CC BY
18
Полушкина Л. Б., Мартынкевич И. С., Шуваев В. А., Фоминых М. С., Мотыко Е. В., Мартыненко Л. С., Иванова М. П., Цыбакова Н. Ю., Волошин С. В., Бессмельцев С. С.,
Чечеткин А. В.
ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА», г. Санкт-Петербург
КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ПРОГНОЗ ПЕРВИЧНОГО МИЕЛОФИБРОЗА
Polushkina L.B., Martynkevich I.S., Shuvaev V. A., Fominykh M.S., Motyko E. V., Martynenko L.S., Ivanova M. P., Cybakova N. Y., Voloshin S. V., Bessmelcev S. S., Chechetkin A. V.
Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Saint-Petersburg, Russia
COMPLEX EVALUATION OF GENETIC FACTORS EFFECT ON PROGNOSIS IN PRIMARY MYELOFROBROSIS
Резюме. Корреляция ряда генетических аберраций в опухолевых клетках с выживаемостью больных первичным миелофиброзом и широкая распространенность сочетанных геномных повреждений указывает на необходимость поиска новых моделей оценки прогноза. В данной работе проанализировано влияние кариотипа, драйверных мутаций, мутаций генов эпигенетической регуляции и их комбинации на общую выживаемость среди 110 пациентов с диагнозом ПМФ. Показано, что кариотип высокого риска, тройной негативный статус и наличие терминирующей мутации в гене АБХЫ ассоциированы сф короткой выживаемостью. Статистически значимо отличались медианы общей выживаемости в группах пациентов, сформированных по комплексу характеристик «наличие драйверной мутации/ АБХЬ1 статус» (р<0,0001) и «кариотип/ АБХЬ1 статус» (р = 0,0005). Наиболее короткая выживаемость отмечена у тройных негативных пациентов с мутацией в гене АБХЬ1 (медиана 0,9 года). Среди больных, которым было проведено цитогенетическое исследование, обнаружение хромосомных аберраций высокого риска и/или мутации в гене АБХЬ1 в равной степени ухудшало прогноз. Полученные данные могут быть использованы для стратификации пациентов в группы риска в дополнение к имеющимся прогностическим шкалам.
Ключевые слова: первичный миелофиброз, мутации, кариотип, прогноз.
Correlation of some genetic aberrations in tumor cells with the survival of primary myelofibrosis patients and the wide prevalence of combined genomic lesions require new prognostic models. We analyzed the effect of karyotype, driver mutations, gene mutations of epigenetic regulation, and their combination on overall survival among 110 patients diagnosed with primary myelofibrosis. Detrimental influence of high-risk karyotype, triple-negative status and nonsense and frameshift mutations of ASXL1 gene was shown. Medians of overall survival were significantly different in groups formed by complex characteristics "presence of a driver mutation/ ASXL1 status" and "karyotype/ASXL1 status". The shortest survival was observed in triple-negative patients with a mutation in the ASXL1 gene (median 0.9 years). Among patients with available karyotype of tumor cells, the detection of high-risk chromosomal aberrations and/or mutations in the ASXL1 gene worsened the prognosis equally. Obtained data can be used to stratify patients at risk groups in addition to the available prognostic scales.
Key words: primary myelofibrosis, mutations, karyotype, prognosis.
Введение. Первичный миелофиброз — тяжелое хроническое миелопролиферативное новообразование, проистекающее из трансформированной полипотентной гемопоэтической стволовой клетки [1, 2]. Экспансия патологического клона запускает процессы фиброза костного мозга, приводя к угнетению кроветворения, а его эволюция служит причиной малигнизации опухоли и развития острого миелоидного лейкоза [3, 4]. Очевидно, что свойства опухолевых клеток могут быть взаимосвязаны с характером течения заболевания. Основополагающей детер-минантой морфологических и функциональных свойств клетки является ее геном. Клональные аномалии генома при ПМФ включают хромосомные аберрации (ХА) [5, 6], драйверные (т. е. «пусковые») мутации (ДМ) в генах ^^, CALR, MPL, а также дефекты генов эпигенетической регуляции транскрипции, клеточного цикла, созревания РНК, являющихся «неспецифическими» событиями канцерогенеза [7, 8].
К настоящему времени опубликован ряд работ, демонстрирующих значимые отличия выживаемости больных в зависимости от выявленных генетических маркеров клонального гемопоэза. Неблагоприятные ХА (изолированные или 2 нарушения +8, 7^, i(17q), оту(3), 5^, 12р или перестройка 1^23, комплексный кариотип), отсутствие драйверной мутации, точечные повреждения генов ASXL1, EZH2, SRSF2, IDH1/2 ассоциированы со снижением общей выживаемости и выживаемости без лейкемической трансформации [11, 12, 13]. Мутации в гене CALR первого типа (L367fsX46 — делеция 52 пар оснований), напротив, являются благоприятным прогностическим фактором, коррелируя с наиболее длительной выживаемостью [14].
Учет данных цитогенетического анализа является неотъемлемой частью определения группы риска больного в соответствии с международной системой стратификации DIPSS+ [15, 16]. Исследование опухолевых клеток на наличие дру-
гих молекулярных повреждении редко выходит за рамки диагностического поиска, имеющего цель лишь подтвердить клональную природу заболевания. Это связано, главным образом, с отсутствием данных о комплексном влиянии выявляемых дефектов генома на прогноз при несомненной синергичности их действия. Около половины пациентов с диагнозом ПМФ имеет 2 и более соматические мутации [17], а частота аномалий кариотипа составляет 35-60 % в дебюте заболевания, увеличиваясь до 90 % при бласт-ной трансформации [5]. Таким образом, проблема совокупной оценки генетических факторов прогноза актуальна для большинства больных.
Выявление прогностически неблагоприятных сочетаний генетических дефектов позволит более уверенно интерпретировать данные кариоти-пирования и молекулярного анализа в контексте прогноза. Оценка свойств патологического клона особенно важна в группах пациентов «низкого» и «промежуточного-1» риска по шкале IPSS для определения объема и интенсивности терапевтических мер, а также для своевременного выявления кандидатов на аллогенную трансплантацию костного мозга.
Цель настоящей работы состояла в выявлении прогностически значимых сочетаний генетических аномалий опухолевых клеток у больных с первичным миелофиброзом.
Материалы и методы. В исследование были включены 110 пациентов с гистологически верифицированным диагнозом первичного мие-лофиброза (38 мужчин, 72 женщины), медиана возраста составила 59 лет (16-82 года), медиана наблюдения — 2,6 года (0,1-23,0 года). Распределение пациентов в соответствии с системами стратификации IPSS и DIPSS приведено в таблице 1.
Цитогенетическое исследование клеток костного мозга выполнено 48 (44 %) пациентам: 32 — в дебюте заболевания, 6 — в фазе прогрессии, 10 — в бластной фазе.
Таблица 1
Стратификация пациентов по группам риска
Шкала Группа риска
Низкий Промежуточный-1 Промежуточный-2 Высокий
IPSS 23,6 % 30,9 % 15,5 % 21,8 %
DIPSS 23,6 % 39,1 % 25,5 % 3,6 %
Замену V617F в гене и мутации 515
кодона гена MPL анализировали методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов. Исследование на наличие мутаций в генах CALR
(9 экзон), ASXL1 (12 экзон), ЮШ/2 (4 экзон) проводили методом прямого секвенирования, EZH2 (5, 8, 10, 17, 18, 19 экзоны) — методом плавления высокого разрешения с последую-
щей верификацией результатов прямым секве-нированием.
Статистическую обработку данных проводили с использованием программ STATISTICA 10.0 (StatSoft), Excel 2016 с надстройкой XL-STAT 2016 (Microsoft). Общую выживаемость анализировали методом Каплана-Майера с применением лог-рангового теста для оценки достоверности различий. В качестве точки отсчета выбирали дату постановки диагноза ПМФ. Регрессионный анализ проводили при помощи метода Кокса. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.
Результаты. Среди 90 (81,8 %) пациентов с драйверной мутацией ,Л4Х2-положительными (JAK2+) были 55 (50 %), CALR-положительными (CALR+) — 28 (25,5 %), MPL-положительными (MPL+) — 7 (6,4 %). Тройными негативными (ТН) были 20 (18,2 %) больных.
Мутации генов эпигенетической регуляции обнаружены у 23 человек (21,7 %): у 10(9,4 %) — мутации нонсенс и сдвига рамки считывания гена ASXL1 (мутации преждевременной терминации трансляции — ASXL1term), у 4 (3,8 %) — сочетание двух мутаций в гене ASXL1, у 5 (4,7 %) — миссенс мутации ASXL1mis, у 2 (1,9 %) — сочетание ASXL1term и EZH2, у 1 (0,9 %) — сочетание ASXL1term и IDH2, у 1(0,9 %) — IDH1.
Нормальный кариотип (НК) выявлен у 32 (66,7 %) человек, благоприятный (одиночные del(13)(q22), del(20)(q12)) — у 3 (6,3 %), промежуточного прогноза (одиночные del(6)(q15), add(6)(p25), del(X)(q22), t(X;7)(p21; q11)) — у 4 (8,3 %), неблагоприятный (+8 и другие трисомии (кроме +9), —7/7q-, i(17q), inv(3), —5/5q-, перестройки 11q и 12р, моносомии, 2 и более ХА) — у 9 (18,7 %). Хромосомные аберрации статистически значимо чаще выявляли на более поздних стадиях заболевания (21,9 % против 68,7 %, р = 0,004). Частота нормального кариотипа была значимо выше в хронической фазе (71,8 % против 31,2 %, р = 0,004), на поздних стадиях чаще выявляли повреждения с вовлечением 2 и более хромосом (56,3 % против 3,1 %, р<0,001).
При сравнении попарно общей выживаемости (ОВ) в группах с различными вариантами кариотипа не обнаружено статистически значимых отличий среди пациентов с НК (n = 32) и благоприятными ХА (n=3) (медиана выживаемости для НК составила 6 лет, не достигнута при благоприятных ХА, р = 0,264), а также среди больных с промежуточными (n=4) и неблагоприятными ХА (n=9) (р = 0,459, медиана выживаемости при неблагоприятном кариотипе была
равна 1,5 годам, максимальное время наблюдения в группе с ХА промежуточного прогноза составило 1,4 года и соответствовало единственному летальному исходу среди 4 наблюдений). Было принято решение выделить лишь две группы кариотипов — низкого и высокого риска, — включающие пациентов с НК и благоприятными ХА или ХА промежуточного и неблагоприятного прогноза, соответственно.
По данным однопараметрического регрессионного анализа на ОВ оказывали негативное влияние: мутации ASXL1term (отношение рисков (ОР) 2,9, 95 % ДИ 1,2-7,2, р = 0,018), кари-отип высокого риска (ОР 8,2, 95 % ДИ 2,5-27,3, р<0,001) и тройной негативный статус (ОР 8,1, 95 % ДИ 3,2-20,2, р<0,001). Мутации в гене CALR коррелировали с более длительной выживаемостью при пограничном уровне значимости (ОР 0,3, 95 % ДИ 0,1-1,0, р = 0,052). Мутации в генах JAK2 и MPL, а также миссенс мутации гена ASXL1 не оказывали статистически значимого влияния на выживаемость и не вошли в многопараметрический анализ.
Последовательное исключение переменных при проведении многопараметрического регрессионного анализа позволило определить, что ключевое негативное влияние на ОВ независимо друг от друга оказывают кариотип высокого риска (ОР 7,4, 95 % ДИ 2,3-23,7, р = 0,0008) и наличие терминирующей мутации в гене ASXL1 (ОР 2,8, 95 % ДИ 1,2-6,6, р = 0,023).
При оценке модели Кокса без учета кариотипа значимое влияние на ОВ оказывали отсутствие ДМ (ОР 2,4, 95 % ДИ 1,0-5,9, р = 0,050) и ASXL1+ статус (ОР 3,3, 95 % ДИ 1,3-8,5, р = 0,012), тогда как для мутаций в гене CALR отмечено превышение порога статистической значимости (ОР 0,3, 95 % ДИ 0,1-1,1, р = 0,075). Данный фактор был значим, когда в качестве ковариаты выступал только положительный ASXL1-статус (ОР 0,2, 95 % ДИ 0,1-0,7, р = 0,075), который также сохранял свою значимость в данной модели (ОР 3,9, 95 % ДИ 1,6-10,0, р = 0,0037). В модели, включавшей тройной негативный статус и положительный ASXL1-статус, оба параметра значимо влияли на выживаемость: ОР 3,6, 95 % ДИ 1,5-8,2, р = 0,003 и ОР 2,5, 95 % ДИ 1,0-6,1, р = 0,048, соответственно.
Таким образом, были определены комплексные генетические характеристики для сравнения общей выживаемости больных: «CALR/ ASXL1 статус», «наличие ДМ/ASXL1 статус», «кариотип/А£АХ1 статус». При анализе ОВ с учетом CALR/ASXL1 статуса наиболее корот-
кую выживаемость демонстрировали CALR~ А^^1+пациенты (медиана 2,5 года, р = 0,021) (рисунок 1). Пятилетняя выживаемость CALR+ ASXL1~ больных была несколько выше, чем CALR-ASXLГ: 93 % против 75 %, р = 0,124. Ста-
тистически значимых отличий ОВ между CALR+ ASXL1+ (медиана не достигнута при времени наблюдения 10,1 года) и CALR+ ASXL1 "(медиана 10,3 года), CALR+ ASXL1+и CALR~ ASXL1~ (медиана 13,5 года) пациентами не выявлено.
Рис. 1. Общая выживаемость пациентов с различной комбинацией генетических характеристик CALR/ASXL1
Медиана ОВ среди ТН ASXL1+ пациентов составила 0,9 года, ТН ASXL1~- 3,6 года, ДМ+ ASXLГ-13,8 лет, не достигнута в ДМ+ ASXL1+ группе (при времени наблюдения 10,3 года) (р<0,0001) (рисунок 2). Попарный анализ показал, что обнаружение терминирующей мутации
в гене ASXL1 значимо снижает ОВ ТН больных (р = 0,007). Общая выживаемость ДМ+ ASXL1+ пациентов была выше в сравнении с ДМ" ASXL1~ больными (р = 0,044). Значимых отличий ОВ у ДМ+ пациентов с различным ASXL1 статусом не выявлено (р = 0,788).
Рис. 2. Сравнение общей выживаемости пациентов в зависимости от наличия/отсутствия драйверной мутации и ASXL1-статуса
При комплексном учете АБХЬ1 статуса и ка-риотипа медиана ОВ АБХЬ1+ пациентов с кари-отипом низкого риска статистически значимо не отличалась у АБХЬ1~ пациентов с хромосомными аберрациями высокого риска (медиана 1,6 и 1,4 года, соответственно, р = 0,291). Статисти-
чески значимых отличий не было обнаружено и среди АБХЬ1+ пациентов с кариотипами низкого и высокого риска (медиана ОВ 1,6 и 1,2 года, р = 0,610). Медиана ОВ АБХЬ1~ пациентов с ка-риотипом низкого риска составила 6,4 года (р = 0,0005) (рисунок 3).
Рис. 3. Сравнение общей выживаемости у пациентов в зависимости от мутационного статуса гена АБХЬ1 и кариотипа
Обсуждение. Сочетание различных кло-нальных генетических аберраций в опухолевых клетках при ПМФ усложняет задачу оценки их влияния на прогноз. На сегодняшний день опубликованы лишь несколько работ, посвященных изучению комплексного влияния дефектов генома на выживаемость пациентов. Tefferi с соавт. [18] предлагают считать наиболее ценным прогностическим фактором CALR/ASXL1 статус, показав, что более длительную выживаемость независимо от DIPSS+ и IPSS стратификаций имеют CALR+ ASXL1~, а наименее длительную — CALR~ ASXL1+ больные. Vannucchi с со-авт. разработали усовершенствованный вариант IPSS стратификации (MIPSS — Mutation-Based Prognostic Scoring System), дополненный данными тестирования генов JAK2, MPL, CALR, ASXL1, SRSF2 [19]. Tefferi с соавт. также показали состоятельность прогностической модели, базирующейся только на данных молекулярного и цитогенетического анализа. Genetics-Based Prognostic Scoring System (GPSS), учитывающая данные возраста, кариотип, тип/отсутствие ДМ, ASXL1 и SRSF2-статус, позволила стратифицировать пациентов в группы риска, значимо отли-
чающиеся по ОВ и выживаемости без бластной трансфомации [20]. MIPSS и GIPSS требуют верификации на различных выборках пациентов.
По результатам нашего исследования, наиболее мощным прогностическим потенциалом обладали характеристики «наличие ДМ/АБХЫ статус», «кариотип/АБХЬ1 статус». Анализ ОВ с учетом данных характеристик позволил сделать ряд наблюдений. Наличие мутации в гене АБХЬ1 коррелировало со снижением ОВ в группе тройных негативных пациентов: 0,9 года против 3,6 года, р = 0,007. Значимых отличий в выживаемости пациентов с ДМ, но различным АБХЬ1 -статусом, не выявлено (р = 0,788). Выживаемость ТН АБХЬ1~ больных была короче не только, чем в ДМ+АБХЬГ (р = 0,024), но и ДМ+АБХЬ+(р = 0,044) группе, т. е. тройной негативный статус даже при отсутствии дополнительных молекулярных дефектов гена АБХЬ1 является неблагоприятным фактором для ОВ.
Стоит подчеркнуть, что по результатам одно-параметрического анализа, только терминирующие мутации в гене АБХЬ1 оказывали влияние на ОВ. Негативный эффект терминирующих мутаций можно объяснить нарушением функ-
циональной организации белка, участвующего в процессах репрессии транскрипции. Белок ASXL1 взаимодействует с комплексами молекул, модифицирующих хроматин, посредством C-концевого PHD домена (plant homeo domen). При нонсенс мутациях и мутациях сдвига рамки считывания, наблюдаемых в 12 экзоне гена, происходит полная потеря PHD домена, образованного 1506-1541 кодонами [21]. Миссенс мутации, обнаруживаемые за пределами данного участка, не влияют на сохранность связывающего домена.
Совместный анализ кариотипа и ASXL1 статуса показал, что выживаемость пациентов с наличием любого из параметров — кариотипа высокого риска и/или терминирующих мутаций гена ASXL1 — значимо хуже, чем у ASXL1~ пациентов с кариотипом низкого риска. Отсутствие статистически значимых отличий между ОВ ASXL1+ пациентов с кариотипом низкого риска и ASXL1~ пациентов с кариотипом высокого риска указывает на то, что неблагоприятные цитогенетиче-ские и молекулярные дефекты в равной степени могут ухудшать прогноз при ПМФ.
Таким образом, на основании данных молеку-лярно-генетического исследования могут быть
выделены группы риска: крайне неблагоприятная — при отсутствии драйверной мутации и наличии мутации в гене ASXL1, неблагоприятная — при отсутствии мутаций в генах JAK2, CALR, MPL, ASXL1, промежуточная — при наличии драйверной мутации в сочетании с мутацией ASXL1, благоприятная — при наличии драйверной мутации и отсутствии мутации в гене ASXL1. Одновременный учет кариотипа и ASXL1 статуса позволяет отнести пациентов к группе высокого риска при наличии хотя бы одного из параметров.
Заключение. Кариотип высокого риска, отсутствие драйверной мутации, дефекты гена ASXL1, приводящие к остановке трансляции, являются факторами неблагоприятного прогноза при ПМФ. Общая выживаемость больных варьирует в зависимости от сочетания данных факторов. Комплексный анализ результатов цитогене-тического и молекулярно-генетического исследований может послужить шагом к разработке новых, более полных моделей прогнозирования, учитывающих не только клинико-гематологиче-ские характеристики заболевания, но и биологические свойства опухолевого клона.
ЛИТЕРАТУРА
1. Абдулкадыров К. М., Шуваев В. А., Мартынкевич И. С. Первичный миелофиброз: собственный опыт и новое в диагностике и лечении. // Онкогематология. — 2015. Т. 10. — № 2. — С. 25-35.
2. Абдулкадыров К. М., Шуваев В. А., Мартынкевич И. С. Миелопролиферативные новообразования. — Москва: Литтерра, 2016. — 304 с.
3. Полушкина Л. Б., Мартынкевич И. С., Шуваев В. А. и др. Молекулярно-генетические и цитогенетические особенности первичного миелофиброза. // Гены и Клетки. — 2016. — Т. 11. — № 3. — С. 113-122.
4. Tefferi A. Pathogenesis of myelofibrosis with myeloid metaplasia. // J ClinOncol. — 2005. — № 23. — Р. 8520-30.
5. Hussein K., Van Dyke D. L., Tefferi A. Conventional cytogenetics in myelofibrosis: literature review and discussion. // European Journal of Haematology. — 2009. — № 82. — Р. 329-338.
6. Singh N. R. Genomic diversity in myeloproliferative neoplasms: focus on myelofibrosis. // Transl Pediatr. — 2015. — Vol. 4. — № 2. — Р. 107-115.
7. Tefferi A., Pardanani A. Myeloproliferative Neoplasms. A Contemporary Review. // JAMA Oncology. — 2015. — Vol. 1. — № 1. — Р. 97-105.
8. Milosevic J. D., Kralovics R. Genetic and epigenetic alterations of myeloproliferative disorders. // Int J Hema-tol. — 2013. — № 97. — Р. 183-197.
9. Harutyunyan A., Klampfl T., Cazzola M., Kralovics R. p53 lesions in leukemic transformation. // N Engl J Med. — 2011. — Vol. 364. — № 5 — Р. 488-490.
10. Jager R., Gisslinger H., Passamonti F. et al. Deletions of the transcription factor Ikaros in myeloproliferative neoplasms. // Leukemia. — 2010. — Vol. 24 — № 7. — Р. 1290-1298.
11. Tefferi A., Mesa R. A., Schroeder G. et al. Cytogenetic findings and their clinical relevance in myelofibrosis with myeloid metaplasia. // Br J Haematol — 2001. — № 113. — Р. 763-771.
12. Rumi E., Pietra D., Pascutto C. et al. Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR, or MPL in primary myelofibrosis. // Blood. — 2014. — Vol. 124. — № 7. — Р. 1062-1069.
13. Vannucchi A. M., Lasho T. L., Guglielmelli P. et al. Mutations and prognosis in primary myelofibrosis. // Leukemia. — 2013. — Vol. 27. — № 9. — Р. 1861-1869.
14. Tefferi A., Lasho T. L., Finke C. et al. Type 1 vs type 2 calreticulin mutations in primary myelofibrosis: differences in phenotype and prognostic impact. // Leukemia. — 2014. — Vol. 28. — № 7. — P. 1568-70.
15. Arber D. A., Orazi A., Hasserjian R., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. // Blood. — 2016. — Vol. 127. — № 20. — P. 2391-2405.
16. Gangat N., Caramazza D., Vaidya R., et al. DIPSS Plus: A Refined Dynamic International Prognostic Scoring System for Primary Myelofibrosis That Incorporates Prognostic Information From Karyotype, Platelet Count, and Transfusion Status. // Journal of Clinical Oncology. — 2011. — Vol. 29. — № 4. — P. 392-397.
17. Campregher P. V., Helman R., Pereira W. O. et al. The Presence of ASXL1 Mutations As Well As a Total Number of Myeloid Driver Mutations Higher Than Two Is Strongly Associated with the Diagnosis of Primary Myelofibrosis As Opposed to Essential Thrombocythemia. // Blood — 2014. —№ 124. — P. 4595.
18. Tefferi A., Guglielmelli P., Lasho T. L., et al. CALR and ASXL1 mutations-based molecular prognostication in primary myelofibrosis: an international study of 570 patients. // Leukemia. — 2014. — Vol. 28. — № 7. — P. 1494-1500.
19. Vannucchi A., Guglielmelli P., Rotunno G., et al. Mutation-enhanced international prognostic scoring system (MIPSS) for primary myelofibrosis: an AGIMM&IWG-MRT project. // Blood. — 2014. — Vol. 124. — № 21. — P. 405.
20. Tefferi A., Guglielmelli P., Finke C. M., et al. Integration of mutations and karyotype towards a genetics-based prognostic scoring system (GPSS) for primary myelofibrosis. // Blood. — 2014. — Vol. 124. — № 21. — P. 406.
21. Argote J. A., Dasanu C. ASXL1 mutations in myeloid neoplasms: pathogenetic considerations, impact on clinical outcomes and survival, Current Medical Research and Opinion. // doi: 10.1080/03007995.2016.1276896
