
